反义核酸药物剖析共64页
第二十四章反义药物
反义核酸技术的历史
Itoh和Tomizawa（1980）在研究ColE1的实验中， 最先发现自然界存在“天然”反义RNA。
上述发现不仅一个角度证实了“天然”的DNA双螺旋结构
模型中反义链在转录过程中的指导作用，而且它就像掀
去一层又一层薄薄的面纱，展示给人们一个朦胧神奇、
奥妙无穷的新的研究领域，从而曾强了人们深入研究反
返回
反义核酸技术
核酶（ribozyme）是具有酶活性的RNA，主要参加
RNA的加工与成熟。
天然核酶可分为四类：
①异体催化剪切型，如RNase P；
②自主催化剪切型，如植物类病毒，拟病毒和卫 星RNA；
③第一组内含子自我剪接型；如四膜虫大核26S rRNA；
④第二组内含子剪接型。
列形成双链，阻碍mRNA前体的加帽、拼接、加poly A尾及向胞质
的转运。
返回
反义核酸的作用靶点
抑制转录后mRNA的剪接和成熟
如5’端加帽、3’端加尾（poly A）和pre-RNA的剪接等。
阻止 mRNA由细胞核向细胞质运输
寡核苷酸可进入细胞核，在核内与靶mRNA或pre-mRNA结合， 阻止它们由细胞核向细胞质的运输。
性，增加对核酸酶的抗性。
溶解性
由于ASON带负电荷且有较强的亲水性，因此不易与带同
样电荷的靶细胞接触，更不易透过由磷酯质双分子层构
成的细胞膜进入细胞内。
返回
化学修饰
碱基修饰
在胞嘧啶的5号位点进行甲基化是最常用的碱基修饰手 法
骨架修饰
核苷酸通过磷酸二酯键连接成核酸或ASODN，磷酸二 酯键是受核酸酶作用（水解）的敏感位点，在体内生 理条件下半衰期仅数分钟。
反义核酸的研究进展
vitro1J C lin Pharm Sci,1996,5(2):8816 郑俊民主编1经皮给药新剂型1北京:人民卫生出版社,19971 78～8617 李娅芳,邓英杰,刘淑琴,等1透皮吸收制剂研究进展1中国药学杂志,1997,32(1):318 陈小平1电致孔法促进药物的透皮吸收1国外医学・药学分册, 1999,26(4):22219 P rausnitz M R,Edel m an E R,Gi m m J A,et al.T randerm al deliv2ery of heparin byeletropo rati on.B i o techno logy,1995,13(11): 120520 M ichealM,V ijeyalak shm i G,L i po som e.A selective drug delivery system fo r the top ical route of adm inistrati on:gelclo sago fo rm.J Pharm Pharm aco l,1982,34(7):47221 朱于村1促进透皮给药的物理和生化方法1国外医学・药学分册,1993,10(6):357(收稿日期:2000212226)反义核酸的研究进展赵 倩(天津医科大学药学院 天津300203) 摘 要 从反义核酸的作用机理、药理作用及化学修饰等方面介绍当前在这一领域的最新研究成果。
反义核酸作为一种生化药物,在治疗病毒感染性疾病、心血管疾病以及肿瘤、艾滋病和遗传性疾病方面,与传统药物相比更具有选择性和高效低毒。
关键词 反义核酸 作用机理 药理作用 化学修饰 中图分类号:Q52 文献标识码:A 文章编号:1006-5687(2001)02-0007-04 随着分子生物学的飞速发展以及对控制生物体性质与功能的基因及作用机制认识的提高,人类有可能在基因水平上阻断或控制某些异常基因或感染病毒的表达,从而达到控制疾病的目的。
第16章 反义核酸类药物
第一个反义药物——福米韦生
5 适应证和禁忌证
福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效 果或有禁忌的病人；禁用于2～4周内使用西多福韦（cidofovir）治疗 的病人，以免增加发生眼内炎的危险性 6 与治疗CMV视网膜炎的其他药物比较
更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMV抑制剂，而非杀死剂；具有交 叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术 以及视网膜剥脱发生率高（28%）使应用受限 福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而 轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法
硫代磷酸化修饰
主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎
第一个反义药物——福米韦生
1 药ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ学
1.1 抗病毒作用机制
主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNA特异序列互补结合， 被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活
抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据
核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的
一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
ASGP-PL-反义RNA复合物 → 肝细胞表面ASGP受体识别→ 吞噬 → 释放 → 发挥作用
优点：专一性强，抗降解能力强
最新反义核酸技术及应用PPT课件
主要内容
1. 反义核酸技术的作用机制 2. 反义核酸技术的实验研究 3. 反义核酸技术的应用前景
AS-ODN与靶蛋白连接，抑制蛋白质的加工、 修饰和功能的表达。
5.反义核酸的种类 根据作用不同的分类：
与特定的表达载体（病毒、质粒）连接，导入 靶细胞直接转录反义RNA，与相应mRNA形成 双链，阻断翻译。 以胞吞的方式进入细胞，与相应mRNA结合发 挥作用。
肝癌：朱金海等采用增殖细胞核抗原和血管内 皮生长因子的反义核苷酸同时作用于裸鼠人肝 癌模型肝癌生长，发现其治疗效果优于单种反 义核酸。
对膀胱癌的治疗：Hatta通过对膀胱内灌注针 对Ha-ras mRNA 的AS-ODN，抑制肿瘤生长。 对卵巢癌的治疗：Waston采用互补于IL-6第二 外显子编码区的AS-ODN，阻断内源性IL-6的 产生，抑制了卵巢癌CAOV3OVCAR3和 OC436增殖。
写出下列动词的单数第三人称形式
1. swims 2. draws 3. makes 4. runs 5. carries 6.leaves 7. arrives 8. watches 9.cleans 10. stays
动词的第三人称单数规则 当主语是第三人称（ she、he、it）或名词时，谓语动词要用单数形 式。一般情况下动词的第三人称单数形式都是 直接加s
2.抗病毒的治疗
对HIV、肝炎、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒 等治疗的初步应用。
丙型肝炎：王晓红等将HCV5’NCR-C基因与荧 光素酶基因的融合基因片段插入pCI-neo表达 载体，通过PCR扩增、酶切反应及荧光素酶瞬 间表达活性鉴定，获得稳定表达质粒pHCVneo4,转染HepG2细胞后，经筛选，获高表达 细胞株，通过脂质体介导，将3条HCV调控基 因的反义核酸导入该细胞株，发现，它们均具 有特异性的剂量依赖抑制活性。
反义核酸药物
反义核酸药物的作用原理反义核酸目前有三种来源：一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸antisenseoligodeoxyncleotides，AON，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰AON和硫代磷酸酯化PS、磷酸二酯化PO和甲基化等修饰AON二类，其中以PSAON应用最广泛。
ANO设计合成简单，只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可，而对基因的读码框无要求;二是更具有实用价值的人工表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体[3]，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义RNA分子;三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。
的作用特点反义核酸作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点。
1高度特异性：通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA，犹如“生物导弹”。
2高生物活性、丰富的信息量;反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷尽。
3高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译。
4最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计。
5低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。
的在寄生虫学中的应用反义核酸技术的飞速发展和成熟，使其逐渐渗透并应用到寄生虫学领域，丰富和发展了寄生虫病的基因治疗策略。
反义核酸技术在抗寄生虫病研究的应用主要集中于原虫类，如疟原虫、锥虫和利什曼原虫等，而且反义核酸中又以AON方面的报道最多。
下面着重就AON在寄生虫方面的研究应用作用一简要阐述。
⒊1 疟原虫疟原虫嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即无从头合成途径，依靠补救合成途径利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷。
疟原虫的二氢叶酸还原酶dihydrofolate reductase，DHFR和胸苷酸合酶thymidylatesynthase，TS结合形成双功能蛋白DHFR-TS，这对于维持疟原虫四氢叶酸水平和DNA合成极为重要[14]，此酶也是疟原虫脱氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶。
反义核酸药物剖析
二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄 - 环结构，
空间构象障碍迫使 RNA 聚合酶脱离 DNA 模板，停止转录。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译； 2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始； 3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的
导入方法
1、RNA病毒感染;
2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外 ,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加 as
ＯＮ到达靶细胞的能力。
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′
连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别
磷酸二酯键。 α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。
1’位取代、2’位取代:
指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点 ,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸 (phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
反义核酸药物剖析
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
Thank youFra bibliotek