食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质
蛋白质的含量一般是按照总氮量乘上一个合适的
蛋白质换算系数来求得的。这个系数决定于物质中蛋 白质的含氮量。蛋白质的含氮量一般为15—17%，平 均值为16%左右。所以只要测出样品（鸡蛋、青豆、 肉、玉米等）中的含氮量，再乘以换算系数，就可计 算出样品中的蛋白质含量。
（g）; m------试样的质量或体积（g或mL） F------氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；乳制品为6.38；
面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大 豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、 裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。 计算结果保留三位有效数字。
至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5-1h，取下放冷， 小心加20ml水，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗涤烧瓶，洗 液并入容量瓶，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
消化装置
加入试剂的作用：
K2SO4的作用：作为增温剂，提高溶液沸点；加速 对有机物的分解作用。 CuSO4的作用：作为催化剂。还可以作消化终点指 示剂：当完全消化后，反应停止，变为兰色。浓硫 硫酸的作用：硫酸使有机物脱水，并破坏有机物， 使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而 蛋白质则分解氮，与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性 溶液中。
5.2 蒸馏：
（1）仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。 洗涤方法：先煮沸蒸汽发生器，器中盛有2/3体积的用几滴硫酸 酸化过的水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。关闭反 应管下的管夹使蒸汽通过反应室的插管进入反应室，再由冷凝 管下端逸出（可在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸-指示剂 的锥形瓶，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，可证明蒸 馏器内部已洗涤干净） 。 排废：用右手轻提样品杯中棒状玻塞，使水流入反应室的同时， 立即用左手捏紧橡皮管，以断气源，盖好玻塞。由于反应室外 层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自 动抽到反应室外壳中。再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，反复 三次。关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪1～3min，可进行蒸 馏。
蛋白质的测定方法—凯氏定氮法
蛋白质的测定方法—凯氏定氮法一、原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
二、试剂1、硫酸铜硫酸钾浓硫酸氢氧化钠2、硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解并稀释至1000ml。
3、氢氧化钠溶液（400g/L）：称取400gNaOH加水溶解后，放冷，并稀释至1000ml。
4、盐酸标准溶液（0.05mol/L）5、甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。
6、溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。
7、甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：临用时以1:5混合。
三、测定1、试样处理（消化）：准确称取水解胶原蛋白0.5g,准确至0.0001g，硫酸铜0.2g，硫酸钾6g于干燥洁净的凯氏定氮管中，至消化炉上，加浓硫酸20ml，盖帽。
开启消化炉（温度设定为400℃），仪器大约20分钟达到设定温度，开始计时，样品消化需2-3h，至液体呈蓝绿色并澄清透明后。
断电，放冷。
2、蒸馏与吸收：将消化好的试样转移至100ml容量瓶中，加水（边加边缓慢振摇容量瓶，由于样品放热，操作时戴手套以免烫伤）稀释至100ml容量瓶中，摇匀，备用。
同时做空白试验。
向接收瓶中加入硼酸（20g/L）50ml及10D甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。
打开凯氏定氮仪电源开关，打开冷却水，设置加碱（40%的NaOH 溶液）时间为7秒，蒸馏时间为6分钟，取定容后溶液10ml到消化管中，放置到相应位置。
关闭安全门，开机预热3分钟后按启动键开始加碱、蒸馏。
当吸收液呈中性时，停止吸收。
用0.05mol/L盐酸标准液滴定接收液，颜色由绿色变为灰红色即为滴定终点，记录消耗盐酸体积。
3、计算C*(V1-V0)*0.014X=----------------------*F*100M*10/100其中水解胶原蛋白换算系数F为5.791、注意事项1、开机预热3分钟，第一个样品测试用蒸馏水代替样品，加碱时间设置为0，使仪器预热。
蛋白质的测定方法比较
蛋白质的测定方法比较一、分光光度法1、测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。
在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2、测定步骤：①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。
取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
按同一方法做试剂空白试验。
②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。
加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。
蛋白质的测定方法有哪些
蛋白质的测定方法有哪些蛋白质测定是一个重要的生物化学实验，用于确定样品中蛋白质的含量和纯度。
目前常用的蛋白质测定方法主要有生物化学方法、光谱法、免疫学方法和质谱法等。
下面将详细介绍这些方法。
1. 生物化学方法：生物化学方法是一种常用的蛋白质测定方法，主要包括低里氏法、比色法和滴定法等。
低里氏法基于酵素反应测定蛋白质含量，其中最常用的是双维小麦胚芽过氧化物酶法。
比色法是通过染色剂和蛋白质的反应来测定蛋白质浓度，常用的比色剂有考马斯亮蓝G-250和布拉德福棕色R-250等。
滴定法是通过滴加蛋白质溶液的滴定剂，如硝酸银溶液和碘溶液等，来测定蛋白质的含量。
2. 光谱法：光谱法是利用蛋白质在特定波长下吸收光线的特性来测定蛋白质的含量和纯度。
UV-Vis吸收光谱法是最常用的光谱法之一，根据蛋白质在280 nm处吸收的特性来测定蛋白质浓度。
近红外光谱法也可以用于蛋白质浓度的测定，因为蛋白质的结构可以在近红外区域引起光的散射和吸收。
3. 免疫学方法：免疫学方法是利用抗体与特定蛋白质发生特异性反应来测定蛋白质的含量和纯度。
常用的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）和免疫沉淀法等。
ELISA是一种高灵敏度的蛋白质测定方法，通过抗原与特异性抗体在单克隆板上的特异性结合来测定蛋白质的含量。
Western blotting是一种常用于检测特定蛋白质的方法，通过电泳分离蛋白质，然后用特异性抗体检测目标蛋白质。
免疫沉淀法利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过共沉淀或差速离心的方式将目标蛋白质从混合物中分离出来。
4. 质谱法：质谱法是一种高分辨率的蛋白质测定方法，主要有质谱光查法（MS）和质谱对比法（MS/MS）两种。
质谱光查法通过蛋白质在质谱仪中的分子离子质量和电荷比来确定蛋白质的分子量和浓度。
质谱对比法则是将待测蛋白质与已知质量的蛋白质进行比较，从而确定样品中蛋白质的含量和纯度。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质是生物体内重要的营养成分，对于人体的生长发育和健康维护起着重要的作用。
因此，准确测定食品、药物、生物样品中的蛋白质含量，对于保障食品安全和科学研究具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，供大家参考。
首先，常用的蛋白质含量测定方法之一是比色法。
比色法是通过蛋白质与某种试剂发生化学反应，产生有色产物，再利用光度计测定产物的吸光度来间接测定蛋白质含量。
其中，最常用的试剂是布拉德福试剂和伯尼斯试剂。
这种方法操作简便，测定结果准确，因此被广泛应用于食品、生物样品的蛋白质含量测定。
其次，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是比浊法。
比浊法是通过蛋白质与某种试剂发生沉淀反应，根据沉淀的浑浊度来测定蛋白质含量。
常用的试剂有硫酸铵和三氯乙醛。
比浊法操作简便，成本低廉，适用于大批量样品的测定。
另外，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是氨基酸分析法。
氨基酸分析法是通过水解蛋白质，然后利用色谱仪或氨基酸分析仪测定水解产物中各种氨基酸的含量，从而计算出蛋白质的含量。
这种方法对于蛋白质的成分分析非常准确，但操作复杂，需要专业设备和技术支持。
最后，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是生物素标记法。
生物素标记法是将生物素标记在蛋白质分子上，然后利用生物素与酶的特异性结合来测定蛋白质含量。
这种方法对于高灵敏度的蛋白质测定非常有效，但需要专门的标记试剂和设备支持。
总之，蛋白质含量的测定方法有很多种，每种方法都有其适用的场合和特点。
在实际应用中，需要根据样品的特点和实验条件选择合适的测定方法，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的几种常用方法能够为大家在蛋白质含量测定方面提供一些帮助。
食品检验中蛋白质测定方法的优化
食品检验中蛋白质测定方法的优化蛋白质是生命体中最基本的大分子有机化合物之一。
食品中的蛋白质是食品物质的重要组成部分之一，因此在食品检验中，蛋白质的测定是十分重要的一项任务。
本文针对食品检验中的蛋白质测定方法进行了优化。
一、传统蛋白质测定方法传统的蛋白质测定方法有生物法、物理法和化学法。
其中，最常用的是低里德氏法、比色法和Nihydrin法。
1. 低里德氏法低里德氏法是一种比色法，根据蛋白质的含氮量来测定。
该方法使用低里德氏试剂，可以与氨基酸中的羧基和氨基反应生成紫色化合物，从而确定蛋白质的含量。
然而，低里德氏法测定结果会受到其他可能存在的还原性或氧化性物质的干扰，有时会导致偏高或偏低的结果。
2. 比色法比色法是一种以蛋白质中含的色氨酸、酪氨酸等氨基酸的吸收光谱为依据的分析方法。
该方法采用紫外分光光度计来测定样品在特定波长范围内的吸收光谱。
虽然比色法测定结果相对准确，但需要精确的仪器和专业的人员才能操作。
3. Nihydrin法Nihydrin法是一种滴定法，可用于定量测定含氨基酸的化合物，常用于测定蛋白质中的肽键。
该法将Nihydrin试剂加入样品中，进行加热反应。
当反应完全进行时，样品会变成紫色，其浓度与含有多少氨基酸和蛋白质有关。
然而，该方法的局限性在于其不能将所有蛋白质定量，因为其中某些氨基酸不与Nihydrin发生反应。
随着科技的发展，食品检验中的蛋白质测定方法也得到了不断的改进和完善。
1. Bradford法Bradford法是一种比色法，是目前用于蛋白质浓度测定最常见的方法之一。
该方法使用Bradford的试剂，试剂可以和蛋白质中的羧基和氨基反应从而生成蓝色化合物。
该法的优点在于，使用简便，测量时间快速，且对多种蛋白质都较为准确。
BCA法是一种化学还原法，它使用BCA试剂可以和蛋白质中的精氨酸等反应，从而生成紫色化合物。
该方法具有快速且准确的测定蛋白质浓度的优点。
3. 红外分析法红外分析法是一种非破坏性分析方法，可以直接对样品进行蛋白质分析。
食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法)
实验:食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
三、仪器与试剂（一）试剂（所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制）1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、浓硫酸（密度为1.8419g/L）4、2%硼酸溶液（20g/L）5、40%氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。
7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图3-所示。
图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤1、样品消化称取样品约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏定氮烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
【实用文档】蛋白质测定的国标规定方法
蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍【GB/T 5009.5—1985】食品中蛋白质的测定方法本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器定氮蒸馏装置：如图所示。
（图略）4 操作方法4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。
取下放冷，小心加20ml水。
放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。
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食品中蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。
但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。
由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。
一凯氏定氮法我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。
(一) 、常量凯氏定氮法衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。
即可计算该样品的蛋白质含量。
一般食品蛋白质含氮量为l6 ％，即1份氮素相当于6.25 分蛋白质,以此为换算系数6.25 ，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同. 如玉米、高梁、荞麦, 肉与肉制品取6.25 ，大米取 5.95 、小麦粉取 5.7, 乳制品取 6.38 、大豆及其制品取5.17 ，动物胶 5.55 。
测定原理：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。
⑴消化反应：有机物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04-T(NH4)2SO4+CO0 +S02f +S03+H3PO4+C02(2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH—2NH3T +2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3B04 (NH4)2B4O7+5H2O(3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O T2NH4CH+4H3BC或(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2试剂与仪器：1、硫酸钾；2、硫酸铜；3、浓硫酸；4、4 %硼酸溶液（饱和溶液）;5、40%氢氧化钠溶液；6、混合指示剂：临用时把（溶解于95%乙醇的）0」％甲基红溶液10毫升和（溶于95%乙醇的0）」％甲基蓝溶液5毫升混合而成；7、0.1N盐酸标准溶液或0.1N硫酸标准溶液；8、凯氏定氮仪一套。
9、定氮瓶500ml二只。
10、三角瓶250ml 3只。
11、量筒50ml、10ml、100ml。
12、吸管10ml。
13、酸式滴定管1支,规格25ml。
14、小漏斗1只。
操作方法：1、样品消化：精密称取0.200-2.00g 固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。
取下放冷，小心加100ml水，放冷。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸，用同一方法做试剂空白试验。
2、蒸馏、吸收：按图装好定氮装置。
接收瓶内加入50ml 4%硼酸溶液及混合指示剂5滴，并使冷凝管的下端插入液面下；将70ml 40%氢氧化钠溶液慢慢通过安全漏斗进入蒸馏烧瓶中，用直火加热蒸馏30分钟，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。
（接收瓶内的溶液呈蓝色）。
3、滴定：以0.1N盐酸标准溶液定至溶液灰色或淡紫色为终点。
同时作一试剂空白测定除不加样品外，丛消化开始操作完全相同。
计算：蛋白质（％）= （（V1-V2）X NX 0.014 X F）X 100/ mV1 :样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml;V2:试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml ；N:硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014 : 1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m样品的质量（体积），g（ml）；F:氮换算为蛋白质的系数。
注：（1 ）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。
（4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6 ）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
（8）氨是否完全蒸馏岀来，可用精密PH试纸试馏岀液是否为碱性。
（9）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（10 ）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（11 ）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往岀现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。
有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu（NH3）4]++下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素：（1）K氏烧瓶和取样量如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800〜1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
（2）分解剂A H2SO4和K2SO4的添加量有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4,但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。
K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g 样品K2SO4：H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例：K2SO4：H2SO4=1Q 20mlB催化剂用作催化剂的有Hg、HgO Se，硒化合物，CuSO4 TiO2，对Hg, HgO有毒但结果好，Se与CuSO4 得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同，HgO消化麦子为38, Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70,所以在给岀测定结果时要注明催化剂的类型。
（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。
（4 ）氨的蒸馏和吸收及滴定蒸馏有两种：1直接蒸馏（装置简便，准确性好）2水蒸汽蒸馏蒸馏加NaOH是50% 加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，贝U NaOH为12X 4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50〜55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S, H2S是强酸，使颜色变红。
吸收液有：1标准H2SO4用标准碱返滴定，甲醛红指示剂2硼酸用HCI进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%〈6〉注意事项a. 样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。
b. 样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。
c. 消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。
d. 在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
e. 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。
f. 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
g. 氨是否完全蒸馏岀来，PH试纸检查馏岀液是否为碱性。
h. 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往岀现褐色沉淀无。
这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
i. 消化剂绿色后继续消化30分钟即可。
2 K氏微量定氮仪法3 K氏半微量定氮仪法(2 、3原理一样)操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。
计算总氮％=(N(V2-V1)X 0.014)/(W X 10/100) X 100对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。
4 K氏自动定氮法原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。
二水扬酸比色法1原理：样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求岀样品含氮量，计算蛋白质含量。
2方法(1)标准曲线的绘制取6个25ml容量瓶编号0 1 2 3 4 5 6分别加空白酸液2ml分别加磷酸盐缓冲液5ml稀释至总体体积至15ml分别加水扬酸钠5ml37C水浴15分钟加入次氯酸钠2.5ml37C水浴15分钟取岀试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。
(2)样品处理：准确称样0.20~1.00g T于K氏瓶中T加15mlH2SO4和5g催化剂电炉上加热到沸腾后加大火力消化T直到岀现暗绿色时T摇动瓶子TK 氏瓶全部消化后T冷却T加水至250ml容量瓶。
(3)样品测定：准确吸取上述消化溶液10ml T于100ml容量瓶中T定容T准确吸2ml T于25ml容量瓶中T加5ml磷酸缓冲液T以下操作与标准曲线绘制的步骤相同并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。