苯丙氨酸氨解酶基因

苯丙氨酸氨解酶基因 在大肠杆菌 BL21DE3中的表达
苯丙氨酸氨解酶简介
• 缩写PAL。是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式 桂皮酸的酶。EC．4．3．1．5。是1961年J．Koukol， E．Conn在大麦中发现的。存在于高等植物、酵母、菌类 的可溶性部分。推测分子量为30万。这是一个可把苯丙氨 酸用于酚类化合物合成的酶。在很多情况下，其反应成为 酚类化合物合成的有步骤的速率阶段。在组织中的活性可 随外界因素而发生显著变化，用光照，病伤害，植物激素 处理等会使活性显著增加。另外有时还受光敏色素所支配。 在多数情况下，在组织中活性增加的同时，酶发生失活作 用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为， 这种失活是与类蛋白质物质作用有关。此外也已指出有非 活性的酶的存在。
获取工程菌的过程
结果分析
• 在BL21DE3宿主菌中，它既能应用异丙基硫代-β-D-半乳 糖苷(IPTG)使lac阻遏蛋白失活，从而使T7启动子脱阻遏 并诱导T7聚合酶，提高表达目的基因水平，同时，由于宿 主菌不表达OmpT和Lon蛋白酶，因此表达产物又比较稳 定，不会被宿主菌蛋白水解酶所降解。我们建株的工程菌， 经超声破碎后的粗提物，按Zucker建立的苯丙氨酸氨解酶 活性测定方法，测得的酶比活性为461.7 nmol.g-1.min-1。 该质粒还具有表达His6-Tag结构，便于应用Ni柱亲和层析， 快速纯化，经凝血酶酶切，有可能获得具有活性的天然 PAL。为今后PAL的基础研究（如高等植物中的UV反应， 创伤防御，氧化应激，凋亡等）及临床治疗（如苯丙酮尿 症）奠定了基础。
获取工程菌的过程
• 根据rPAL-1-cDNA及pET-28c酶切图谱，选用BamH I酶切 重组质粒，鉴定插入方向。并用测序引物对重组质粒 PET-28c-rPAL-1-cDNA进行测序，进一步确定其插入方 向及阅读框架。
获取工程菌的过程
• 工程菌的诱导表达及SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析： • 挑取正向插入克隆，接种于含50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基中，37℃振荡培养16 h,以1∶200比例接种于新 鲜的含抗生素的培养基中, 37℃振荡培养2.5 h进行扩增,取 100 mL菌液作为诱导前对照。然后加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡 培养中诱导工程菌表达,分别于诱导1,3,5,7 h四时间点取样, 以BL21DE3及经pET-28c空载体转化的BL21DE3为对照， 在超声裂解液中将大肠杆菌超声破碎，200 W 10 s，停10 s，重复10次。4 ℃ 15 000 r/min离心15 min，上清液和 沉淀分别进行10% SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)， 200 V，30 min，考马斯亮兰染色，结果经Kodak digital scienceTM电泳扫描仪分析确定其分子量及蛋白表达量。
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• 筛选与鉴定 • 用EcoR I酶将pET-28c从多克隆位点处切开，在其5' 端用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）脱去磷酸，纯化后溶于双 蒸水中备用。 • 用EcoR I酶切质粒pUC19-rPAL-1-cDNA，通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离（80V 4 h），切取2.5kb的rPAL-1cDNA条带，用透析袋法回收，经酚、氯仿抽提，乙醇沉 淀纯化，溶于双蒸水。 • 按文献描述步骤用T4DNA连接酶将2.5kb rPAL-1cDNA与5'端脱磷酸之线性pET-28c连接重组成表达质粒， 连接时取插入片段DNA与pET-28c DNA的摩尔比为3∶1。 连接产物转化感受态大肠杆菌BL21DE3, 在含有卡那霉素 的LB平板上,筛选出阳性克隆。
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• 目的基因的获取
获取工程菌的过程
• 二、重组子的制备及酶切分析： • rPAL-1-cDNA大小为2519 bp，pET-28c大小为5367 bp，通过T4 DNA连接酶连接后的重组表达质粒应为7886 bp。挑取四个重组阳性克隆，经EcoR I酶切图谱鉴定，所 得片段符合预计大小（见图2，lane2, 4, 6, 8）。由于应 用单酶切插入目的基因所获得的重组质粒，存在着正反两 种插入方向。为了获得所需的正向插入重组克隆，经查阅 GenBank, 在对rPAL-1-cDNA及pET-28c质粒的酶切图谱 分析后，选用各自都只有一个酶切位点并能显著区分正反 插入方向的BamH I进行酶切鉴定。根据理论分析，经 BamH I酶切后可能出现的二种情况如下：正向插入生成 的二个片段大小预计应为337bp和7549 bp，反向插入分 别为2194 bp和5692 bp（见图3）。四个重组克隆的 BamH I酶切图谱见图2，lane 1, 3, 5, 7。由此可知，获得 了3个正向插入重组克隆和1个反向插入重组克隆。
• 苯丙氨酸氨解酶(L-phenylalanine ammonia lyase, PAL)广 泛分布于植物和某些真菌中，它可使苯丙氨酸降解为无毒 的苯丙烯酸。在动物实验中证明，口服该酶可降低实验性 苯丙酮尿症动物血清中异常增高的苯丙氨酸浓度，已有学 者研究将该酶固化后，口服用于治疗苯丙酮尿症。尽管 PAL在临床治疗应用中具有良好的前景，但无法从真菌和 高等植物细胞中大量提取PAL，为此，试图应用基因工程 技术探索从大肠杆菌中获取大量廉价的PAL，藉以通过口 服在肠道内消除苯丙氨酸，或用于生产廉价的无苯丙氨酸 食物，达到治疗苯丙酮尿症的目的。
获取工程菌的过程
• • 三、重组质粒测序： 重组表达质粒测序结果如图4所示，与设计时预期的 完全相同。说明该重组质粒已正向插入目的基因，对阅读 框架分析，完全肯定了该质粒能正确表达rPAL-1-cDNA。
获取工程菌的过程
• 重组子的转化 • 按文献，将质粒pUC19-rPAL-1-cDNA转化大肠杆菌DH5α， 并加以扩增。根据文献在水稻苯丙氨酸氨解酶基因 （GenBank/EMBL, Accession number: x16099）ATG下 游131-112碱基段设计测序引物5' TGGATCTTGACCAGCGGCT 3'，对pUC19-rPAL-1cDNA质粒进行反向测序。测序按Perkin Elmer公司推荐 的BigDye标记终止碱基双脱氧法在ABI PrismTM310自动 序列分析仪上进行。根据测序结果，在表达质粒pET-28 系列中，选择与之相匹配的表达载体。
结果
• 表达质粒pET-28系列的选择： • 应用测序引物对质粒pUC19-rPAL-1-cDNA进行部分 测序，结果见图1。从rPAL-1-cDNA序列中首先找出翻译 起始密码ATG，根据3个碱基编码1个氨基酸的原则，由此 往上推算可知，要求表达载体在EcoR I接头处的三联体结 构必需具备与之相匹配的ATT框架。对比大肠杆菌表达质 粒pET-28a, b, c部分序列，发现在重组后，能保持正确阅 读框架，而不发生移码的只有pET-28c符合要求。若 rPAL-1-cDNA正向插入pET-28c 多克隆位点上的EcoR I位 点，预期重组后的表达质粒部分序列应如图1所示。
预期目标
• 遗传性缺乏苯丙氨酸羟化酶所致的苯丙酮尿症是 人类常见的先天性苯丙氨酸代谢缺陷病，是引起 先天性智力降低的主要原因之一。为防止痴呆的 发生，在出生后至发育期必需服用不含或含极少 量苯丙氨酸的合成食物，费用十பைடு நூலகம்昂贵。用酶在 肠道内/外将消化后的苯丙氨酸降解，是一个有希 望的取代途径。
预期目标
获取工程菌的过程
• 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及扫描分析： • 以大肠杆菌BL21DE3和经pET-28c质粒转化的 BL21DE3为对照，与经pET-28c-rPAL-1-cDNA 转化的 BL21DE3在同等条件下按照方法六项中描述的方法进行 扩增、诱导表达、裂解和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 结果如图5。工程菌在分子量66.2 kD和97.4 kD间，出现 明显的表达条带，表达的目的蛋白主要存在于沉淀中（以 包涵体形式存在），而对照组BL21DE3及经pET-28c质粒 转化的BL21DE3都没有出现。IPTG诱导5和7 h时蛋白表 达量最高，表达产物His-rPAL的分子量为78.6 kD，与文 献报导一致。IPTG诱导1,3,5,7 h蛋白表达量占菌体总蛋白 量的百分数分别为21.40%, 30.60%, 35.40%, 35.43%。