医学实验小技巧与知识总结课件
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临床医学检验技术必背知识点PPT课件
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• 16. 红细胞既有低色素又有正色素为“双形性”，是缺铁粒幼细胞贫血的特征， 且环形铁粒幼占15%以上。 17. 急性白血病：某一原始细胞大于30%预后小于6个月。 慢性白血病：某一系白细胞增多接近成熟为主，原始细胞不过10%。
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• 18. 中国急性白血病分型： M1，原始粒细胞白血病未分化型，原粒大于或等于 90%，早幼粒少，中幼以下阶段不见或少见，POX， SBC（+）的原粒大于3%。 M2，原始粒细胞白血病部分分化型，有M2a，M2b两 型，M2a中原粒大于30%小于90%，单核小于20%， 早幼粒以下阶段大于10%，M2b以异常的中性中幼粒 增生为主大于30%， 有Ph小体存在M3急性早幼粒细胞白血病，心颗粒增多 的异常早幼粒细胞增生为主，大于30%可见束状Auer 小体，依颗粒可分M3a，M3b。 M4，粒－单核细胞白血病，按粒单比例可分M4a， M4b，M4c，M4e（嗜酸性细胞5～3%）。 M5，单核细胞白血病，以分化程度分M5a，未分化型， 原单大于或等于80%M5b，部分分化型。 M6红白血病，红系大于或等于50%，红系PAS阳性， 原粒大于30%异常幼红细胞大于10%时也可诊断。 M7，巨核细胞白血病原巨核大于30%。
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• 39. 单纯疱疹脑炎时脑脊液中淋巴样细胞中可发现胞质 内包涵体。 40. 粒细胞淋巴细胞浆细胞同时存在是结核性脑膜炎的 特点。 41. 蛋白－细胞分离现象（Froin综合症）是蛛网膜 下腔梗阻所致梗阻脑脊液的特征。 42. 髓鞘碱性蛋白（MBP）增高见于多发性硬化症。 43. 神经性梅毒检查首选试验是密螺旋体荧光抗体吸收 试验（FTA-ABC）。 44. 浆膜积液常规及细胞学用EDTA抗凝，生化用肝素， 一管不加抗凝用于观察有无凝固。 45. 漏出液以淋巴，间皮细胞为主；渗出液以中粒，淋 巴，嗜酸性为多。 46. 如见到纤毛柱状上皮和尘细胞可确认为痰液标本。 47. 夏科-雷登结晶常与Eos、库施曼螺旋体共存，见于 支气管哮喘和肺吸虫病。
• 16. 红细胞既有低色素又有正色素为“双形性”，是缺铁粒幼细胞贫血的特征， 且环形铁粒幼占15%以上。 17. 急性白血病：某一原始细胞大于30%预后小于6个月。 慢性白血病：某一系白细胞增多接近成熟为主，原始细胞不过10%。
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• 18. 中国急性白血病分型： M1，原始粒细胞白血病未分化型，原粒大于或等于 90%，早幼粒少，中幼以下阶段不见或少见，POX， SBC（+）的原粒大于3%。 M2，原始粒细胞白血病部分分化型，有M2a，M2b两 型，M2a中原粒大于30%小于90%，单核小于20%， 早幼粒以下阶段大于10%，M2b以异常的中性中幼粒 增生为主大于30%， 有Ph小体存在M3急性早幼粒细胞白血病，心颗粒增多 的异常早幼粒细胞增生为主，大于30%可见束状Auer 小体，依颗粒可分M3a，M3b。 M4，粒－单核细胞白血病，按粒单比例可分M4a， M4b，M4c，M4e（嗜酸性细胞5～3%）。 M5，单核细胞白血病，以分化程度分M5a，未分化型， 原单大于或等于80%M5b，部分分化型。 M6红白血病，红系大于或等于50%，红系PAS阳性， 原粒大于30%异常幼红细胞大于10%时也可诊断。 M7，巨核细胞白血病原巨核大于30%。
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• 39. 单纯疱疹脑炎时脑脊液中淋巴样细胞中可发现胞质 内包涵体。 40. 粒细胞淋巴细胞浆细胞同时存在是结核性脑膜炎的 特点。 41. 蛋白－细胞分离现象（Froin综合症）是蛛网膜 下腔梗阻所致梗阻脑脊液的特征。 42. 髓鞘碱性蛋白（MBP）增高见于多发性硬化症。 43. 神经性梅毒检查首选试验是密螺旋体荧光抗体吸收 试验（FTA-ABC）。 44. 浆膜积液常规及细胞学用EDTA抗凝，生化用肝素， 一管不加抗凝用于观察有无凝固。 45. 漏出液以淋巴，间皮细胞为主；渗出液以中粒，淋 巴，嗜酸性为多。 46. 如见到纤毛柱状上皮和尘细胞可确认为痰液标本。 47. 夏科-雷登结晶常与Eos、库施曼螺旋体共存，见于 支气管哮喘和肺吸虫病。
“医学实验技术课件”
常见实验技术
移液技术
学习正确使用移液器进行准 确和精细的液体传输。
凝胶电泳
分光光度测定
了解凝胶电泳的原理和应用， 用于分离和分析DNA、RNA 和蛋白质。
学习如何使用分光光度计测 量溶液的吸光度，并确定其 浓度。
现代实验室工具
基因测序仪
探索基因测序仪的原理和应用，用于解码 DNA序列。
细胞培养设备
质量控制
质量控制标准
了解实验室质量控制的重要 性，并学习如何制定和实施 标准。
仪器校准
学习仪器校准的基本原则， 以确保结果的准确性和可靠 性。
样本验证
探索样本验证步骤，以确保 实验结果的准确性。
实验室管理
1 库存管理
学习如何管理和跟踪实验室耗材和试剂的库存。
2 团队合作
了解团队合作的重要性，并学习如何有效地与实验室成员合作。
介绍细胞培养技术中的培养箱、培养皿和 培养基。
质谱仪
了解质谱仪的工作原理，用于分析样品中 的化合物。
分子模型工具
使用分子模型工具1
样本处理
学习如何处理和准备样本以进行进
数据分析
2
一步的实验。
探索数据分析技术，如统计分析和
图表制作。
3
实验设计
了解实验设计原则，并学习如何设 计有效的实验方案。
“医学实验技术课件”
在这个课件中，我们将探索医学实验技术的关键方面，包括实验室基础知识、 常见实验技术和现代实验室工具。
实验室基础知识
1
安全操作
学习实验室安全操作的基本原则，以确保实验室工作环境的安全。
2
测量与混合
了解如何正确测量试剂、样品和溶液，并学习混合技术。
3
医学实验常用方法学简介ppt课件
荧光的观察（按标本分类）
在荧光显微镜下观察的标本，当然必须发 出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因
而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。
（A）自发荧光 （B）二次荧光
（C）抗体荧光技术
（A）自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发 荧光或原发荧光），但在医学和生物学（细胞 学、生物组织、培养体等）领域中，只有很少 物质具有自发荧光，常采用后两种方法。 测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以 判定物质性质（荧光光度法）。 应用：生物学方面——判定维生素，研究 生物学上的生物源的胺。
成为生物医学研究中重要的研究手段。
（三）组织化学术（histochemistry） 应用化学反应与物理反应原理检 测组织或细胞内某种化学成分并进行
定位、定量及相关功能研究的技术。
1、多糖
显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘 酸—雪夫反应(periodic acid Schiff
reaction,PAS反应)。组织或细胞中的多糖被结
注意：溶解液-酶效价
时间-新鲜组织、酶解时间过长，细胞自溶
pH值-碱性：胃蛋白酶失活
-中性：胰酶活性欠佳 酶纯度 细胞膜改变
2、机械法 -剪碎组织 -100目尼龙网过滤（去除大组织块） -离心1000prm3-5分钟，去上清 -洗三次，每次离心（500~800prm）取上清，
弃细胞碎片
-300目尼龙网过滤去除细胞团块
合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反应， PAS阳性部位为多糖存在部位。
2、脂类
标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、 尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞
中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸 固定兼染色，脂类呈黑色。
3、酶
医学实验基本操作技能
医学实验基本操作技能1.实验室基础操作技巧1.1实验室安全操作技巧-熟悉实验室的安全规章制度，掌握常见实验室安全知识。
-掌握个人防护措施，包括戴手套、穿实验服、戴护目镜等。
-熟悉应急处理程序，如发生火灾、泄漏等紧急情况时的处理方法。
1.2常用试剂的准备和保存-熟悉实验室的不同试剂及其保存要求。
-学会准确称量试剂，遵循配制浓度和体积的要求。
-学会试剂的保存方法，如避光、低温等。
1.3基本玻璃仪器的使用和处理-熟悉常用的玻璃仪器，如容量瓶、量筒、试管等的使用方法。
-学会使用玻璃仪器的清洗和消毒方法，以防止交叉感染。
2.1显微镜的使用-熟悉常用的显微镜的结构和使用方法。
-能够调节显微镜的各种参数，如物镜倍数、光源亮度等。
-掌握显微镜的标本制备和观察技巧。
2.2电子天平的使用-掌握电子天平的使用方法和操作要点。
-熟练进行称量操作，注意准确性和重复性。
2.3离心机的使用-熟悉离心机的基本原理和操作方法。
-控制离心机的转速和离心时间，避免出现操作失误。
2.4恒温水浴器的使用-熟悉恒温水浴器的操作方法，包括温度调节和样品的放置方式。
-注意水浴器的维护和清洁，避免发生水的外溢或温度波动。
3.常用实验技术和手术技能3.1基本实验技术-掌握液体的移液方法，包括手工移液和自动移液仪的使用。
-学会分光光度法、荧光法、电泳等实验技术的操作和数据处理方法。
-掌握细胞培养技术，包括培养基的配制、细胞分离和传代、细胞冻存等。
3.2基本手术技能-掌握小鼠和大鼠的解剖方法，包括皮肤切开、内脏取出等。
-学会动物手术技能，如注射、切除、缝合等。
基础医学实验技术课件
• 酒精又叫乙醇，是最常用的皮肤消毒剂，75％的酒精用于灭菌消毒； 50％的酒精用于防褥疮；20％～50％的酒精擦浴用于高热病人的物理 降温。不同浓度的酒精都是由高浓度(95％)酒精用蒸馏水稀释而成的。
• 酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变 性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋 白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固 的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。 75％的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐 不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死 细菌，酒精浓度低于75％时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。
基础医学实验技术
基本操作技术 溶液的配制 缓冲溶液
基础医学实验技术
基本操作技术
P8
溶液的配制
P39
缓冲溶液
基础医学实验技术
P40
2
实验一 基本操作技术
实验目的
掌握玻璃仪器的清洗； 学会正确使用吸量管、微量移液器、酒精计、 粗天平的使用。
玻璃仪器
烧杯、试管、量杯、量筒、刻度吸量管、滴管等。
基础医学实验技术
1.缓冲原理：
• NaH2PO4—Na2HPO4
H2PO42- 是抗碱成分
HPO42- 是抗酸成分 • 在溶液加少量的碱时， OH-与H2PO42- 电离产生的H+生成H2O，使溶
液的PH值不发生明显变化。
• 在溶液加少量的酸时， H+与HPO42- 结合生成H2PO42- ，溶液的PH值也 不发生明显变化。
基础医学实验技术
10
实验一 基本操作技术
3.称量完毕
砝码放回砝码盒中，游码移至刻度“0”处，天平的两个托盘重叠后，放在天平的一侧， 使天平休止，以保护天平的刀口。
• 酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变 性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋 白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固 的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。 75％的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐 不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死 细菌，酒精浓度低于75％时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。
基础医学实验技术
基本操作技术 溶液的配制 缓冲溶液
基础医学实验技术
基本操作技术
P8
溶液的配制
P39
缓冲溶液
基础医学实验技术
P40
2
实验一 基本操作技术
实验目的
掌握玻璃仪器的清洗； 学会正确使用吸量管、微量移液器、酒精计、 粗天平的使用。
玻璃仪器
烧杯、试管、量杯、量筒、刻度吸量管、滴管等。
基础医学实验技术
1.缓冲原理：
• NaH2PO4—Na2HPO4
H2PO42- 是抗碱成分
HPO42- 是抗酸成分 • 在溶液加少量的碱时， OH-与H2PO42- 电离产生的H+生成H2O，使溶
液的PH值不发生明显变化。
• 在溶液加少量的酸时， H+与HPO42- 结合生成H2PO42- ，溶液的PH值也 不发生明显变化。
基础医学实验技术
10
实验一 基本操作技术
3.称量完毕
砝码放回砝码盒中，游码移至刻度“0”处，天平的两个托盘重叠后，放在天平的一侧， 使天平休止，以保护天平的刀口。
医学实验基本操作技能
《医学实验基本操作技能》讲稿供医学本科各专业使用基础医学院实验教学中心二○○八年九月第一篇医学实验基本要求第一章医学基本操作技能实验教学目的及一般规则【课程目的】了解开设《医学实验基本操作技能》课程的目的和意义；初步了解医学实验基本操作技能包括的主要内容；掌握实验室的一般规则及安全规则。
【课程内容】一、课程简介（一）开设目的及意义医学实验基本操作技能是基础医学的重要组成部分。
开设目的：1. 加强医学实验基本操作技能的培训，提高中医院校学生的动手能力；2. 学习医学实验和科学研究的基本方法，为后续实验课程的开设奠定基础；3. 培养严谨的科学研究态度和实事求是的科学研究精神，为今后的科学研究工作培养良好习惯。
（二）学时安排：共60学时。
1．理论教授：1次课，4学时：----医学实验基本要求2．实验操作：11次课，52学时；（1）生物化学实验基本技能：1次实验（5+5学时）----生物化学基本技能、常用生物化学仪器操作（2）显微形态实验基本技能：3次实验（4学时/实验）----生物显微镜的结构、使用方法----石蜡组织切片、HE染色技术，血涂片制作及瑞特染色技术-----血细胞计数（4）机能实验基本技能：6次实验（5学时/实验）----实验动物基本操作1（捉拿固定、编号、给药、处死等）----实验动物基本操作2（麻醉、脱毛、取血、解剖等）----常用动物手术操作技术（手术器械、缝合、打结、拆线）----生物机能实验系统操作技术（BL410、BL420）----急性动物实验的基本技术--蛙实验----急性动物实验的基本技术--兔实验3．实验操作考试：1次课，4学时：进行单人、抽签考试。
（三）课程内容1．医学实验基本要求本内容为该课程中的第一讲，也是唯一的一次课堂理论讲授，主要包括以下两个内容：（1）教学目的及实验规则本内容主要包括三个方面：一是开设本课程的主要目的及意义；二是进入实验室所必须遵守的规则；三是实验室安全守则（详细内容参考教材第一篇第一章）。
临床技能及其相关知识-PPT课件
▪ 2，复张性肺水肿，立即停止穿刺，用50% 酒精湿化吸氧，利尿，强心，糖皮质激素
▪ 3，如果穿刺损伤肺，需顺势将该肺泡抽瘪。
9
▪ 4，首次放液不超过600，以后每 次不超过1000，诊断性穿刺50100，如果找肿瘤细胞需大于100， 婴儿150-200，年长儿300-500。
10
腹腔穿刺适应症
▪ 2，换药过程中注意和患者交流。 ▪ 拆线基本步骤和换药相同 ，只是需多准备
一拆线剪，多出一拆线步骤。
28
打结
▪ 分类：单结 方结 外科结 三重结 ▪ 方法：左手、右手、双手、持针器 ▪ 特殊：深部打结和无张力打结 ▪ 注意：三点一线 用力均匀一致。拉线的方
向
29
体格检查
▪ 一般、 ▪ 头颈部检查 ▪ 肺部检查 ▪ 心脏检查 ▪ 腹部检查 ▪ 四肢 ▪ 神经系统检查
类。
15
注意事项
▪ 初次放液不超过3000，以后每次不超过 3000-6000，肝硬化患者首次不超1000，以 后每次不超过3000。
▪ 诊断性穿刺用20或者50ml注射器7号针头 ▪ 鉴别渗出液和漏出液 ▪ 鉴别血性腹水（渗出？损伤？） ▪ 大量腹水防止渗漏的方法
16
防止腹水渗漏的方法
▪ 迷路穿刺 ▪ 蝶形胶布固定 ▪ 腹带加压包扎 ▪ 局部按压 ▪ 健侧卧位 ▪ 火棉胶封闭
17
骨髓穿刺
▪ 适应症：血液病的诊断，病原微生物的培 养，不明原因发热，紧急情况下输液。
▪ 禁忌症：血友病，局部皮肤感染，生命体 征不稳，躁动不能配合。
18
穿刺点定位
▪ 1，髂前上棘后上方1-2cm比较平坦的骨面 ▪ 2，骶骨两侧旁开2-4CM，髂后上棘下 6-
8CM 所围成的平坦骨面 ▪ 3，胸骨胸骨角上方平坦骨面，进针角度 ▪ 4，棘突 T11-12，L1-3. ▪ 5，胫骨头下方1-1.5CM的平坦骨面。
▪ 3，如果穿刺损伤肺，需顺势将该肺泡抽瘪。
9
▪ 4，首次放液不超过600，以后每 次不超过1000，诊断性穿刺50100，如果找肿瘤细胞需大于100， 婴儿150-200，年长儿300-500。
10
腹腔穿刺适应症
▪ 2，换药过程中注意和患者交流。 ▪ 拆线基本步骤和换药相同 ，只是需多准备
一拆线剪，多出一拆线步骤。
28
打结
▪ 分类：单结 方结 外科结 三重结 ▪ 方法：左手、右手、双手、持针器 ▪ 特殊：深部打结和无张力打结 ▪ 注意：三点一线 用力均匀一致。拉线的方
向
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体格检查
▪ 一般、 ▪ 头颈部检查 ▪ 肺部检查 ▪ 心脏检查 ▪ 腹部检查 ▪ 四肢 ▪ 神经系统检查
类。
15
注意事项
▪ 初次放液不超过3000，以后每次不超过 3000-6000，肝硬化患者首次不超1000，以 后每次不超过3000。
▪ 诊断性穿刺用20或者50ml注射器7号针头 ▪ 鉴别渗出液和漏出液 ▪ 鉴别血性腹水（渗出？损伤？） ▪ 大量腹水防止渗漏的方法
16
防止腹水渗漏的方法
▪ 迷路穿刺 ▪ 蝶形胶布固定 ▪ 腹带加压包扎 ▪ 局部按压 ▪ 健侧卧位 ▪ 火棉胶封闭
17
骨髓穿刺
▪ 适应症：血液病的诊断，病原微生物的培 养，不明原因发热，紧急情况下输液。
▪ 禁忌症：血友病，局部皮肤感染，生命体 征不稳，躁动不能配合。
18
穿刺点定位
▪ 1，髂前上棘后上方1-2cm比较平坦的骨面 ▪ 2，骶骨两侧旁开2-4CM，髂后上棘下 6-
8CM 所围成的平坦骨面 ▪ 3，胸骨胸骨角上方平坦骨面，进针角度 ▪ 4，棘突 T11-12，L1-3. ▪ 5，胫骨头下方1-1.5CM的平坦骨面。
医学检验学课件-临床检验操作技能掌握
参加外部质控项目，与其他实验室进行比对和 交流，提高实验室质量。
建立完善的质控文件，记录和追踪质检信息， 确保实验室的质量管理。
自动化免疫分析
介绍自动化免疫分析仪器的使用和维护，提高检验效率和结果准确性。
检验结果分析与诊断思路
结果解读
掌握检验结果的解读方法，包 括正常范围、异常值和临床意 义。
诊断思路
合理建议与解释
根据检验结果和临床情况，形 成合理的诊断思路和治疗方案。
向医生和患者提供专业的检验 结果解释和合理的诊断建议。
2
仪器操作与维护
了解生化分析仪器的操作原理和维护方法，确保准确性和稳定性。
3
结果解读与报告
学习生化指标结果的解读，了解其在临床诊断中的意义和应用。
免疫学检验技能及其临床应用
免疫技术原理
了解免疫学检验的基本原理，如免疫沉淀、 免疫荧光、酶联免疫等。
抗体检测方法
学习抗体检测的方法，如ELISA、免疫层 析等，以及其在疾病诊断和治疗中的应用。
血型鉴定技能及其临床意义
1 ABO血型系统
2 Rh血型系统
3 其他重要血型系统
学习不同血型的抗原和 抗体，以及ABO血型的 配血原则。
了解Rh抗原的特点，掌 握Rh血型的鉴定方法及 其与孕产妇胎儿血型不 合的临床意义。
介绍其他重要血型系统， 如Kell、Duffy等，并了 解相关的临床应用。
微生物学检验技能及其应用
实验室常见问题及应对策略
1
质量控制问题
学习实验室中常见的质量控制问题，及时发现和解决。
2
设备故障与维修
了解实验室设备的常见故障和维修方法，减少对工作的影响。
3
样本处理与保存
建立完善的质控文件，记录和追踪质检信息， 确保实验室的质量管理。
自动化免疫分析
介绍自动化免疫分析仪器的使用和维护，提高检验效率和结果准确性。
检验结果分析与诊断思路
结果解读
掌握检验结果的解读方法，包 括正常范围、异常值和临床意 义。
诊断思路
合理建议与解释
根据检验结果和临床情况，形 成合理的诊断思路和治疗方案。
向医生和患者提供专业的检验 结果解释和合理的诊断建议。
2
仪器操作与维护
了解生化分析仪器的操作原理和维护方法，确保准确性和稳定性。
3
结果解读与报告
学习生化指标结果的解读，了解其在临床诊断中的意义和应用。
免疫学检验技能及其临床应用
免疫技术原理
了解免疫学检验的基本原理，如免疫沉淀、 免疫荧光、酶联免疫等。
抗体检测方法
学习抗体检测的方法，如ELISA、免疫层 析等，以及其在疾病诊断和治疗中的应用。
血型鉴定技能及其临床意义
1 ABO血型系统
2 Rh血型系统
3 其他重要血型系统
学习不同血型的抗原和 抗体，以及ABO血型的 配血原则。
了解Rh抗原的特点，掌 握Rh血型的鉴定方法及 其与孕产妇胎儿血型不 合的临床意义。
介绍其他重要血型系统， 如Kell、Duffy等，并了 解相关的临床应用。
微生物学检验技能及其应用
实验室常见问题及应对策略
1
质量控制问题
学习实验室中常见的质量控制问题，及时发现和解决。
2
设备故障与维修
了解实验室设备的常见故障和维修方法，减少对工作的影响。
3
样本处理与保存
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生物学小知识
制作人：郜原
医学实验小技巧与知识总结
1
OD (optical density，吸光度)
• OD260/OD280来判断分子纯度
• 当OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高 • 当OD260/OD280> 2.0，表示RNA含量较高 • 当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯
医学实验小技巧与知识总结
6
RNA提取与验证
• RNA完美提出来的话应该是三条带：28s， 18s，5.8s；
• 28s和18s比较亮，而且28s是18s的2倍量， 5.8s基本很模糊，可有可无；
• 28s是5.0kb，18s是1.9kb，5.8s 要小于 200kb（人）
医学实验小技巧与知识总结
7
• 标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD ，一般不影响目标蛋白的功能；
容量 25ml 50ml 75ml 250ml 700ml
工作体积 2ml 5ml 10ml 15ml 40ml
细胞数目 5X10 5 1X10 6 2X10 6 4X 10 6 1.1X10 7
医学实验小技巧与知识总结
9
Kozak sequence
• Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所 满足的统计规律，若将第一个ATG中的碱基A，T， G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：
• (1)第4位的偏好碱基为G； • (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； • (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； • (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 • 需要指出的是，Kozak规则是基于已知数据的统计结果，
并不绝对，而且对于不同的物种有所差别。
质粒电泳图解
医学实验小技巧与知识总结
8
细胞培养瓶（板）生长面积容量与 细胞数
• 24孔板长满了细胞大约有3X105个细胞。如果一天后要长到70％（2.1x105）， 建议放1.2-1.4X105个细胞。 因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表 面及适应新的生长条件， 不会达到24小时翻一倍的速度。
• 大约数目
96孔板 4~5X104
35mm培养皿
1X106
48 孔板 1.3X105
60mm培养皿
2.6X106
24孔板 2.5X105
100mm培养皿
7X106
12孔板 5X 105
150mm培养皿
1.8X107
6孔板
1.2X106
• 细胞瓶面积 12.5cm2 25cm2 35cm2 75 cm2 150cm2
• 合成公司交给你的引物成品一般是会注明 有几个OD，正常情况下1个OD相当于33μg 。
医学实验小技巧与知识总结
3
Tm值的简单计算
医学实验小技巧与知识总结
4
蛋白分子量估算
• N(氨基酸数量) ×110 Da
医学实验小技巧与知识总结
5
增加PCR特异性
• 镁离子浓度 • 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，引物退火，影响PCR产
量和特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子 的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带 有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会 增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以 0.5mM递增，进行镁离子滴定； • 促进PCR的添加剂 • 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性 的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响 DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获 得最好的结果需要模板的完全变性。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油， 甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution，可以增强扩增。它们可能的机理是降低 熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。为 获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO， 甲酰胺和甘油。
医学实验小技巧与知识总结
10
• 真核引物设计需在AUG前加上GCCACC
• 加Kozark sequence(GCCACC)是用来增强真核基因 的翻译效率的。是最优化的AUG环境，避免 ribosome（核糖体）出现leaky scan
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蛋白标签
• 蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外 重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一 种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达 、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断 发展，研究人员相继开发出了具有各种不 同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签 已在基础研究和商业化产品生产等方面得 到了广泛的应用。
• OD260/OD230 的比值来判断所得到的核酸中的 盐和小分子杂质的残留程度
• 对于核酸纯制品，OD260/OD230应大于2； • OD260/OD230<2说明去盐不充分
• 用于细胞转染的质粒大提浓度最好能达到300ng/μL 以上
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2
• 碱基平均分子量324.5。
+++ ++
抗体效价 +/+ + + + +
+ + ++ + +
+
+
细胞标记
+++ ++ +ห้องสมุดไป่ตู้+ +++
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13
• TrxHIS
• His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的 蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构 成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合 配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸 引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进 行分离纯化。 使用His-tag有下面优点：
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12
标签
His6 Flag GST MBP His-MBP HA eGFP/CFP/YFP Myc His-Myc His-AviTag™ Sumo His-Sumo
SNAP-Tag™
Halo Tag™
纯化 + + + + ++
+ ++
++ ++ ++
促进溶解度 +/+/+ ++ +
制作人：郜原
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1
OD (optical density，吸光度)
• OD260/OD280来判断分子纯度
• 当OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高 • 当OD260/OD280> 2.0，表示RNA含量较高 • 当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯
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6
RNA提取与验证
• RNA完美提出来的话应该是三条带：28s， 18s，5.8s；
• 28s和18s比较亮，而且28s是18s的2倍量， 5.8s基本很模糊，可有可无；
• 28s是5.0kb，18s是1.9kb，5.8s 要小于 200kb（人）
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7
• 标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD ，一般不影响目标蛋白的功能；
容量 25ml 50ml 75ml 250ml 700ml
工作体积 2ml 5ml 10ml 15ml 40ml
细胞数目 5X10 5 1X10 6 2X10 6 4X 10 6 1.1X10 7
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9
Kozak sequence
• Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所 满足的统计规律，若将第一个ATG中的碱基A，T， G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：
• (1)第4位的偏好碱基为G； • (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； • (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； • (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 • 需要指出的是，Kozak规则是基于已知数据的统计结果，
并不绝对，而且对于不同的物种有所差别。
质粒电泳图解
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8
细胞培养瓶（板）生长面积容量与 细胞数
• 24孔板长满了细胞大约有3X105个细胞。如果一天后要长到70％（2.1x105）， 建议放1.2-1.4X105个细胞。 因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表 面及适应新的生长条件， 不会达到24小时翻一倍的速度。
• 大约数目
96孔板 4~5X104
35mm培养皿
1X106
48 孔板 1.3X105
60mm培养皿
2.6X106
24孔板 2.5X105
100mm培养皿
7X106
12孔板 5X 105
150mm培养皿
1.8X107
6孔板
1.2X106
• 细胞瓶面积 12.5cm2 25cm2 35cm2 75 cm2 150cm2
• 合成公司交给你的引物成品一般是会注明 有几个OD，正常情况下1个OD相当于33μg 。
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3
Tm值的简单计算
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4
蛋白分子量估算
• N(氨基酸数量) ×110 Da
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5
增加PCR特异性
• 镁离子浓度 • 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，引物退火，影响PCR产
量和特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子 的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带 有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会 增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以 0.5mM递增，进行镁离子滴定； • 促进PCR的添加剂 • 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性 的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响 DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获 得最好的结果需要模板的完全变性。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油， 甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution，可以增强扩增。它们可能的机理是降低 熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。为 获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO， 甲酰胺和甘油。
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• 真核引物设计需在AUG前加上GCCACC
• 加Kozark sequence(GCCACC)是用来增强真核基因 的翻译效率的。是最优化的AUG环境，避免 ribosome（核糖体）出现leaky scan
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11
蛋白标签
• 蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外 重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一 种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达 、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断 发展，研究人员相继开发出了具有各种不 同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签 已在基础研究和商业化产品生产等方面得 到了广泛的应用。
• OD260/OD230 的比值来判断所得到的核酸中的 盐和小分子杂质的残留程度
• 对于核酸纯制品，OD260/OD230应大于2； • OD260/OD230<2说明去盐不充分
• 用于细胞转染的质粒大提浓度最好能达到300ng/μL 以上
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2
• 碱基平均分子量324.5。
+++ ++
抗体效价 +/+ + + + +
+ + ++ + +
+
+
细胞标记
+++ ++ +ห้องสมุดไป่ตู้+ +++
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• TrxHIS
• His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的 蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构 成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合 配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸 引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进 行分离纯化。 使用His-tag有下面优点：
医学实验小技巧与知识总结
12
标签
His6 Flag GST MBP His-MBP HA eGFP/CFP/YFP Myc His-Myc His-AviTag™ Sumo His-Sumo
SNAP-Tag™
Halo Tag™
纯化 + + + + ++
+ ++
++ ++ ++
促进溶解度 +/+/+ ++ +