尼可地尔调控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3对猪冠状动脉微栓塞后心肌凋亡的影响

㊃基础研究㊃尼可地尔调控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3对猪冠状动脉微栓塞后心肌凋亡的影响郭卉,张龙岩,鄢华,宋丹,彭剑,苏晞,王江友摘要:目的 探讨尼可地尔调控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(c a s p a s e -3)对猪冠状动脉微栓塞(C M E )后心肌凋亡的影响㊂方法 选择12周龄健康小型猪15只,随机分为假手术组㊁C M E 组㊁尼可地尔组,每组5只㊂模型建立后12h 采用心脏超声检测心功能,T U N E L 染色检测心肌细胞凋亡,W e s t e r n b l o t 检测活化c a s pa s e -3表达水平㊂结果 与假手术组比较,C M E 组左心室舒张末期内径(L V E D D )明显升高,C M E 组和尼可地尔组L V E F ㊁左心室短轴缩短率(L V F S )及心输出量(C O )明显降低(P <0.05);与C M E 组比较,尼可地尔组L V E F ㊁L V F S 及C O 明显升高,L V E D D 明显降低(P <0.05)㊂与假手术组比较,C M E 组肌钙蛋白I 明显升高[(0.325ʃ0.128)n g/m l v s (0.058ʃ0.028)n g /m l ,P <0.05];与C M E 组比较,尼可地尔组肌钙蛋白I 明显降低[(0.156ʃ0.089)n g/m l v s (0.325ʃ0.128)n g /m l ,P <0.05]㊂与假手术组比较,C M E 组心肌细胞凋亡指数和活化c a s p a s e -3表达明显升高(P <0.05);与C M E 组比较,尼可地尔组心肌细胞凋亡指数和活化c a s p a s e -3表达明显降低(P <0.05)㊂结论 尼可地尔能够通过调控c a s pa s e -3降低猪C M E 后心肌凋亡㊂关键词:尼可地尔;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3;细胞凋亡;肌钙蛋白I ;冠状动脉血栓形成E f f e c t o f n i c o r a n d i l -r e g u l a t e d c a s p a s e -3o n m y o c a r d i a l a p o p t o s i s a f t e r c o r o n a r y mi c r o e m b o l i z a t i o n i n s w i n e G u o H u i ,Z h a n g L o n g y a n ,Y a n H u a ,S o n g D a n ,P e n g J i a n ,S u X i ,W a n g J i a n g yo u (D e p a r t m e n t o f C a r d i o l o g y ,A f f i l i a t e d W u h a n A s i a H e a r t D i s e a s e H o s p i t a l o f W u h a n U n i v e r s i t yo f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,W u h a n 430022,H u b e i P r o v i n c e ,C h i n a )A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e f f e c t o f n i c o r a n d i l -r e g u l a t e d c a s p a s e -3o n m y o c a r d i a l a p o p t o s i s a f t e r c o r o n a r y mi c r o e m b o l i z a t i o n (C M E )i n s w i n e .M e t h o d s F i f t e e n 12w e e k s o l d s w i n e s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o s h a m o p e r a t i o n g r o u p ,C M E g r o u p ,a n d n i c o r a n d i l g r o u p (5i n e a c h g r o u p ).T h e i r c a r d i a c f u n c t i o n w a s t e s t e d b y u l t r a s o n o g r a p h y ,t h e i r m y o c a r d i a l a p o pt o s i s w a s a s -s a y e d w i t h T U N E L s t a i n i n g ,e x p r e s s i o n o f a c t i v a t e d c a s p a s e -3w a s d e t e c t e d b y W e s t e r n b l o t a t 12h b e f o r e C M E m o d e l w a s e s t a b l i s h e d .R e s u l t s T h e L V E D D w a s s i g n i f i c a n t l y l o n ge r i n C M E g r o u p t h a n i n s h a m o p e r a t i o n g r o u p w h i l e t h e L V E F ,L V F S a n d C O w e r e s i g n if i c a n t l y lo w e r i n C M E g r o u p a n d n i c o r a n d i l g r o u p t h a n i n s h a m o p e r a t i o n g r o u p (P <0.05).T h e L V E F ,L V F S a n d C O w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r w h i l e t h e L V E D D w a s s i g n i f i c a n t l y s h o r t e r i n n i c o r a n d i l g r o u p th a n i n C M E g r o u p (P <0.05).T h e s e r u m t r o p o n i n I l e v e l w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n C M E g r o u pt h a n i n s h a m o p e r a t i o n g r o u p a n d s i g n i f i c a n t l y l o w e r i n n i c o r a n d i l g r o u p t h a n i n C M E g r o u p (0.325ʃ0.128n g /m l v s 0.058ʃ0.028n g /m l ,P <0.05;0.156ʃ0.089n g /m l v s 0.325ʃ0.128n g /m l ,P <0.05).T h e m y o c a r d i a l a p o p t o t i c i n d e x a n d a c t i v a t e d c a s p a s e -3e x p r e s s i o n l e v e l w e r e s i gn i f i -c a n t l y l o w e r i n n i c o r a n d i l g r o u p t h a n i n C M E g r o u p (P <0.05).C o n c l u s i o n N i c o r a n d i l c a n r e -d u c e t h e m y o c a r d i a l a p o p t o s i s a f t e r C M E i n s w i n e s b y r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f c a s pa s e -3.K e y wo r d s :n i c o r a n d i l ;c a s p a s e 3;a p o p t o s i s ;t r o p o n i n I ;c o r o n a r y t h r o m b o s i s D O I :10.3969/j.i s s n .1009-0126.2019.01.016基金项目:湖北省卫生计生委联合基金(W J 2018H 0108);中国中青年临床研究基金-V G 基金(2017-C C A -V G -001);武汉市临床医学科研项目(WX 17Q 36)作者单位:430022武汉科技大学附属武汉亚洲心脏病医院心内科通信作者:王江友,E m a i l :d r w a n g j i a n g yo u @163.c o m ㊃36㊃中华老年心脑血管病杂志2019年1月第21卷第1期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s ,J a n 2019,V o l 21,N o .1冠状动脉微栓塞(c o r o n a r y m i c r o e m b o l i z a t i o n, C M E)是P C I围术期常见的并发症,主要由P C I过程斑块破裂或血栓碎片流入冠状动脉微循环所致㊂研究显示,冠状动脉慢血流或无复流发病主要机制之一与C M E直接相关,即使在P C I中开通心外膜血管,心功能却恢复不理想,呈进行性下降,说明C M E与心外膜血流无明显相关,存在心外膜血流与心功能下降不匹配现象,因此其中具体机制一直困扰冠状动脉介入医师[1]㊂既往C M E动物模型研究发现,在C M E后局部仅仅存在微小梗死灶,但是在梗死灶周边发现大量心肌细胞凋亡现象,并且心脏功能进行性下降[2]㊂我们既往C M E动物模型发现,C M E后心肌组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (c a s p a s e-3)表达明显升高,通过抑制促凋亡蛋白c a s p a s e-3表达,即能够显著减少心肌细胞凋亡,进而改善心功能,C M E后大量心肌细胞凋亡与心功能进行性下降明显相关[3-5]㊂因此,心肌细胞凋亡是C M E致心肌损伤重要的发病机制㊂近年来大量研究证实,尼可地尔在心脏缺血再灌注损伤或心脏骤停中具有保护作用,其机制可能通过抑制炎性因子释放及降低心肌细胞凋亡有关[6]㊂然而,C M E致心肌损伤的主要机制与缺血再灌注损伤存在相似病理学现象,均与心肌细胞凋亡密切相关,因此,本研究探讨尼可地尔调控c a s p a s e-3对猪C M E后心肌凋亡的影响㊂1材料与方法1.1动物分组12周龄健康小型猪15只,雌雄不拘,体质量21~25k g,随机分为假手术组(等量生理盐水注射至冠状动脉内)㊁C M E组㊁尼可地尔组[C M E模型建立前尼可地尔预处理,耳缘静脉以0.05μg/(k g㊃m i n)使用24h,术前60m i n再以0.2μg/(k g㊃m i n)负荷使用],每组5只㊂1.2C M E模型建立首先通过肌肉注射氯胺酮首剂麻醉,手术过程中给予地西泮静脉(耳缘静脉)维持麻醉状态,采用外科方式切口皮肤,逐步分流出右侧股动脉血管,穿刺置入7F股动脉鞘管,注射肝素达到肝素化(200U/k g),手术>1h追加1次肝素(100U/k g)㊂采用P C I法,操控指引导丝将微导管送至左前降支中段(第一对角支发出处),之后缓慢注入42μm的微栓塞球45m l,在30~40m i n注射完毕,具体建模方法参见文献[7]㊂1.3心脏超声检测建模前及成功建立C M E模型后12h使用心脏超声检测各组猪L V E F㊁左心室舒张末期内径(L V E D D)㊁左心室短轴缩短率(L V F S)及心输出量(C O)㊂所有指标由具有心脏超声经验的医师测量及计算㊂1.4心肌梗死面积测量心脏超声检测后处死动物,取出相应部位心肌组织,按照苏木精碱性品红苦味酸(h e m a t o x y l i n b a s i c f u c h s i n p i c r i c,H B F P)染色步骤操作,每张病理切片随机选取5个视野(放大100倍),测量梗死区域,梗死面积由总切片的面积百分比获得㊂1.5心肌细胞T U N E L染色 D N A末端T U N E L 检测心肌细胞凋亡,并进行半定量分析,按照试剂盒说明书进行操作;随机观察切片上5个400倍高倍视野,计数细胞核总数和凋亡细胞核数,并且计算凋亡指数㊂1.6W e s t e r n b l o t检测心肌组织促凋亡蛋白c a s p-a s e-3按照试剂盒说明书进行操作,采用美国B i o-R a d公司G e l D o c2000凝胶图像中专用软件分析目标条带积分吸光度值,经肌动蛋白(a c t i n)校正后,c a s p a s e-3活化产物凋亡指数与a c t i n凋亡指数比值表示其相对活化水平㊂1.7肌钙蛋白I测定建模前及成功建立C M E模型后12h检测各组猪血浆肌钙蛋白I水平,采用免疫化学发光法测定,严格按照试剂说明书操作㊂1.8统计学方法采用S P S S17.0统计软件进行分析,计量资料以 xʃs表示,采用t检验,计数资料以百分率表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1各组心功能指标比较与假手术组比较,C M E组L V ED D明显升高,C M E组和尼可地尔组L VE F㊁L VF S及C O明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与C M E组比较,尼可地尔组L V E F㊁L V F S及C O明显升高,L V E D D明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,表1)㊂表1各组心功能指标比较( xʃs,n=5)项目假手术组C M E组尼可地尔组L V E F(%)69.38ʃ6.5848.76ʃ5.98a54.68ʃ7.89a b L V F S(%)42.68ʃ3.9423.68ʃ4.87a31.59ʃ5.62a b L V E D D(mm)32.56ʃ5.3640.26ʃ3.58a35.68ʃ2.56b C O(L/m i n)4.56ʃ1.562.98ʃ0.98a3.65ʃ1.20a b注:与假手术组比较,a P<0.05;与C M E组比较,b P<0.052.2各组肌钙蛋白I比较与假手术组比较,C M E组肌钙蛋白I明显升高[(0.325ʃ0.128)n g/ m l v s(0.058ʃ0.028)n g/m l,P<0.05];与C M E 组比较,尼可地尔组肌钙蛋白I明显降低[(0.156ʃ0.089)n g/m l v s(0.325ʃ0.128)n g/m l,P<0.05]㊂㊃46㊃中华老年心脑血管病杂志2019年1月第21卷第1期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s,J a n2019,V o l21,N o.12.3 各组心肌组织病理学改变 苏木精-伊红染色显示,C M E 组可见坏死心肌细胞细胞质呈红染,梗死灶周边心肌细胞变性㊁水肿,且周围存在大量炎性细胞浸润及红细胞渗出,尼可地尔组坏死灶周边炎症明显减轻(图1~2)㊂H B F P 染色显示,C M E 组和尼可地尔组心肌组织多处心肌微梗死灶,呈现出局灶性分布,未完全透壁,主要以内膜下和左心室多见(图3~5)㊂假手术组心肌组织未见明显梗死灶㊂尼可地尔组梗死面积明显低于C M E 组[(6.235ʃ2.365)%v s (9.685ʃ3.428)%,P <0.05]㊂ 图1 C M E 组心肌组织微梗死区域可见明显炎性水肿 图2 尼可地尔组心室前壁心肌组织炎性水肿明显减轻 图1~2 苏木精-伊红染色 ˑ20图3 假手术组心室前壁心肌组织未见明显微梗死灶 图4 C M E 组心肌组织微梗死灶区域染成红色 图5 尼可地尔组心肌组织微梗死区域染成红色 图3~5 H B F P 染色 ˑ10图6 假手术组可见散在极少量心肌凋亡细胞,表现为棕黄色 图7 C M E 组可见大量心肌凋亡细胞分布在梗死灶周边 图8 尼可地尔组可见一定程度心肌凋亡细胞分布在梗死灶周边 图6~8 各组心肌凋亡细胞 T U N E L 染色 ˑ4002.4 各组心肌凋亡细胞比较 心肌凋亡细胞细胞核呈棕黄色,正常心肌细胞核表现出淡蓝色(图6~8)㊂C M E 后12h 心肌细胞凋亡主要发生于心肌组织微梗死灶及其周围心肌细胞,假手术组可见极少量心肌凋亡细胞㊂假手术组㊁C M E 组及尼可地尔组心肌细胞凋亡指数分别为(0.24ʃ0.07)%㊁(10.56ʃ2.43)%及(6.82ʃ1.97)%㊂与假手术组比较,C M E 组心肌细胞凋亡指数明显升高(P <0.05);与C M E 组比较,尼可地尔组心肌细胞凋亡指数明显降低,差异有统计学意义(P <0.05)㊂2.5 各组心肌组织活化c a s pa s e -3表达比较 与假手术组比较,C M E 组心肌组织活化c a s p a s e -3表达明显升高(P <0.05);与C M E 组比较,尼可地尔组心肌组织活化c a s p a s e -3表达明显降低,差异有统计学意义(P <0.05,图9~10)㊂ 注:与假手术组比较,a P <0.05;与C M E 组比较,bP <0.05图9 各组心肌组织活化c a s pa s e -3表达比较图10 各组心肌组织活化c a s pa s e -3表达电泳图㊃56㊃中华老年心脑血管病杂志2019年1月第21卷第1期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s ,J a n 2019,V o l 21,N o .13讨论研究显示,C M E发生与冠状动脉无复流或慢血流存在直接相关,进而导致心肌损伤及近远期心功能明显下降,即使心外膜血流恢复正常,心功能依然进行性下降㊂C M E犬模型中发现,将微栓塞球缓慢注射于犬冠状动脉内,冠状动脉血流立即出现短暂偏慢,随即恢复正常血流,但是犬心功能指标进行性下降,出现冠状动脉血流与心功能不匹配现象,进一步说明微栓塞致心功能下降与心外膜血流变化无明显相关㊂另外动物研究发现,通过病理切片统计微栓塞导致坏死心肌面积,其实不到心肌总面积的5%,因此,单纯通过C M E致心肌坏死来解释心肌收缩功能障碍下降的原因,存在明显不足[8-9]㊂C M E致心肌损伤的具体病理生理学机制得到冠状动脉介入专家高度关注,其中心肌细胞凋亡及炎性反应是其发生的重要机制,并且得到大量研究证实㊂本研究发现类似现象,从猪冠状动脉内注射微栓塞球,心外膜动脉血流未见明显变化,心功能指标明显下降,病理切片发现,微梗死灶周边心肌细胞发生大量凋亡,再次证实心肌细胞凋亡参与C M E致心肌损伤㊂c a s p a s e-3是各类细胞发生凋亡至关重要的蛋白,在凋亡过程中发挥重要作用㊂既往动物实验研究发现,C M E发生后,在微梗死灶周围心肌细胞c a s p a s e-3表达明显升高,抑制c a s p a s e-3表达,能够显著降低心肌细胞凋亡,进而改善心脏功能,证实C M E致心功能不全发生机制与c a s p a s e-3介导的细胞凋亡密切相关[3-5]㊂本研究亦发现,在猪C M E后微梗死灶周边心肌细胞发生大量凋亡,心肌组织中c a s p a s e-3表达明显升高,再次证实心肌细胞凋亡参与C M E致心肌损伤㊂尼可地尔存在类硝酸酯类效应,具有扩张冠状动脉作用,目前主要用于难治性心绞痛患者中,因其存在扩张冠状动脉微小动脉作用,因此用于P C I中发生慢血流或无复流患者,效果显著㊂尼可地尔作用的主要机制是其能够开放A T P敏感性钾离子通道,近年来研究发现,尼可地尔在心肌再灌注损伤中发挥保护作用㊂尼可地尔可开通A T P敏感性K+通道,促使K+外流,细胞处于超极化状态及离子流动趋于平衡,从而能够降低细胞A T P的消耗,总体减少能量代谢㊂另外研究证实,尼可地尔能够通过开放A T P敏感性K+通道,缩短动作电位时程,降低C a2+超载㊁心肌不可逆性损害程度和心肌细胞凋亡,改善心功能[6]㊂本研究证实之前假说,尼可地尔参与C M E致心肌损伤,且与抑制c a s p a s e-3表达存在密切相关㊂总而言之,使用小型猪建立C M E模型后12h,心肌组织凋亡蛋白c a s p a s e-3表达明显增高,心肌细胞大量凋亡,心脏功能呈进行性下降;使用尼可地尔干预后,能够显著抑制心肌组织中c a s p a s e-3表达,进而减少心肌细胞凋亡,最终改善心功能的各项指标㊂本研究为P C I围术期使用尼可地尔降低心肌损伤提供理论依据㊂因此,我们在P C I围术期使用尼可地尔,能够降低围术期心肌损伤,改善心功能指标,理论上可以改善临床预后㊂下一步,需要更多临床研究证实尼可地尔在P C I围术期的保护作用㊂参考文献[1] C h e n Z W,Q i a n J Y,M a J Y,e t a l.T N F-α-i n d u c e d c a r d i o m y o-c y t e a p o p t o s i s c o n t r i b u t e s t o c a rd i a c d y s f u n c t i o n a f te r c o r o n a r ym i c r o e m b o l i z a t i o n i n m i n i-p i g s[J].J C e l l M o l M e d,2014,18(10):1953-1963. D O I:10.1111/j c mm.12342.[2] H e W,S u Q,L i a n g J,e t a l.T h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f n i c o r a n d i lo n c a r d i o m y o c y t e a p o p t o s i s a f t e r c o r o n a r y m i c r o e m b o l i z a t i o nb y ac t i v a t i n g N r f2/H O-1s i g n a l i n g p a t h w a y i n r a t s[J].B i o-c h e m B i o p h y s R e s C o mm u n,2018,496(4):1296-1301. D O I:10.1016/j.b b r c.2018.02.003.[3] W a n g J,C h e n H,S u Q,e t a l.T h e P T E N/A k t s i g n a l i n g p a t h-w a y m e d i a t e s m y o c a r d i a l a p o p t o s i s i n s w i n e a f t e r c o r o n a r y m i-c r o e m b o l i z a t i o n[J].J C a rd i o v a s c P h a r m a c o l T he r,2016,21(5):471-477. D O I:10.1177/1074248415624158.[4] W a n g J,C h e n H,Z h o u Y,e t a l.A t o r v a s t a t i n i n h i b i t s m y o c a r d i-a l a p o p t o s i s i n a s w i n e m o d e l o f c o r o n a r y m i c r o e mb o l i z a t i o n b yr e g u l a t i n g P T E N/P I3K/A k t s i g n a l i n g p a t h w a y[J].C e l l P h y s i-o l B i o c h e m,2016,38(1):207-219.D O I:10.1159/00043 8622.[5] W a n g J,C h e n H,Z h o u Y,e t a l.L e v o s i m e n d a n p r e t r e a t m e n t i n-h i b i t s m y o c a r d i a l a p o p t o s i s i n s w i n e a f t e r c o r o n a r y m i c r o e m b o-l i z a t i o n[J].C e l l P h y s i o l B i o c h e m,2017,41(1):67-78. D O I:10.1159/000455950.[6] L i a n g L N,Z h o n g X,Z h o u Y,e t a l.C a r d i o p r o t e c t i v e e f f e c t o fn i c o r a n d i l a g a i n s t m y o c a r d i a l i n j u r y f o l l o w i n g c a r d i a c a r r e s t i n s w i n e[J].A m J E m e r g M e d,2017,35(8):1082-1089. D O I:10.1016/j.a j e m.2017.02.051.[7]王江友,陈涵,鄢华,等.左西孟旦对猪冠状动脉微栓塞后心肌细胞凋亡的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2018,20(1): 78-82. D O I:10.3968/j.i s s n.1009-0123.2018.01.020.[8] H e u s c h G,S k y s c h a l l y A,K l e i n b o n g a r d P.C o r o n a r y m i c r o e m-b o l i z a t i o n a n d m ic r o v a s c u l a rd y s f u n c t i o n[J].I n t J C a r d i o l,2018,258:17-23. D O I:10.1016/j.i j c a r d.2018.02.010. [9]王江友,苏晞.急性心肌梗死患者冠状动脉微血管功能障碍和阻塞机制的研究进展[J].中华老年心脑血管病杂志,2016,18(9):996-998. D O I:10.3969/j.i s s n.1009-0126.2016.09.026.(收稿日期:2018-07-25)(本文编辑:马卫东)㊃66㊃中华老年心脑血管病杂志2019年1月第21卷第1期 C h i n J G e r i a t r H e a r t B r a i n V e s s e l D i s,J a n2019,V o l21,N o.1。