高效薄层色谱HPTLC
色谱基本知识--薄层色谱
g 其他因素
展开方式、点样位置、展开距离、样品浓度等
（2）斑点的显色特性
观察斑点的颜色或荧光，或用专属指示 剂显色与对照品比较定性.
（3）斑点的原位光谱扫描
a 紫外－可见光扫描
颜色斑点:400－780nm扫描
斑点有紫外吸收:200－400nm扫描
斑点的扫描光谱与比较品的扫描光谱比较定性。
b 三维光谱扫描
2.相对比移值
若Rf 值的重现性较差时，可将被分离物质与一 参比物在同一薄层分离。参比物比移值Rf (i)与被测 物比移值Rf(s)之比称为相对比移值。
R i,s
R f i R f s
Ri,s的重现性优于Rf值，数值可大于或小于1。
3. 分配系数与比移值的关系
两相达到分配平衡时，某组分在固定相中的 浓度（Cs）与在流动相中的浓度（Cm）之比称为 分配 系数KD ，即
pH<等电点 向负极移动
为控制电泳速度，必须使用缓冲溶液
—
—
—
—
—
—
R
C
COO-
H+
NH3+
—
NH3+
—
R
C
COO-
R
C
COOH
f 电渗的影响
在电场中，液体对于一个固定的固体表面作相 对运动称为电渗，移动的速度称为电渗速度。 质点的实际泳动速度应等于粒子本身的泳动速度与 电渗速度的向量和。
所以，中性物质在电场中也可能移动
2.4.1点样
薄层板：20cm×20cm 滤纸长度：20~25cm，宽度以样品个数决定。 溶液浓度：0.01~1% 原点直径：3~5mm 原点间距离：2~3cm 点样体积：1~5 L 点样量：10~30 g 点样方式：点状点样、带状点样 点样设备：毛细管、微量注射器、自动点样装置
高效薄层色谱法鉴别6种中药多糖
高效薄层色谱法鉴别6种中药多糖杨成，管佳，章江生，李绍平*（澳门大学中华医药研究院，澳门）摘要：目的鉴别不同来源的中药多糖。
方法采用高效薄层色谱法分析多糖酸水解产物，同时应用2种显色剂以及薄层扫描技术，获得可区别中药多糖的特征图谱。
结果以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5: 5:4.5:1.5:1.5(v/v)为展开剂，7种标准单糖和2种糖醛酸为对照，使用苯胺-二苯胺为糖类成分显色剂，结合茚三酮显色剂检查氨基酸类成分，获得了多糖酸水解产物中两类成分的特征薄层色谱，可用于区分来自冬虫夏草、灵芝、黄芪、人参、西洋参和三七的6种多糖组分。
结论建立了一种可鉴别6种中药多糖的高效薄层色谱法，此法简单快速，经济实用，可以用于多糖类成分质量控制。
关键词：多糖，高效薄层色谱，质量控制，中药Discrimination of Polysaccharides from Six Traditional Chinese Medicines using High-performance Thin-layer ChromatographyYANG Cheng, GUAN Jia, ZHANG Jiang-sheng, LI Shao-ping* (Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao SAR, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To distinguish the polysaccharides from different Traditional Chinese medicines (TCMs). METHODS The acid hydrolyzates of polysaccharides were analyzed by high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) combined with two coloration methods and thin layer scanning technique. RESULTS The chromatography was performed on nano silica gel 60 plate with n-butanol -methanol-chloroform- acetic acid-water (12.5:5:4.5:1.5:1.5, v/v/v/v/v) as mobile phase. 7 monosaccharides and 2 glycuronic acids were used as reference compounds. The aniline-diphenylamine solution and ninhydrin solution were employed for detection of saccharides and amino acids, respectively. The polysaccharides from Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Astragalus memberanaceus, Panax ginseng, Panax quinquefolii and Panax notogiseng were easily discriminated based on their characteristic TLC profiles. CONCLUSION A simple, rapid and effective HPTLC method was developed for distinguishing the polysaccharides from 6 TCMs, which is helpful to control the quality of polysaccharides from Chinese medicine.KEY WORDS: Polysaccharides; HPTLC; Quality control; TCMs多糖是一类由单糖（通常大于10个）通过糖苷键连接而成的生物大分子聚合物，是生物体维持生命活动的必需物质。
讲稿2：薄层色谱法
1 通用显色剂
(1) 浓硫酸或50%的硫酸溶液：极大多数有机物质，喷此 种显色剂后立刻或在加热到110—120℃并经数分钟后出现棕 色到黑色斑点。 (2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿 色背景上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。 常用的通用显色剂还有：5%磷钼酸乙醇、 碱性高锰酸钾 溶液、硝酸银-氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。
17
2. 溶剂蒸气的影响
“边缘效应”：Stahl在用 氯仿-甲醇（95：5）为展开 剂展开麦角生物碱时发现，对 同一种生物碱，在薄层板中部 的Rf值比在边缘的Rf值小，称 此现象为“边缘效应” （edge effect）。
展开槽中被展开剂蒸气饱 和后再进行展开就可以消除。
图5 在未饱和展开槽中薄层板上出现 的“边缘效应”
薄层色谱法
（Thin-layer Chromatography，TLC）
目
一 二 三 四
录
前言 基本参数 薄层层析的操作 特殊的薄层
一.前言
薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种 液相色谱法。即将固定相在玻璃、金属或塑 料等光洁的表面上均匀地铺成薄层，试样点 在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定 相,使被分离的物质展开。
展开剂；如转到A’，B’，C’ 处则又要作另外的选择组合。
9
多元展开剂中各种溶剂的作用
极性较大的溶剂可以使化合物在薄层上移动。 极性较小的溶剂降低极性大的溶剂的洗脱能力，使Rf值降低。 中等极性的溶剂往往起着使极性相差较大溶剂混合均匀的作用。 在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提 高分离度。 用粘度太大的溶剂时需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度， 加快展开速度。 例如环己烷-丙酮-二乙胺-水（10:5:2:5）这个系统中， 水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以 降低分离物质的Rf值，丙酮起着混匀整个系统及降低展开剂粘 度的作用，少量二乙胺的加入控制了展开剂的pH值以使分离后 的斑点不致拖尾，分离清晰。
薄层色谱法汇总范文
薄层色谱法汇总范文薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，简称TLC）是一种广泛应用于化学分析和生化分离的色谱技术。
TLC基于物质在固定相上的吸附、分配和离子交换等作用，在短时间内对混合物进行快速分离、分析和纯化。
以下是对TLC进行详细汇总的相关信息。
TLC的原理基于固液分配平衡，它由一个支撑固相和一个涂覆在其上的液体固相组成。
样品和流动相在固液界面发生相互作用，样品成分通过分配到液体固相中而与流动相分离。
TLC可以用于分离、定量分析、纯化和结构确认。
TLC具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单、低成本的分析技术。
其次，TLC对化合物的纯度和分子量没有特殊要求，几乎能分离出所有的化合物混合物。
此外，TLC使用的流动相和吸附剂非常广泛，适用于不同类型化合物的分离。
在TLC中，选择合适的流动相非常重要。
流动相的组成和性质直接影响着样品的迁移率和分离效果。
一般来说，流动相的极性应与样品的极性相近，以增强样品在色谱板上的移动力和分离效果。
常用的流动相有无机溶剂、有机溶剂和溶剂混合物等。
TLC的应用非常广泛。
在有机合成中，它可用于化合物的分离和纯化。
在药物分析中，TLC可用于对药品进行定性和定量分析。
在食品检测中，TLC可检测食品中的添加剂、农药和重金属等有害物质。
在环境分析中，TLC可以用于监测水样和土壤中的污染物。
此外，TLC还可以用于植物学、天文学和生物医学等领域的研究。
为了进一步提高TLC的分离效果和分析速度，人们对TLC进行了许多改进和发展。
其中，高效薄层色谱（High Performance Thin-Layer Chromatography，简称HPTLC）是一种改良的TLC技术，具有更高的分离效能和分离速度。
与传统TLC相比，HPTLC使用更细的颗粒支撑固相和更小的样品斑点，使得分离更快和更准确。
总之，薄层色谱法是一种重要的化学分析技术，具有快速、简单、低成本和广泛适用于不同领域的优点。
硝基咪唑类药物测定方法——薄层色谱法
硝基咪唑类药物测定方法——薄层色谱法16.1.4.2 测定办法生物基质中硝基咪唑类药物的残留分析主要有免疫学办法(IA)、毛细管电泳法(CE)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和蔼相色谱法(GC)。
早期讨论集中于单个或几个化合物的分析，现在多残留高通量分析办法得到了较快进展。
随着质谱的推广以及该类药物“零残留量”的执行，使得液相色谱-质谱(LC-MS)和蔼相色谱-质谱(GC-MS)办法成为讨论主流。
(1)薄层色谱法(thin layerchromatography，TLC) TLC系将相宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一匀称薄层。
待点样、绽开后，按照比移值(Rf)与相宜的对比物按同法所得的色谱图的比移值作对照，用以举行药物的鉴别、杂质检查或含量测定。
TLC是迅速分别和定性分析少量物质的一种很重要的试验技术。
Meshram等用TLC测定MNZ和咪康唑硝酸盐。
固定相用法硅胶(silica gel 60 GF254)，绽开剂为甲苯--(3.0+2.0+0.6，v/v)，在240nm波长显像光密度计检测。
MNZ、咪康唑硝酸盐的保留因子分离为0.34和0.55；MNZ线性范围为300～700ng/点，咪康唑硝酸盐线性范围600～1400ng/点；采纳标准加入法测得MNZ和咪康唑硝酸盐的回收率分离为100.13%±1.59%(点高度)、98.92%±0.76% (点面积)和99.49±1.58% ( 点高度)、99.63%±1.46%(点面积)。
但该办法未对组织中残留样品举行测定。
高效薄层色谱法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)由经典的TLC进展而来，优点是点样量少，分析时光快，分别度和辨别率好，对样品处理要求最低，操作最简便，LOD可达纳克(ng)至皮克(pg)水平。
Gaugain等报道了用HPTLC 测定猪和家禽组织中DMZ、RNZ、DMZOH残留的办法。
色谱基本知识--薄层色谱
层析 （上行）
点 样
硅胶
硅胶是一种弱酸性的多孔性无定形吸附剂。 硅胶表面有很多硅醇基(－Si－OH)，通过硅原 子上的-OH基团与极性化合物或不饱和化合物形成 氢键而表现出吸附性能。 硅醇基的数目越大，则吸附能力增强。
硅胶也能吸附水分而成为水合硅醇基。
2
Si
—
OH
-H2O
Si
—
O
Si
—
氧化铝
氧化铝由氢氧化铝高温脱水而成。按制备方法不 同，氧化铝可分为三种：
碱性氧化铝：pH = 9～10,可分离合成染料，生物碱等 酸性氧化铝：pH = 4～5，适应于酸性物质的分离 中性氧化铝：pH = 7～7.5，适于分离醛酮，以及对酸碱 不稳定的脂和内酯等化合物
第2章 平面色谱
2.1概述
2.2滤纸及薄层板 2.3平面色谱的流动相（展开剂）
2.4平面色谱的操作方法
2.5高效薄层色谱法（HPTLC）
2.1概述 2.1.1平面色谱法的分类与原理
平面色谱是一种开放式的离线操作色谱， 分类如下： 1. 纸色谱法 2. 薄层色谱法 3. 薄层电泳法
纸色谱法
以滤纸为载体的液相色谱法。 滤纸中的纤维素能吸收20~25%的水分，其中6% 左右的水分通过氢键与纤维素上的羟基相结合，形成 液-液色谱中的固定相。 固定相：滤纸上的结合水 流动相：与水不相溶（或部分相溶）的溶剂 分离原理：被分离物质在两相中的分配系数不 同而分离.
（4）与其他分析技术联用
用平面色谱对粗提物进行分离与纯化，
然后再用其他方法分析、鉴定。
2.4.4定量方法
（1）半定量
a 目测比较法
将一系列已知浓度的对照品溶液与一定量 已知浓度的样品溶液点在同一色谱床上，经展 开定位之后，根据样品与对照品中组分斑点的 颜色深浅和面积大小估计含量。
如何选择RP-HPTLC反相高效预制薄层色谱板
高效薄层色谱实践如何选择RP-HPTLC 反相高效预制薄层色谱板作者：Michael Schulz 和Susanne Minarik自1966年起德国默克公司（Merck KGaA ， EMD, Darmstadt ）就开始为薄层色谱法提供商品预制薄层板。
1975年起该公司推出了HPTLC 高效预制薄层色谱板，1978年开始销售硅胶改性的反相固定相，中等极性固定相系列的薄层板稍晚些时候(1982 －1987)实现了商品化。
Michael Schulz 是目前该公司PC-RLP-SIL （材料和生命化学品研发-硅胶合成）实验室主任，负责薄层色谱板相关技术的研发。
译者按：作为欧洲第二大薄层色谱板生产商的德国MN 公司（MACHEREY-NAGEL ，GmbH & Co. KG ，Düren ）也同样拥有成熟的薄层色谱预制板产品系列，可为用户提供良好的产品体验。
简介平面色谱中的大部分分离任务通常在硅胶、氧化铝或纤维素等极性吸附剂的预制板上完成。
最常用的固定相是6 nm 孔径的硅胶60。
虽然（反相）疏水性薄层具有一些独特的优势，但目前还没有在薄层色谱上得到广泛的应用。
编者按：反相改性（RP-TLC ）的预制板对于所有的化合物类别都具有很广的选择性。
它不再需要复杂的多元展开剂配比，通常2元流动相如甲醇/水或乙腈/水已经够用。
通过调节流动相中水相的比例，保留行为即可得到系统的改变。
由于反相吸附剂的表面活性相对较低，也降低了不稳定化合物在分析过程中产生降解的潜在风险。
相对湿度对于保留行为的影响也变得非常小，这是由于吸附剂的疏水特性和所使用的含水流动相。
反相薄层的另外一个优点是色谱方法可方便地转移到HPLC 法的RP-C18色谱柱上。
本文对改性薄层亲脂的疏水性表面特性对薄层色谱行为的影响通过分离甾醇的实例加以探讨，并对HPTLC RP-18 F 254s 预制板和HPTLC RP-18W F 254s 水可湿性的预制板进行了比较。
黄曲霉素小分子物质夹心法
黄曲霉素小分子物质夹心法1.薄层层析(TLC)法TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法，在薄层板展开后，在365 nm 紫外灯下，黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。
TLC法的特异性较差，灵敏度相对较差，且测定黄曲霉毒素专一性不够，经常引起测量误差。
但由于此法设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用。
2.高效薄层(HPTLC)法HPTLC法测定黄曲霉毒素采用目前国际上流行的样品处理方法——固相萃取法(SPE)中针对真菌和病毒的多功能净化(MFC)柱。
采用MFC柱净化后，仅用单相展开即可达到分离测定的目的，不仅节省了工作时间，提高了工作效率，而且进一步减少了有毒有害溶剂的用量。
Stroka等将免疫亲合柱净化应用于TLC法测定，进行单相展开并用荧光密度计定量，此方法能检测含量明显低于当前欧盟标准的黄曲霉毒素。
Kamimura等用HPTLC方法测定玉米、花生、荞麦等样品，并与通过公职分析化学家协会(AOAC)认证的分析花生及花生制品中黄曲霉素的方法CB(Contamination Branch)法和BF(Best Foods)法进行比较，4种主要黄曲霉毒素的检测限均不高于0.2μg／kg，回收率与CB法一样均高于BF法。
3.高压薄层色谱(OPTLC)法高压薄层色谱于1979年由Tyihak提出，它结合了经典薄层色谱法、高效薄层色谱法与高效液相色谱法的优点，是一种能够提高薄层分离效率的平面液相色谱技术。
随着实验技术的不断成熟，OPTLC法在饲料和食物中黄曲霉毒素的检测方面的应用越来越多。
Eszter Papp等发展了一系列适合检测玉米和小麦中黄曲霉毒素的OPTLC方法。
【高效液相色谱(HPLC)法】由于具有稳定、准确、灵敏等优点，HPLC法已成为当前进行黄曲霉毒素定量研究的首选方法。
分析黄曲霉毒素的液相色谱方法包括正相液相色谱方法(NPLC)和反相液相色谱方法(RPLC)。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)系统易操作，流动相具有低毒性，可同时分离、分析样品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2且不受样品沸点、热稳定性、和分子量限制，所以目前使用荧光检测器的反相HPLC法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法。
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6
①固定相厚度。②展开距离。③展开容器中展开剂蒸汽的饱 和程度。④样品量。⑤操作时的环境湿度和吸附剂含水量。
6
4. 相对比值（relative retardation factor，Rst）
Rst是在一定条件下，待测组分比移值（Rf(i)）与参考物质比
移值（Rf(s)）之比：
Rst
R f (i) R f s
4、防止展开剂脱混
易脱混：多元溶剂极 性差别大，极性溶剂 13 比例小
5、多元溶剂系统展开剂 不可重复使用
13
图示
• back
1、制板（四）TLC的实验操作
– 固定相：硅胶(硅胶H、硅胶G、硅胶GF254)、Al2O3、纤维 素、聚酰胺、葡聚糖凝胶、硅藻土等
– 载板：软板(聚酯薄膜)、硬板(玻璃板) – 粘合剂：CMC-Na 0.3～1%，常用0.5% – 铺板方法
– 边缘效应：即同一种组分在同一块板上，处于边缘的点 的Rf值大于中心点。
• 原因：a、边缘处溶剂挥发快；b、多元溶剂时，易挥发溶 剂在边缘挥发快，从而难挥发溶剂（极性大）相对比例大，
洗脱能力强，使斑点移动快。
（3）展开方式
上行法、下行法、水平展开。
（4）特殊展开技术
连续展开（相当于增加展开距离） 单向多级展开 双向展开 分级展开（自动多步展开仪）
平面色谱法与柱色谱法的分离机理基本相同，操作方式有所区别。 经典柱色谱法的固定相填充于柱管中，流动相靠重力作用流经固定
相，分离过程称为洗脱，流动相也称洗脱剂； 而平面色谱固定相涂布于平面载板上或以纸纤维为平面载体，流动相
通过毛细作用流经固定相，分离过程称为展开，流动相也称展开剂。
本节主要介绍薄层色谱法4 与纸色谱法。
（2）控制斑点大小：一般在2～3mm
18
18
3、展开 • （1）饱和展开
– 饱和展开箱展开是指在展开前，箱内的各种气液达到平衡（饱 和），展开过程中，薄层上的溶剂不再蒸发，重现性好。
• （2）不饱和展开
– 不饱和展开箱展开是指展开箱中气体与溶剂蒸气、薄层未达到 动态平衡时即开始展开；展开过程中，薄层上的溶剂不断地在 薄层表面上蒸发，从而造成结果重现性差及边缘效应
选择吸附剂主要依据样品的性质如：极性、酸碱 性、溶解度等
氧化铝一般适用于碱性和中性物质的分离 硅胶微带酸性适用于酸性和中性物质的分离
12
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（三）展开剂的选择
1、原则：要同时考虑固定相、流动相、 被分离物质的性质。
2、选择合适的Rf值（据展开剂极性） 3、选择较好的选择性（据溶剂 的三角形分类）
20
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4、检出 显色、定位
有色物质直接定位。
无色物质 紫外光下定位（λ254，365）。
荧光定位：发射荧光的物质
在荧光背景下显暗斑的物质（荧光熄灭）
显色定位（化学显色）
I2蒸气（棕黄色）
浓硫酸/MeOH（1:1）或10% 喷雾后，110℃烘烤21
H2SO4-乙醇溶液
专属显色剂
喷雾：人工、机械
Li Ls
式中中心，距离Li，。Ls分别为原点至待测组分i和参考物质s斑点
Rst与Rf相比具有更好重现性和可比性。参考物质可以 选择纯物质加到试样中，也可7 以是试样中的某一已知组
分。Rst可以大于1，也可以小于1。
7
三、薄层色谱
固定相涂布于平面载板上，流动相通常是借 毛细管作用流经固定相，使被分离后的物质保留在 固定相上。— 开放式的离线操作。见图示
若组分k为0，其Rf = 1，表示该组分完全不被固定相保留； 若k为无穷大，其Rf = 0，表示该组分在流动相中浓度为0，
完全被固定相保留，停留在原点，不能被展开。
3. 影响Rf值的因素
影响最大的是固定相、流动相、组分的性质及温度等，
此外，当用同一种固定相、流动相系统时，被测物质Rf 值
还受下列因素的影响：：
定性分析— 窄条 定量分析— 10×20cm
硅胶G：自含粘和剂
硅胶H：不含粘和剂，铺板时另加入 CMC
硅胶HF254：含荧光剂，254 nm 紫外光照发绿
光
17
硅胶HF365：含荧光剂，365 nm 紫外光照发光
表11-3
17
2、点样
（1）控制点样量，防止拖尾1-10μL
点样量 = 样品溶液浓度×点样体积
特点
适用于微量分析（微克级）；
仪器简单，操作方便，灵敏度高，分析快速；
具有多路柱效应，可同时平行分离多个样品；
8
分离样品所需展开剂少，节约溶剂，减少了污染
薄层色谱（TLC）
8
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（一）概述
1．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板
上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法
• 倾注法、浸渍法、机械涂布（自动、手动）（图示）、喷 涂法
– TLP的干燥:先自然干燥，后烘干活化
• 自然干燥时要阴干，否则吸附剂外孔间大量溶剂急剧 挥发，溢出薄层面破坏表面平整，或由于突然受热引 起薄层局部收缩龟裂。
– 板的厚度 • 分析用：0.3～1mm；制备用:1～2mm
٭back
预制板
2．操作过程：见图示
铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/ 洗脱(定量)
3．分类：分离机制 吸附、分配、离子交换、空间排阻
经典薄层色谱（TLC）、高效1薄0 层色谱（HPTLC）、胶束薄 层色谱（MTLC）
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（二）吸附剂的选择
根据被测物极性和吸附剂的吸附能力
被测物极性强——活性低的吸附剂 被测物极性弱——活性高的吸附剂
4
二、平面色谱基本原理
1. 比移值（retardation factor；Rf）
实际操作中，待测组分Rf 在0.2 ~ 0.8 为宜。
2. Rf与k的关系
5
Rf
L L0
L/t L0 / t
r u
R
1 1 k
图12-8 平面色谱展开示意图
5
可见Rf即柱色谱中的保留比R。
组分的k↑，在薄层上移动速度↓，Rf ↓ 。
第十二章 经典液相色谱法（LC）
1
1
经典液相色谱法 LC
吸附色谱法
平面色谱法
• 薄层色谱法 纸色谱法
分配色谱法
聚酰胺色
离子交换
谱法
色谱法
凝胶色谱2 法（分
子排阻色谱法）
2
1. 平面色谱法概述 2. 平面色谱法基本原理 3. 薄层色谱法 4. 纸色谱法
第六节 平面色谱法 3
3
一、平面色谱法概述
平面色谱法是指固定相呈平面状态的色谱法。