如何做原核表达——面面俱到Novagen产品
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。
虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。
此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
默克Novagen重组蛋白表达技术
德国默克分子生物学技术介绍原核系统重组蛋白表达技术何煜 Allen He2009.0921-Sep-09Page 1• 重组蛋白： 重组蛋白：• • • 抽提、纯化、去标签、鉴定 蛋白重折叠（复性） 高通量表达－纯化－分析 膜蛋白抽提，亚细胞分部收集 去除高丰度蛋白等 抑制剂混和物、蛋白定量、电洗脱、 透析/浓缩 、自动诱导发酵培养基等• 天然蛋白• •• 蛋白研究配套产品蛋白抽提、 蛋白抽提、纯化与分析——蛋白研究工具产品手册 蛋白研究工具产品手册第二版• •Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page2Strategies For Enhanced Solubility & Yield of Proteins Expressed in E.coli• Part 1: • Choosing a vector and cloning strategy • Part 2: • Selection of host and optimization of expression • Part 3: • Maximizing target protein recoveryNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page3Bacterial Protein ExpressionVectorHostGrowth conditionsNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page4Choices for Expression Plasmids• Level of control and expression • Antibiotic selection • Tag • Solubility • Protease recognition site • Copy numberNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page5Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page6关于载体的进展• 新的克隆方法： 新的克隆方法：更适合高通量操作• 新的启动子： 新的启动子：更高产， 更高产，多系统穿梭表达• 新的复制子： 新的复制子：多载体/多蛋白共表达 多载体 多蛋白共表达• 新的融合标签更好的纯化、可溶性、 更好的纯化、可溶性、检测• 新的蛋白酶切： 新的蛋白酶切：特异性更好， 特异性更好，更温和Novagen®21-Sep-09– pET · 蛋白研究专家Page7LIC cloning method1.Amplify target protein using any thermostable DNA polymerase and special primers2.Treat 50 min; PCR product, T4 DNA polymerase, and dATP3. 4. 5. Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09Anneal 5 min, then add EDTA Transform using NovaBlue GigaSingles™ Competent Cells PlatePage8Gateway® Nova DEST™ Vectors • • • • • •Universal cloning method based on bacteriophage lambda site-specific recombination. Rapid, efficient way to move DNA sequences into multiple systems for protein expression. Intermolecular DNA recombination is mediated by a mixture of lambda and E.coli-encoded recombination proteins (i.e. ClonaseTM II Enzyme Mix). Recombination occurs between specific attachment (att) sites on interacting DNA molecules. Recombination is conservative and requires no DNA synthesis. After recombination, att sites are hybrids of sequences donated by each parental vector.Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09Page9Gateway® Nova DEST™ Vectors•Two recombination reactions constitute basic Gateway® TechnologyattBGENEattBattPattPattLGENEattLattRattRccdB + CamccdB + Camusually attB-flanked PCR Product+pDONR Donor vectorBP ClonaseTM IIpENTR Entry clone+By-productattLGENEattLattRattRattBGENE LR ClonaseTM IIattBattPattPccdB + CamccdB + CampENTR Entry clone+pDEST Destination VectorpEXPR Expression clone+By-productNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page10Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page11Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page12Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page13Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page14Solubility tags• Secretion signal– pelB leader (22 amino acids) – ompT leader (20 amino acids)• Fusion to enzyme which promotes disulfide bonds– oxido reductase (208 amino acids, DsbA gene product) – disulfide isomerase (236 amino acid, DsbC gene product) – thioredoxin (109 amino acids)• Fusion to highly soluble protein– glutathione S-transferase (220 amino acids) – NusA gene product (495®amino acids)21-Sep-09Novagen – pET · 蛋白研究专家Page15Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page16University of Oklahoma School of Chemical Engineering and Materials Science Recombinant Protein Solubility PredictionSubmit Query ResetType (or cut and paste) your protein sequence below, click on the "Submit" button, and the solubility probability of your protein will be calculated. The statistical model predicts protein solubility assuming the protein is being overexpressed in Escherichia coli. If there are numbers, spaces, or other characters in your sequence, don't worry, they won't affect the calculation. For more information on the solubility model used here, see the references below. References: •R.G. Harrison. 2000. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations. 11:4-7. PDF file •Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. and R.G. Harrison. 1999. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 65(4):382-8. PubMed Abstract •Wilkinson, D.L. and R.G. Harrison. 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins Novagen® – pET · PubMed Abstract in Escherichia coli. Bio/Technology. 9: 443-448.蛋白研究专家21-Sep-09 Page17Improving solubility of IL-3Novagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page18Single plasmid for co-expressionNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page19Expression systems repliconsNovagen® – pET · 蛋白研究专家21-Sep-09 Page20。
原核表达技术及其在相关领域的应用
基因工程一般流程 人的细胞 提取 目的基因 与运载体DNA拼接 导入 细菌(含目的基因) 生产重组蛋白
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基因工程的操作工具
一. 核酸分子剪刀----限制性核酸内切酶 识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性 末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子，故 DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。识 别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)
原核表达技术及其在相关领域的应用
谨以此与朋友们交流学习
主要内容
1
基因工程及其应用 原核表达载体的构建 蛋白质的诱导与表达 常见问题以及解决办法
2
3
4
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基 因 工 程
基因工程：是用分离纯化或人 工合成的DNA在体外与载体DNA 结合，成为重组DNA，用以转 化宿主（细菌或其它细胞）， 筛选出能表达重组DNA的活细 胞，加以纯化、传代、扩增， 成为克隆，产生出人类所需要 的基因产物或改造、创造新的 生物类型。
双酶切
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连接反应
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重组体的转化 1. 重组体导入大肠杆菌 （1）氯化钙法 （2）电击法 （3）体外包装法 2. 重组体导入哺乳动物细胞 （1）磷酸钙共沉淀法 （2）脂质体介导法 （3）病毒感染法 （4）显微注射法
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酶切反应
大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。 当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性 降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体 积的10%。 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的 基因组DNA 会形成粘性 DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活 性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应 该尽量消化去除。 当要用两种或两种以上限制酶切割 DNA时，必须选择好通用缓冲液， 则两种酶才可同时切割。 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。 酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、乙 醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，都会不同程 度影响限制酶的活性。
原核表达个人秘籍
秘笈：表达前的分析比什么都重要表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。
表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。
原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。
当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。
原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。
做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。
首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。
前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。
同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。
当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。
如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。
比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。
根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。
在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：1、翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子2、GC含量表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
GC含量可以利用DNA ST AR、Vector NTI Suite等软件进行预测。
3、二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。
原核表达步骤
实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。
引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。
1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。
称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。
（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序：①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子.在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS，是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性.做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean)预测，Dnaman.在线网站预测(http：//www-bimas。
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之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。
Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。
已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。
Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。
pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。
T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。
T7噬菌体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。
它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。
并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。
T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含
有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。
从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。
如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。
根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。
一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。
为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：
1.与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione
S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。
2.转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。
3.插入一个定位到周质空间的信号序列。
不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。
如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。
以下是Novagen载体带有标记及抗性的列表：
生物通注：带（＋）指此载体利用f1作为复制起点
T7 Tag11 = 11 aa fusion tag T7 Tag260 = 260 aa fusion tag
signal seq. = signal sequence for potential periplasmic localization
I = internal tag N = N-terminal tag C = optional C-terminal tag
protease cleavage sites: T = thrombin E = enterokinase X = Factor Xa
LIC = ligation-independent cloning
以上载体都是采用抗生素抗性筛选，如果你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue 系列载体。
在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连
接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。
采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。
在设计PCR 扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。
通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。
一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。
而pETcoco 载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。
当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。
pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。
在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS 的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。
Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：
1.蛋白酶缺陷型
所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origami™ B, Rosetta™和Tuner™。
因此在纯化时可以保持蛋白
的稳定不被降解。
BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。
另外它的衍生
株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。
它的缺失，可以保证质粒的稳定。
2.保证所有细胞以同样量进行表达
Tuner™株及它的衍生株（Origami™ B和Rosetta™）是BL21菌株的lacY1
缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。
Lac
渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的，这样使蛋白表达浓度
可以随着IPTG浓度而改变。
通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。
一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。
3.二硫键形成与溶解性增强
二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，Origami B和Rosetta-gami™。
在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。
4.稀有密码子的补给
不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。
Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。
它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。
Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。
5.硒蛋氨酸标记
B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。
它在高度特异活性
35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。
我们常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB，LB因为其成本低廉所以应用最为广泛，而Novagen有提供特殊的培养基Overnight Express™ Autoinduction System。
使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG进行诱导，它可以直接进行过夜培养。
在这种培养基中含有痕量金属，可以满足合成蛋白时对金属的需求。
同时提供除了各种氨基酸，这其中蛋氨酸是另外加入的。
这样培养基可以满
足细菌生长的各种需求，使细菌密度更高；可以自动诱导无需自己加IPTG；使蛋白更加容易溶于培养基中；并且如果需要的话，可以对蛋氨酸进行硒标记。
同时Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet™-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA。
这些载体含有两个不同多克隆位点，可以插入两个外源蛋白基因，利用单独的T7 启动子, 乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。
载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。
Novagen的原核表达载体可以说是一面金字招牌，有许多不同系列的载体、菌株供选择；与原核表达的各种相关产品都一应俱全，比如：载体、菌株、培养基、检测表达的抗体、纯化产品等等。
原核表达的东西要说真是一天一夜都说不完，今天就先说到这里吧。
之后还将介绍Invitrogen、Qiagen等公司的各种载体及相关产品，请继续留意。
(生物通谢菲)
VVN打岔：本文部分内容来自Novagen的pET手册——一本非常值得推荐的手册，绝非简单的介绍产品，看完后你会对整个原核表达的诸多细节有深刻的理解，着实推荐每个已经在做表达或者即将开始做表达的同学认真学习，即使你不打算用pET 系列，你也会获益匪浅。
而且Merck生化小组已经将册子中文化印刷成册。
我将电子版中文手册放在新版生物通商城的表达系统的参考资料里，希望亲爱的何煜和陈文不会怒了吧，好东西值得分享哦。
VVN。