等温滴定量热法PPT课件
ITC(等温量热滴定法)
GE Healthcare 公开技术质料
ITC实验注意事项
¾ Wiseman c-parameter：表征结合反应的亲和力与ITC实验设计的关系 c = n[M]K
• 样品池最大容积： VP-ITC：1.4mL ITC200 ：200μL
• 微量注射器最大容积： ITC200 ：40μL
• 单次最小注射量： ITC200 ：0.1μL
• 响应时间： ITC200 ：10s
GE Healthcare 公开技术质料
什么是等温滴定量热法？
等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，简称 ITC） ¾ 定义：
GE Healthcare 公开技术质料
ITC应用举例
评估蛋白产品质量
两个批次的同种蛋白与某一种标准多肽的结合活性比较
KD = 97 nM n=1
第1批蛋白产品 两次ITC实验： 样品池蛋白浓度 10μM 标准多肽50μM GE Healthcare 公开技术质料
KD = 135 nM n = 0.23
h0氢键范德华力疏水作用gehealthcare公开技术质料itc应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除筛选能与目标蛋白tp筛选能与目标蛋白tp特异性结合的化合物已知化合物x可与目标蛋白tp特异性结合性结合根据itc得k与其他实验方法所得结果相吻合与其他实验方法所得结果相吻合因此化合物x适于进一步研究化合物x与tp的itc结果gehealthcare公开技术质料itc应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除与tp左
等温滴定量热法讲解
– 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
– ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术能提 供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固定。ITC 的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常 数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔 结合熵（△S）、摩尔恒压热容（△Cp），和动力学参数(如 酶促反应的Km和kcat）,用来表征生物分子间的相互作用。
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独特特点：
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
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history
built in the secondhalf of the 1960s to study chemical reactions.
During the1970s, the sensitivity of instruments was in the range of mJ, and other first applications were developed such as the study of (metal + ligand) complexes [8] and the adsorption of aromatic compounds by molecular sieves .
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等温滴定量热法讲解
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The inflection points, which reflect the stoichiometry of the formed complexes, are close to one in case of mPEG5kad indicating that each adamantane group is associated with one β-CD molecule. This is in agreement with other reports showing a 1:1 binding stoichiometry between adamantane derivatives and β-CD . In case of mPEG5kchol, the stoichiometry was close to three, which had also been reported previously .The higher order of complexation may be due to self-association of cholesterol and/or partial inclusion of the cholesterol side chain into the β-CD cavity
We found that mPEG5k-chol exhibited a higher binding affinity than mPEG5k-ad
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules.表征小分子的相互作用
等温滴定量热法
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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ITC法测量结合/解离常数
ITC可以直接测量焓变△H，结合常数Ka，而丌对反应体系产生影响，也丌引 12 Page 12 入修饰基团，因此测得的结果更加可信
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作用机理研究与分析开发
（△G）与总的结合亲和力直接 相关，但不能了解结合机理。
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INS
Assessment of biological aPage 5
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量不结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差， 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸 收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持ΔT1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
等温滴定量热法
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滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(Δ G°)、标准状态下的焓变Δ H° 和熵变Δ S°,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)， – 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、 注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
翟丽婷 2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
ITC(等温滴定量热)培训第一课原理介绍
+
- 焓变和熵变均不利，反应不会自发进行
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ITC 在生命科学和药物研发中的应用
• 分析生物分子的相互作用
– 证实结合以及活性 – 确定化学计量比和热力学参数
• 研究任意两个生物分子的相互作用
– 蛋白，核酸，脂质，药物，抑制剂等 – 结构生物学以及结构-活性间的关系
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热力学 1(4)
kcal/mole of injectant
0
Ligand A into
-2
compound X
-4
-6
-8
-10
-12
-14
0
Ligand B into compound X
1
2
3
4
Molar ratio
相同的亲和力和化学计量比，但是 不同的焓变 （热量）
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
等温滴定量热法 (ITC) 的介绍
目标
• 等温滴定量热(ITC)的原理介绍 • 介绍焓，熵和自由能的定义，理解生物分子相互作用和分子识
别 • 常用应用的介绍
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为何使用微量热技术?
无标记
宽广的动态范围
信息丰富
使用方便
• 直接测量热量变 化 (ITC)
这告诉我们不同的结合机制
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热力学 2(4)
DG = RT ln KD DG = DH –TDS
ΔH,焓 （enthalpy），反映氢键和范德华键 的变化
-TΔS, 熵（entropy），反映疏水作用的变化 和/或构象变化
等温滴定量热技术
等温滴定量热技术等温滴定量热技术是一种能够研究溶解热、反应热、吸附热等反应热效应的实验技术，它可以定量测定物质的热化学性质，包括热力学参数、化学反应动力学参数等，是化学和材料学等领域重要的实验手段。
等温滴定量热技术的基本原理是利用微量热法，即将被测样品在等温条件下加入到反应池中，在一定时间间隔内持续注入滴定液，从而发生显著反应，这种反应释放或吸收能量，导致反应体系温度发生变化，采用高精度量热仪测量反应热效应，从而获得样品的热化学性质。
等温滴定量热技术主要分为平衡热量法和动态热量法两种方法。
平衡热量法是通过将反应池维持在等温状态，在一段时间内等待反应体系达到平衡状态，然后进行滴定，测量反应热量。
这种方法可以减小反应过程中外部因素的影响，同时也可以消除热失控导致的误差。
而动态热量法则是在滴定过程中，实时测量反应体系的温度变化，以获得较高的实验精度。
等温滴定量热技术具有以下优点：首先，利用等温条件进行反应，保证了反应的可重复性。
其次，在不需求外热量或热量损失的情况下，可以实现精确测量反应热，避免了因加热或冷却而导致的额外的误差。
最后，由于等温滴定量热技术对样品量非常少，因此可以进行昂贵或危险的试剂或实验条件下的实验。
应用等温滴定量热技术可以获得广泛的信息，例如热容、热力学参数、化学反应速率、表面化学结构和气体吸附等。
在实践中，等温滴定量热技术用于研究各种类型的化学反应，例如溶解、复分解、离子交换等。
它还可以应用于催化剂、生物大分子、纳米材料等重要领域的研究。
总之，等温滴定量热技术是一种非常强大的实验手段，它可以准确地测定物质的热化学性质，从而为学术研究和工业生产提供关键的信息。
随着技术的不断完善，这种实验技术将会发挥越来越重要的作用。
等温量热滴定法
滴定量热法也称热滴定法或测温滴定法。
是一种量热或分析技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化。
滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。
温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。
实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终点）和反应物质的特性（焓变）的数据。
对图进行分析，可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度等信息。
这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH°和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。
测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
图1为滴定量热计框图。
滴定管内含有一种反应物的滴定剂，可加入到反应容器内，滴定剂的浓度一般为被滴定液的数十倍甚至一百倍左右。
反应产生的温度变化由温度传感器（例如热敏电阻）感知，通过惠斯通电桥电路转换为相应的伏特数或热功率。
这个伏特数由放大电路放大并记录于记录仪上，或者馈入其他的数据采集系统。
反应容器和滴定管置于同一恒温浴中，恒温浴温度由温度控制器控制，并由温度传感器测量。
滴定剂和反应容器的温度必须相等，或者它们之间的温差必须精确知道。
滴定剂的加入方式①连续加入法：滴定剂以恒速加入，可以得到滴定进程中热效应的完整记录。
对于特别复杂的反应，可以从这种记录图中选择任意数目的数据点，用于必要的计算。
连续滴定法要求对温度变化的响应必须够快，并且此法只适用于快速反应。
②分次递增加入法：间歇地每次加入单位增量的滴定剂，在每次加入单位增量前，必须调节反应容器的温度，使回复到起始温度，通过加入许多次增量，也能够得到足够的测量数据，从而绘制成与连续法相似的图线。
(最新整理)等温滴定量热法
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
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流程
1、微克级
(最新整理)等温滴定量热法
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等温滴定微量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
林杰
ITC
Isothermal titration calorimetry (ITC) is used to measure the heat adsorbed or released during changes in the composition of a system undergoing a titration process. 等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任 何化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着 加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
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等温曲线
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history
➢built in the secondhalf of the 1960s to study chemical reactions.
➢During the1970s, the sensitivity of instruments was in the range of mJ, and other first applications were developed such as the study of (metal + ligand) complexes [8] and the adsorption of aromatic compounds by molecular sieves .
《等温滴定量热法》课件
实验注意事项
实验安全注意事项
1. 定期维护和检查仪器设备 2. 穿戴实验服和防护手套 3. 室内保持通风
实验结果质量控制
1. 重复实验以确保数据准确性 2. 比对实验结果与文献数据 3. 注意实验条件的一致性
实验应用拓展
等温滴定量热法在生物化学、药物研发和化学反应研究中具有广泛的应用， 可以用于测定反应热效应、反应动力学参数等，为科学家提供有力的实验手 段。
参考文献
相关实验文献
1. Smith, J. R., et al. (2020). Isothermal titration calorimetry: A powerful tool for studying protein-ligand interactions. 2. Chen, S., et al. (2018). Application of isothermal titration calorimetry in drug discovery.
样品处理
准备待测样品，对样品进行处理和纯 化，确保实验的准确性和可靠性。
实验条件设置
设置滴定参数和实验条件，包括温度、 滴定体积等。
实验所需设备及试剂
仪器清单
1. 等温滴定量热仪器 2. 称量仪 3. 恒温搅拌器
试剂清单
1. 样品 2. 溶媒 3. 滴定试剂
实验结果分析
通过对实验中得到的数据进行处理和分析，可以得到反应热效应、平衡常数、 反应速率常数等热力学参数，并解释实验结果的意义。
实验相关资料
1. Johnson, D., et al. (2021). Isothermal titration calorimetry: Technical guidelines and good practice. 2. Gervasio, F. L., et al. (2019). Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and binding affinity quantification.