圆二色光谱实验报告
生物分析 圆二色光谱
圆二色光谱分析法引言五十年代初，生物学研究从宏观领域深入到微观领域，开创了分子生物学的新时代。
随着研究的不断深入和发展，生物学已发展成最活跃的学科之一。
手性(Chirality)是物质结构中的重要特征．即具有不能重叠的三维镜像对映异构体，它们的分子式完全相同，但其中原子或原子基团在空间的配置不同，互为镜像。
凡手性分子都具有光学活性，即可使偏振光的振动面发生旋转。
生物基础分子一般都具有手性，也都具有光学活性。
在自然界中，氨基酸有L型和D型两种对映异构体，组成蛋白质的20种氨基酸，除最简单的甘氨酸不具有手性外，其余都是L型的[1]。
手性分子都具有光学活性。
当单色左旋与右旋的圆偏振光通过某一种手性样品时，该样品对左、右旋圆偏振光的吸收不同，这叫做圆二色性(Circular Dichroism)。
其差值△A=△A L-△A R称为圆二色值，按波长扫描就得到了圆二色谱(CD谱)。
CD谱是特殊的吸收谱，它比一般的吸收谱弱几个量级，但由于它对分子结构十分敏感，因此近十几年来，CD已成为研究分子构型(象)和分子间相互作用的最重要的光谱实验之一。
利用CD研究生物大分子和药物分子，具有重要的科学意义和实用价值[2,3]。
一、蛋白质的圆二色性蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子。
蛋白质一般有一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次[4-6]。
在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。
当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。
圆二色性的大小常用摩尔消光系数差△ (M-1 ·cm-1 )来度量。
蛋白质的CD光谱一般分为两个波长范围，即178—250 nm为远紫外区CD光谱，250—320 nm为近紫外区CD光谱, 具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。
实验四+圆二色光谱_CD_+2014.11.3
例 芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，
在近紫外区表现出CD信号
苯丙氨酸（ phenylalanine， Phe）：255、261和268nm附近； 酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右； 色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近； 二硫键的变化反映在整个近紫外区。
二、基本原理
圆二色性可用吸收率差和椭圆度来表示：
吸收(率)差 ：Δε = εL - εR ；ΔA = AL – AR
由于 Δε 绝对值很小，常用摩尔椭圆度 [θ]来 代替，二者的关系是：
椭圆度θ，摩尔椭圆度[θ]
θ=2.303(AL – AR)/4 [θ] = 3298(εL - εR)≈3300 (εL - εR)
样品浓度：
•最好预先做UV-VIS光谱，检查吸收波段范围； •CD光谱与紫外光谱有同样的要求，最佳信噪比 范围是紫外吸收为0.6-1.2，通常吸收值超过2 时，很难得到合适的CD数据。
五、实验要点
样品池 •样品池：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆 二色性。 •光程：0.01cm-1cm，为了降低溶剂影响，一般提高 样品浓度，用短光程。
❖ 当光学活性化合物对光没有特征 吸收时，在谱图中仅为一条近似 水平的直线。
❖ 当光学活性化合物对光存在特征 吸收时，通常有两种情况：
当 εL > εR 时，得到一个正性 的圆二色光谱曲线；
当 εL < εR 时，得到一个负性的 圆二色光谱曲线。
三、CD光谱的应用
意义：
•CD是一种特殊的吸收谱，它对手性分子的构象十 分敏感；
• 使用缓冲盐溶液要扣除其背景
•许多有机物和络合物都具有手性，它们的对映异构 体物理化学性质(熔点、沸点、旋光度、溶解度、分 子式等)几乎完全相同，但它们的旋光方向相反，生 理作用大不相同；
圆二色谱总结
圆二色谱实验总结圆二色谱是用来表征蛋白的二级结构和三级结构的常用方法，在界面课题组主要用来表征肽自组装体的二级结构；通常对于三级结构不予考虑。
这一方法的实验操作容易，与一般的光谱测量相同，但是形成的机制比较复杂。
在此只能说我自己理解了的部分，对于不理解的部分还需要继续查文献进行了解。
1圆二色谱的原理名称中虽有“色谱”两字，但是这一测量方法实际上是一光谱法，光谱法对应的即为电子的跃迁行为。
同时，光谱法中必然存在的定量关系就是朗伯-比尔定律，圆二色谱的方法就是建立在这一光吸收过程上的光谱方法。
1.1预备知识需要推演圆二色谱的原理用到的工具有数学工具和物理知识两个方面，分别叙述如下。
1.1.1 数学工具在推演圆二色谱的数学表达形式时，需要用到一些数学知识，主要有圆的普通方程及参数方程、椭圆的普通方程及参数方程，相关的三角函数知识，这些数学知识基本都在高中阶段学过。
首先说明圆的普通方程和参数方程：圆的普通方程即为仅对圆上点的坐标关系进行描述的方程。
圆上点的特点是对固定点（即圆心）的距离相等，设圆心的坐标为(x0, y0)半径为r，则圆的普通方程为√(x−x0)2+(y−y0)2=r通常用的是化简的形式，为讨论方便，将圆心设为原点，即得到x2+y2=r2利用同角三角函数关系，即sin²θ+cos²θ=1可将上述方程参数化，得到圆的参数方程{y=r sinθx=r cosθ使用同样的思路，可以得到椭圆的参数方程，即{y=b sinθx=a cosθ消去参数后，得到椭圆的标准方程，即x2 a2+y2b2=1上述有关于椭圆的方程中均有a≠b。
1.2 物理预备知识关于物理的预备知识是最基本的波动光学的观点。
按照波动光学的观点，光是在空间中交替传播的电磁场，电场强度的方向与磁感应强度的方向垂直。
从能量分布的角度来说，光的能量被认为主要以电场的形式传播，因而通常也将光的电场强度矢量方向定义为光矢量方向。
圆二色谱
圆二色谱圆二色谱是一种特殊的吸收普，它对手性分子的构象十分敏感，因此它是最重要的光谱实验之一。
手性是物质结构中的重要特征，即具有不能重叠的三维镜像对映异构体，它们的分子式完全相同，但其中原子或原子基团在空间的配置不同，互为镜像。
凡手性分子都具有光学活性，即可使偏振光的振动面发生旋转。
许多有机物和络合物都具有手性，它们的对映异构体物理化学性质(熔点、沸点、旋光度、溶解度、分子式等)几乎完全相同，但它们的旋光方向相反，生理作用大不相同。
生物基础分子一般都具有手性，也都具有光学活性。
在对生物分子手性的研究中，发现了令人惊异至今不解的对称性破缺现象，那就是在自然界中，氨基酸有L型和D型两种对映异构体，天然糖也有L糖和D糖两种糖。
但在生物体中，组成蛋白质的20种氨基酸，除最简单的甘氨酸不具有手性外，其余都是L型的，而生物体核酸中的糖环则都是D型的。
生物体中这种对称性破缺现象是有特殊意义的自然现象。
手性分子都具有光学活性。
当单色左旋与右旋的圆偏振光通过某一种手性样品时，该样品对左、右旋圆偏振光的吸收不同，这叫做圆二色性。
其差值△A=△AL一△AR称为圆二色值，按波长扫描就得到了圆二色谱(CD谱)。
利用法拉第效应，在外加磁场作用下，许多原来没有光学活性的物质也具有了光学活性，原来可测出CD谱的在磁场中CD信号将增大几个量级。
这种条件下即可测得磁圆二色谱(MCD谱)。
CD和MCD是特殊的吸收谱，它们比一般的吸收谱弱几个量级，但由于它们对分子结构十分敏感，因此近十几年来，CD和MCD 已成为研究分子构型和分子间相互作用的最重要的光谱实验之一。
利用CD和MCD 研究生物大分子和药物分子，具有重要的科学意义和实用价值。
基本定义和原理一束平面偏振光通过光学活性分子后，由于左、右圆偏振光的折射率不同，偏振面将旋转一定的角度，这种现象称为旋光，偏振面旋转的角度称为旋光度。
朝光源看，偏振面按顺时针方向旋转的，称为右旋，用“+”号表示；偏振面按逆时针方向旋转的，称为左旋，用“-”号表示。
圆二色谱Circular_CD
主要内容
CD原理
蛋白质CD谱
CD实验要点
CD原理
圆二色性(circular dichroism, CD)
当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时， 由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同 的两种构型，故它们对平面偏振光所分解成的 右旋和左旋圆偏振光吸收不同，从而产生圆二 色性．
圆二色性的表示
椭圆度，摩尔椭圆度[] =2.303(AL – AR)/4 [] = 3298(L - R)3300 (L - R) 在蛋白质研究中， 常用平均残基摩尔椭圆度
圆二色仪原理
蛋白质的CD谱
蛋白质的光学活性
The peptide bond is inherently asymmetric & is always optically active
构象
确定蛋白质构象最准确的方法是x-射线晶体衍 射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质 来说，得到所需的晶体结构较为困难。二维、 多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白 质的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算 处理非常复杂。 圆二色光谱：研究稀溶液中蛋白质构象，快速、 简单、较准确
CD is very useful for looking at membrane proteins
蛋白的三级结构
1976年，Levitt和Chothia曾在Nature上报道，规则蛋白质 的三级结构模型可分为4类 (1) 全α型，以仅α-螺旋结构为主，其分量大于40％ ，而 β-折叠的分量小于5％ (2) 全β型，以β-折叠这种结构为主，其分量大于40％ ，而 仅一螺旋的分量小于5％ ； (3) α+β型，α螺旋及β-叠折分量都大于15％ ，这两种结构 在空间上是分离的，且超过60％的折叠链是反平行排列； (4) α/β型， α-螺旋和B-折叠含量都大于15％ ，它们在空间 上是相间的，且超过60％的折叠链平行排列。
CD(圆二色)光谱的理论和实验
2 12 2 , 0 V12 r12 1 2 , 0 2 , , r12
N. Berova and K. Nakanishi, Circular Dichroism: Principles and Applications, Wiley-VCH, New York, 2nd ed., 2000 Exciton Chirality: Fundamentals and Frontiers, Monatsh. Chem., 2005, 136(3)
d 不含发色团的手性配体与在UVvis区有d 或 f 型跃迁的金属离子 络合，产生ICD活性。
S. Allenmark, Chirality, 2003, 15, 409-422 G. Ascoli, E. Domenici, C. Bertucci, Chirality, 2006, 18, 667-679 L. Di Bari, G. Pescitelli and P. Salvadori, Chem.–Eur. J., 2004, 10, 1205–1214
Ⅳ 超分子体系诱导CD（ICD）
a 手性客体分子与含发色团的非手性主体
O. Mcconnell, A. Bach, C. Balibar, et al., Chirality, 2007, 19,658 - 682
Ⅳ 超分子体系诱导CD（ICD）
b 带发色团的非手性小分子键合手 性生物高聚物主体中，如蛋白质， 多肽，寡核苷酸，低聚糖（环糊 精）。 c 几个客体分子同时结合在主体大 分子的不同活性位。
摩尔椭圆率
平均残基椭圆率
OR旋光现象
R
L
L R 在 旋 光 介 质 中
在 非 旋 光 介 质 中
圆二色谱报告
圆二色谱报告一、实验目的1. 圆二色性；2. 圆二色光谱的原理与应用；3. 圆二色光谱的相关拓展知识；4. 圆二色光谱的实验技术与操作。
二、实验原理圆二色性是手性分子在光学上表现的一种特性。
光可视为振动方向与传播方向垂直的电磁横波。
当光波的电矢量方向以一个固定的角速度以传播方向为轴心匀速旋转时，称之为圆偏振光。
根据圆偏振光电矢量旋转方向的不同，可以将其区分为左圆偏振光和右圆偏振光。
一束平面偏振光可以看成是由两个振幅和速度相同而螺旋前进方向相反的圆偏振光叠加而成（图1）。
两圆偏振光彼此对映，互为镜像。
当手性物质在偏振光的波长范围内存在吸收的时候，其对左右圆偏振光的吸收程度，也就是摩尔吸光系数，是不同的。
此时不但偏振光的偏振平面将被旋转，构成该偏振光的左右圆偏振光的振幅也将不再相等。
组成出射光的左右圆偏振光的电矢量和将沿一个椭圆轨迹移动，此时的出射光就是椭圆偏振光（图2）。
这种光学现象就称为手性物质所具有的圆二色性。
对于纯手性物质，其椭圆偏振光的椭圆度θ在特定溶剂、浓度、温度和光程下，在特定波长处为定值。
同时，在特定波长处的椭圆度θ与在该波长处对左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差(Δε)成正比。
将θ或Δε对波长作图，即得到圆二色光谱。
图1 右圆偏振光(a)、左圆偏振光(b)及平面偏振光示意图，水平箭头表示光的传播方向。
图2 (a) 平面偏振光的圆组分；(b) 平面偏振光的旋转与圆组分；(c) 椭圆偏振光的旋转与圆组分被吸收的情况。
其中，OB与OC分别表示右、左圆偏振光被吸收后的振幅，OD表示OB与OC的矢量和，θ表示椭圆偏振光的椭圆率角，tanθ= OE/OA″≈θ。
圆二色光谱的英文名称为Circular Dichroism，简称CD光谱。
其光谱仪的基本测试原理是——通过入射圆偏振光的波长变化，测定手性样品的左圆偏振光和右圆偏振光摩尔消光系数之差Δε。
由于CD光谱反映了光和分子间的能量交换，因而只能在有最大能量交换的共振波长范围内测。
实验4 圆二色光谱
实验二圆二色光谱一、实验目的1.学习和了解圆二色光谱的原理2.掌握圆二色光谱的的操作和分析二、实验原理1.圆偏振光振幅保持不变，而方向随前进方向随周期性变化，电场矢量绕绕传播方向螺旋前进2.圆二色性当光通过光学活性的物质时，介质对左右旋的圆偏振光的吸收率不同，二者的差值称为该物质的圆二色性（circular dichroism，简称CD）3.圆二色谱图光学活性物质对左右圆偏振光的吸收率之差为Δε=εL-εR是随入射偏振光的波长变化而变化的以Δε或有关量为纵坐标，波长为横坐标得到的谱图称为圆二色谱图,由于Δε绝对值很小，常用摩尔椭圆[θ]度来代替，二者的关系是[θ] =3300Δε当光学活性物质对光没有特性吸收时，在谱图中仅为一条近似的直线，当光学活性物质对光存在特征性吸收时通常有两种情况：当εL>εR得到一个正的圆二色谱图，当εL<εR得到一个负的圆二色谱图三、实验内容1.实验仪器及构造圆二色谱仪的基本构造：2.圆二色谱的应用蛋白质的圆二色性(1)由氨基酸通过肽键连接而成；(2)光学活性基团：肽键、芳香氨基酸残基、二硫桥键；(3)蛋白质有多个结构层次，相同的氨基酸序列，因蛋白质的折叠结构不同，基团的光学活性受到影响。
蛋白质的圆二色特征(1)光学活性基团及折叠结构；(2)250nm以下的光谱区，肽键的电子跃迁引起；(3)250~300nm光谱区，侧链芳香基团的电子跃迁引起；(4)300~700nm光谱区，蛋白质辅基等外在生色基团引起。
3.实验内容分别测定左旋和右旋苯丙氨酸的圆二色光谱三、实验结论可以通过圆二色光谱来分析化合物的手性结构。
从图中可知，左旋异构体对右旋的圆偏振光的吸收要比左旋圆偏振光大；同理，右旋异构体对左旋圆偏振光的吸收要比右旋圆偏振光要大。
故在分析位置样品时，若谱线峰值大于零，则为左旋，反之，则为左旋。
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圆二色光谱实验
一、实验目的
1、了解圆二色（CD）光谱的原理和使用方法。
2、学会用圆二色光谱检测蛋白质二级构象的基本原理和方法，并学会分析物质的手性。
3、了解圆二色光谱仪的基本构造，并学会使用。
二、实验原理
1.CD光谱的基本知识
圆二色性是研究分子立体结构和构象的有利手段。
在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。
电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。
平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。
圆二色性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM = εL –εR，其中，εL 和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。
如果εL –εR >0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL –εR<0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。
由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。
圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。
[θ]和ΔεM之间的关系式：[θ]=3300*Δε
圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。
一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：[θ] = 100θ/cl，ΔεM= θ/33cl 其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。
输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。
2.定性分析原理
圆二色光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。
圆二色谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单色器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单色器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、
右圆偏振光，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接受检测。
测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧（臭氧会腐蚀反射镜）。
光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同，其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 称为该物质的圆二色性(circular dichroism，简写作CD) 。
圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光，且只在发生吸收的波长处才能观察到。
所形成的椭圆的椭圆率θ为：θ= tg- 1（短轴/长轴）
根据Lambert-Beer 定律可证明椭圆率近似地为：θ= 0.576 lc (εl - εd) = 0.576 lcΔε 公式中l 为介质厚度，c 为光活性物质的浓度，εl 及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸收系数。
测量不同波长下的θ(或Δε) 值与波长λ之间的关系曲线，即圆二色光谱曲线。
在此光谱曲线中，如果所测定的物质没有特征吸收，则其Δε值很小，即得不到特征的圆二色光谱。
当εl >εd 时，得到的是一个正的圆二色光谱曲线,即被测物质为右旋；如果εl <εd ,则得到一个负的圆二色光谱曲线，即被测物质为左旋。
三、实验试剂和仪器
试剂：D/L-丙氨酸；蒸馏水
仪器：J-815CD Spectrometer；1cm比色皿*2
四、实验步骤
1.样品制备。
实验所需样品由助教提前制备好待用。
2.开机。
打开高纯氮气，通入光路。
打开计算机，进入操作界面，设置相关参数开启氙灯，等约30 min，待仪器充分预热后，方可使用。
3.测试
将光路径为1 cm的样品池放入样品室中，进入测试界面，输入测试参数：灵敏度1000 mdeg；扫面范围350-200 nm；扫速50 nm/min；响应时间2 s；响应波长宽度1.0 nm；扫描次数1次。
先测试蒸馏水背景，再分别测试配制的两份溶液。
4.关机
打开样品室，取出样品池；退出操作界面，关闭氙灯；关闭氮气，关闭主机电源；关闭计算机和打印机；清洗样品池。
五、数据处理
实验测定D\L丙氨酸得到数据，以CD（θ）为纵坐标，以波长为横坐标作图。
图1 D-丙氨酸的圆二色光谱图
图2 L-丙氨酸的圆二色光谱图
分析：丙氨酸D型和L型的圆二色光谱图有显著区别，L型的CD值大于零，而D 型的CD值小于零。
根据圆二色光谱图CD值的不同可以判断手性物质为左旋或右旋，区别异构体，也可以作为定性鉴定物质的依据。
另一方面，样品的吸光度则与浓度成正比相关，可作为定量分析。
六、思考与讨论
1.圆二色光谱在手性物质分析中的应用？
答：光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同，圆二色光谱图不同，右旋CD值大于零，左旋的CD值小于零，从而可以判断手性物质的旋光性。
不同的物质，特征吸收波长不同，通过对比圆二色光谱图可以进行定性分析。
蛋白质的具有圆二色性，不同的构象表现出不同的光谱性质，因此可以通过圆二色光谱法进行测定。
圆二色光谱是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。
2.如何让利用圆二色谱对蛋白质进行定量分析？
答：假设蛋白质在波长λ处的CD信号是蛋白质中各种二级结构组分的线性加
和，则有等式：。
假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同，则可利用已知二级结构的蛋白质或多肽的CD光谱作为参考数据，对未知蛋白质的二级结构进行拟合计算，能得出а-螺旋、β-折叠、β-转角、无规线团等结构所占的比例。