2010版沙门氏菌检验资料
GB 4789.4-2010食品微生物学检验 沙门氏菌检验
食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB GB 4789.44789.44789.4-20-20-201010北京陆桥技术有限责任北京陆桥技术有限责任公司公司技术服务电话：010-******** 销售服务电话：010-********技术部邮箱：luqiaotech@www. beijinglandbridge .com北京陆桥技术有限责任公司目 录�沙门氏菌简介�2010版国标主要修订内容�沙门氏菌的检验步骤及注意事项�沙门氏菌检验过程中的常见问题www. beijinglandbridge .com 北京陆桥技术有限责任公司沙门氏菌简介�沙门氏菌属沙门氏菌属：肠杆菌科：肠杆菌科�沙门氏菌能引起胃肠炎、伤寒、败血症等人类疾病，严重时能导致死亡。
�种类繁多，抗原结构复杂，种类繁多，抗原结构复杂，在在《ANTIGENIC FORMULAE OF THE SALMONELLA SEROVARS FORMULAE OF THE SALMONELLA SEROVARS》》(2007 9th edition)(2007 9th edition)中已公布了中已公布了2579个血清型个血清型。
�食物是人类感染沙门氏菌的主要途径。
www. beijinglandbridge .com 北京陆桥技术有限责任公司�形态特征：形态特征：革兰氏阴性革兰氏阴性革兰氏阴性、、两端钝圆短杆菌两端钝圆短杆菌，，无芽孢无芽孢，，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和和雏沙门氏菌外，都有周身鞭毛，运动力强�培养特性：需氧或兼性厌氧，10℃~42℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH 为6.8~7.8�革兰氏阴性、需氧或兼性厌氧无芽孢杆菌沙门氏菌简介：生物学特征www. beijinglandbridge .com 北京陆桥技术有限责任公司�修改了标准的中英文名称�修改了标准的范围�修改了培养基和试剂；�修改了设备和材料；�修改了附录修改了附录A A （规范性附录）培养基和试剂2010版国标主要修订内容www. beijinglandbridge .com 北京陆桥技术有限责任公司——关于培养基和试剂的修订说明�修改了修改了HE HE HE琼脂和三糖铁琼脂的配方。
沙门氏菌检验详细流程图
1 mL+SC10 mL 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
BS
XLD（或HE、科玛嘉显色培养基）
36 ℃±1 ℃，40 h～48 h
36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
挑取可疑菌落
TSI，赖氨酸，NA， 靛基质， 尿素 (pH 7.2)， KCN
商 品 化 生 化 H2S+靛基质- 尿素- H2S+靛基质+ 尿 H2S-靛基质-尿素 反应结果与左
为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用 两种以上选择性分离培养基。
进口-SS 进口-SS 国产-SS 进口-HE 国产-HE 进口-XLD 国产-XLD 进口-BS 国产-BS CHRO显色 国产-DHL 国产-WS TSA（对照）
65.3 81.0 52.0 83.2 80.0 83.0 86.2 106.6 77.7 68.4 98.4 71.6 100.0
初筛微生 物
沙门氏菌
柠檬酸杆 菌属
变形杆菌
菌落颜色
紫色(直径约 1mm)
蓝色(直径约 1mm)
无色或被抑 制
特异性 灵敏度
89％ 100%
---
---
(铜绿假单胞菌也呈紫红色， 可以通过前增菌排除。所以推 荐在检测中的前增菌用TTB。 粉红色、深红色、干燥菌落、 边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌 落。）
被分成2500多个血清型。
Vi抗原 O抗原 H抗原
沙门氏菌命名与书写方式
目前的命名方法规定：
肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用 标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且 亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠 伤寒血清型应书写为Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium，但在实际工作中，可简写为S. Typhimurium。
沙门氏菌检验
实验六食品中沙门氏菌的检验一、概述：1.沙门氏菌的形态特征：革兰氏阴性，两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，周身鞭毛，运动力强，具菌毛。
2.沙门氏菌需氧或兼性，10-42℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH 为6.8-7.8。
3.沙门氏菌食物中毒的食品主要为动物性食品，特别是畜肉类及其制品，污染肉类食物的几率很高。
冷冻对沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温仍可存活10个月左右。
意义：沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。
在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列。
因此，沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一。
二、操作步骤：1．前增菌——第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。
2．选择性增菌——在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。
此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。
3．选择性平板分离——这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。
4．生化鉴定——排除大多数非沙门氏菌，提供了沙门氏菌培养物菌属的生理生化鉴定结果。
5．血清学技术——对沙门氏菌属培养物进行血清学分型鉴定，确定菌型。
主要沙门氏菌有2000多个血清型，可先用多价血清鉴定，再用单因子血清鉴定，先有常见菌型的血清鉴定，再用不常见菌型的血清鉴定。
三、实验过程：1.前增菌将样品鸡蛋壳用灭菌棉签查拭蛋壳后，将棉签上部剪掉，下部放入前增菌培养基BPW中，5个棉签放入150mL前增液中，将制备好的预增菌液于37℃培养8-18h。
（样品液变浑浊即可）2.选择性增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取4mL前增菌液转种于40mL TTB选择性增菌液内，于42 ℃±1 ℃培养18h-24h。
如果菌株生长过慢（TTB 培养基需现配现用，每组制备40ml增菌液，需加入816uL的碘液后再加入前增液）。
沙门氏菌检测原始记录
菌落形态
分离培养
BS琼脂
培养条件
HE琼脂
培养条件
生化试验
培养条件
现象
初步判定
三糖铁琼脂
赖氨酸脱羧酶试验培养基
营养琼脂平板
生化反应初步阴性对照
多价菌体抗原（O）
多价鞭毛抗原（H）
检验结果
□25g(mL)样品中未检出沙门氏菌
□25g(mL)样品中检出沙门氏菌
备注
样品编号
样品名称
检验依据
GB4789.4-2010沙门氏菌检验
检验环境
温度： ℃ 湿度： %RH
检验日期
检验地点
□无菌室1 □无菌室2 □阳性对照室 □微生物限度室
仪器设备名称及编号
电子天平:有计量合格标识，并在检定/校准有效期内.
恒温培养箱:有计量合格标识，并在检定/校准有效期内.
电热恒温水浴锅：有计量合格标识，并在检定/校准有效期内.
样品制备
□固体和半固体样品：称取25g样品225mLBPW中，均质1min-2min
□液体样品：吸取25ml样品至盛有225mLBPW的无菌锥形瓶中,振荡混匀
前增菌
将上述样品混匀液于36℃培养8h-18h
增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 ℃培养h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 ℃培养 h；
K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。
沙门氏菌鉴定检验原始记录
检验：审核：报告日期：20年月日
XXXX食品有限Βιβλιοθήκη 司沙门氏菌鉴定检验原始记录
编号：ANST/JL/14
产品名称
生产日期及批号
批量
检验依据
GB4789.4-2010《食品国家安全标准食品中卫生微生物学检验沙门氏菌检验》
检验日期
20年月日
取样地点
1.前增菌：
取检样加入含BPW225mL的无菌均质袋中，拍打min，转入锥形瓶℃培养h；
2.增菌：
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB内，于℃培养h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC内，于℃培养h；
观察结果：□透亮，颜色无变化
□浑浊，颜色异常
3.分离：
分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板。于℃分别培养h（XLD琼脂平板）h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,
表1在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
赖氨酸脱羧酶试验
培养基
初步判断
斜面
底层
产气
硫化氢
注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；初步判断：可疑沙门氏菌属或非沙门氏菌。
表2生化反应初步鉴别表
硫化氢（H2S）
靛基质
pH7.2尿素
氰化钾（KCN）
赖氨酸脱羧酶
反应序号（判断）
注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性；反应序号（判断）：A1、A2、A3或非沙门氏菌。
BS上可疑菌落形态：※菌落颜色：□黑色有金属光泽□棕褐色□灰色□灰绿色
※周围培养基：□呈黑色或棕色□不变□※□其它：
XLD上可疑菌落形态：□粉红色□黄色□黑色中心□全部黑色的菌落□其它：
沙门氏菌检验
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
（4）三糖铁琼脂培养基中亦
含有硫代硫酸钠作为产生硫 化氢之基质，且含硫酸亚铁 作为检测此无色产物之指示 剂，经接种培养后，若微生
物有硫化氢产生，会与亚铁
离子作用生成不溶性硫化亚 铁之沉淀，进而使培养基变 黑。 培养基变黑
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试 验培养基内的反应结果
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
沙门氏菌属生化反应有尽有初步鉴别表
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
丙二酸盐试验 阳性（兰） 阴性（不变）
ONPG试验 阳性（黄） 空白
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
第一天 前增菌培养
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
（3）斜面碱性（红色-）底部碱性（红色-）或无变化（橘 红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件
下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌
氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。 为使结果准确，应于接种培养18-24小时内观察结果，以 确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
• 第二天 增菌培养
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验
• 第三天 接种BS和沙门氏显色平板进行分 离培养
食品安全检验技术（微生物部分）
沙门氏菌检验 第四天 观察分离结果、生化试验
从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂和赖氨素 脱羧酶试验管及对照，并同时在营养琼脂平板上划线分离 培养。
4.沙门菌检验
沙门菌生物学性状
大小0.6～1.0×2～3um，革 兰染色阴性杆菌，无芽胞， 一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)， 多数有菌毛。能运动。新分 离的伤寒沙门菌和一些丙型 副伤寒沙门菌体外有荚膜多 糖。 需氧或兼性厌氧，最适 生长温度为35～37℃，最适 pH值为6.8～7.8。
第二部分
三种检验标准的比对
结合国际标准和原标准的实际使用情况，对原 标准的修订，遵循以下的修订原则： 1．以原国标为基础，保持与原标准的连续性； 2．参照国际分析协会（AOAC）、国际标准组织（ISO）及 美国食品药品管理局（FDA）的有关标准； 3．结合标准的比对实验和验证实验，积极吸取新方法、 新技术，修订标准。
GB4789.4
食品安全国家标准 食品微生物学检验
沙门氏菌检验
内容
第一部分：概述 第二部分：GB/T4789.4-2003,
GB/T4789.4-2008和 GB4789.4-2010系 列标准的比对 第三部分： GB4789.4-2010检验方法讲解
2
概述
沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人 类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似 的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。
沙门氏菌检验程序 GB/T4789.4-2008
36 ℃±1 ℃，8 h～18h
1 mL+TTB 10 mL 42 ℃±1 ℃，18 h～24 h
1 mL+SC10 mL 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
BS
XLD（或HE、科玛嘉显色培养基）
36 ℃±1 ℃，40 h～48 h
36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
25g（ml)样品中检出 或未检出沙门氏菌
中华人民共和国国家标准GB/T 4789.4-2003
沙门氏菌检验
经过几次传代、60℃热处理或石炭
酸处理后容易消失。
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三、 生化反应
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1、吲哚试验( indol test)
细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛 基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用， 生成玫瑰靛基质。 色氨酸→ 吲哚（无色）＋对二甲基氨基苯甲醛→ 玫瑰 吲哚（红色，+ 大肠杆菌）
6
2）H抗原（鞭毛抗原） *H抗原存在于鞭毛中，不耐热，化学成分蛋白质，其
抗原性可以被酒精所破坏。
*H抗原可分为两相 第1相：为特异相，用小写英文字母表示，a～z，Z以后
则从z1、z2……，已编到z83。 第2相：为非特异相以阿拉伯数字表示，共7种。 具有第1相和第2相H抗原的细菌称为双相菌，大多数沙
当指示剂（溴甲酚紫）呈紫色或带红色调的紫色者为阳 性，呈黄色者为阴性。对照管应呈黄色反应。
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4、三糖铁（TSI）琼脂试验
试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物， 穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察 结果。
培养基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚红
② （选择性）增菌：此培养基允许沙门氏菌持续增菌， 同时阻止大多数其他细菌的增殖。未经加工的食品 不必经过前增菌而直接增菌。
1
二、沙门氏菌的生物学特性 1、形态与染色特性：革兰氏阴性短杆菌，无芽孢,
一般无荚膜，周生鞭毛（除鸡白痢沙门氏菌、鸡 伤寒沙门氏菌外），大多数具有菌毛。 2、培养特性：需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上 生长良好，菌落中等大小，无色半透明、圆形、 光滑、湿润。
4
3、生化特性： 大部分发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和山梨酸
不产吲哚（无色，- 产气杆菌）
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沙门氏菌属的生物学特性
培养特性：
沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10～42 ℃都可生长，最适 生长温度为37℃，最适pH为6.8～7.8。 营养琼脂平板上：35～37℃培养18~24h，其菌落大小一 般为2～3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。 血平板上：中等大小的灰白色菌落。 绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也
挑取可疑菌落
TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN
生化鉴定 试剂盒 或全自动 微生物 生化鉴定 系统+
A1
A2
甘露醇+、山梨醇+
A3
ONPG-
反应 结果 与左侧 描述 不符
沙门氏菌，血清学试验
报 告
非沙门氏菌
5、血清学鉴定
a）抗原的准备 一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集 试验用的抗原。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如2 ％～3％） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮 沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓 延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过 装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2 次, 自远端取菌培养后再检查。 返回
蛋白胨水、靛基质试剂 氰化钾（KCN ） 培养 尿素琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 糖发酵管 邻硝基酚 β-D 半乳糖苷 （ONPG）培养基 半固体琼脂 丙二酸钠培养基 沙门氏菌O 和H 诊断血清。 生化鉴定试剂盒
操作步骤
1、前增菌——第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养 基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。 2、选择性增菌——在含选择性抑制剂的促生长培养基中间， 样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增 殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。 3、选择性平板分离——这一步采用固体选择性培养基，抑制 非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的 识别。 4、生物化学筛选——排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门 氏菌培养物菌属的初步鉴定。 5、血清学技术——提供了培养物菌种的鉴定。
生化特性：
有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、
不分解尿素。
沙 门 氏 菌 典 型 群 落
伤寒沙门氏菌
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
National food safety standard
Food microbiologial examination:Salmonella
检样
沙 门 氏 菌 检 验 程 序
25g(ml)样品+225mlBPW
36℃±1 ℃，8h-18h 36 ℃±1 ℃，18h~24h
1ml+TTB10ml
42 ℃±1 ℃，18h~24h
1ml+SC10ml
BS
36 ℃±1 ℃，40h~48h
XLD(或HE、显色培养基)
36 ℃±1 ℃，18h~24h
2010-03-26发布
2010-06-01实施
中华人民共和国卫生部
发布
前
言
本标准代替GB/T 4789.4-2008 《食品卫生微生物检验沙门氏菌检验》。 本标准与GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中英文名称； ——修改了标准的范围； ——修改了培养基和试剂； ——修改了设备和材料； ——修改了附录A。 本标准的附录A、附录B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为： ——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、 GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008
返回
结果与报告
综合以上生化实验和血清学鉴定的结 果，报告25g（ml）样品中检出或未检 出沙门氏菌。
1、增菌
称取25 g （mL ）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min 均质 。 1 min～2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍 打1 min～2 min。若样品为液态，不需要均质， 振荡混匀。如需测定pH 值，用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或HCl 调pH至6.8±0.2。 无菌操作将样 品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直 接进行培养，于 3℃±1 ℃培养8 h～ 18h。如 为冷冻产品,应在45 ℃以下不超过 15 min,或2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。
范
围
本标准规定了食品中沙门氏菌
（Salmonella ）的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌
的检验。
设 备 和 材 料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他还有：
★冰箱：2 ℃～5 ℃。 ★恒温培养箱 ★均质器 ★振荡器 ★电子天平：感量0.1g ★无菌锥形瓶:容量 500mL，250 mL ★无菌试管
b）多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出2 个约 1 cm×2 cm 的区域， 挑取1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一 区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌 体（O）抗血清，在另一区域下部加入1 滴生 理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分 别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾 斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察， 任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 c）多价鞭毛抗原（H）鉴定 同b）。 d）血清学分型 （选做项目）
★无菌培养皿
★无菌吸管 ★无菌毛细管 ★ pH 计或pH 比 色管或精密pH 试 纸 ★全自动微生物生 化鉴定系统
培 养 基 和 试 剂
缓冲蛋白胨水（BPW ） 四硫磺酸钠煌绿（TTB） 增菌液 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增 菌液 亚硫酸铋（BS ）琼脂 HE 琼脂 木糖赖氨酸脱氧胆盐 （XLD ）琼脂 沙门氏菌属显色培养基 三糖铁（TSI）琼脂
沙 门 氏 菌 属 简 介
沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清 学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌 属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现 2000多个血 清型，我国已发现血清型近200个。
形态特征：
革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆 的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和 雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。