心脏舒张功能 Passive Force CaMKII titin

作者：Hamdani N, Krysiak J, Kreusser MM, Neef S, Dos Remedios CG, Maier LS, Krüger M, Backs J, Linke WA 机构：Department of Cardiovascular Physiology, Ruhr University Bochum, Bochum, Germany. 影响因子：15.862
实验结果
固有磷酸化被计算为CaMKII 和PP-CaMKII条件下磷酸化信 号的差异。 （图2A）中 在DKO与WT， N2Btitin磷酸化显著降低，平 均降低了-47%。 （图2B）在TG与WT小鼠心 脏中，N2Btitin磷酸化增加了 近100%。
实验结果
（图3A）松驰液中单层心肌 细胞的被动长度-张力关系在 CaMKIIÄ/ÃDKO中比在WT心 脏中更为明显。 在SL 2.0μm 或更高时，DKO细胞的 Fpassive水平明显高于WT细胞。 （图3B）在SL 2.1μm或更高 的条件下，与WT细胞相比， CaMKIIδ TG心肌细胞的 Fpassive显著降低。
速率，调节钙敏感性。[34–37]在本研究中，我们证明CaMKIIÄ确实磷酸化了心脏titin，并 通过改变基于titin的刚度来影响舒张功能。
实验结果
• 在CaMKIIÄ/ÃDKO中Titin的磷酸化降低，在CaMKIIÄC-TG中增加 • CaMKIIÄ/ÃDKO心肌细胞增殖增加，CaMKIIÄC-TG心肌细胞增殖减少 • CaMKIIδ与心肌细胞敷育降低WT和DKO的Fpassive • 定量质谱法检测PEVK-Titin中保守的CaMKII磷位点 • 用CaMKIIδ体外磷酸化Titin-N2Bus和PEVK片段 • 预测的CaMK/CaMKII依赖性N2Bus/PEVK磷位点 • DKO和TG心脏N2Bus/PEVK位点特异性磷酸化改变 • 用序列特异性Titin抗体抑制CaMKII介导的Titin磷酸化减弱CaMKII对心肌细胞增殖的影响 • 心力衰竭患者Titin-N2Bus/PEVK CaMKII位点磷酸心脏 相比，CaMKIIÄ/DKO中的所有titin 磷酸化显著降低，平均降低了-66%。 （图1E）与匹配的WT心脏相比。 CaMKIIÄC-高表达TG的所有titin磷 酸化显著增加，平均增加了-30%。 （图1C）在TG和WT心脏中，Titin 的组成保持不变。 （图1B）在DKO和WT中，尽管变 化不大，但明显N2BA亚型占比大。
实验结果
（图4A） 小鼠T12869、S12871和 S12884分别对应于人类titin中的 T12007、S12009和S12022。 （图4B和4C）我们表达了重组人 WT-N2Bus和WT-PEVK片段，并检 测了这些结构物的磷酸化。 两个片 段在体外都可以很容易磷酸化。与 WT PEVK相比，3个单点突变株的 CaMKIIÄ介导的磷酸化降低了-30%， 双突变株降低了-60%，三突变株降 低了-80%
磷酸化紊乱发生在心力衰竭中，有助于舒张压的改变。
前言
• 左心室舒张刚度是由细胞外基质和心肌细胞决定的，[2]而且这两种成分在心衰中都比正常 组更多，特别是在射血分数（HFpEF）保持的心衰中。[3，4]在心肌细胞中，被动刚度 （Fpassive）主要归因于巨大的弹性蛋白titin。在HF中，titin的机械性能发生了改变，包 括HFrEF和HFpEF。
新颖性和重要性
• 巨大肌节蛋白titin是心肌被动刚度的主要决定因素。 • 基于Titin的刚度可以通过磷酸化改变。 • 多功能钙/钙调素依赖蛋白激酶II（CaMKII）磷酸化各种心脏蛋白。 • Titin是CaMKII心脏亚型的主要底物。 • CaMKIIδ磷酸化了titin弹簧元件内的保守丝氨酸，从而降低了基于titin的被动刚度。 • CaMKIIδ依赖性的titin磷酸化在心力衰竭中改变，影响titin基础的刚度和舒张功能。
实验结果
（表）我们在DKO中发现6个磷酸化降 低的位点。 S2896（Mut/WT比，0.4）S9144 （Mut/WT比，0.59），后者不在N2B 亚型中表达，而S4672仅存在于罕见的 截短titin亚型中（Mut/WT比，0.66）。 在PEVK段的COOH末端还检测到3个低 磷酸化位点：S12884（Mut/WT比值， 0.63）、T12869和S12871，后者似乎 是低磷酸化协同作用（Mut/WT比值， 0.48；双磷酸化）。
Crucial Role for Ca2+ /Calmodulin-Dependent Protein KinaseII in Regulating Diastolic Stress of Normal and Failing
Hearts via Titin Phosphorylation
文章简介
前言
• 人HFrEF终末期心脏N2BA:N2B表达率增加，同时肌原纤维产量减少。[5,6,10]在HFpEF患 者中，N2BA:N2B比值似乎低于HFrEF。[3,7]
• 心肌细胞Fpassive也可以通过I-带titin的翻译后修饰来调节，如二硫键结合和磷酸化[16]。 • 在心肌肌节水平，CaMKII磷酸化肌球蛋白结合蛋白C和肌钙蛋白I，改变肌力发展和松弛的
实验结果
（图7A和7B）在S4010、S4062 和S11878中观察到HF中的磷酸化 显著增加，而S12022在HF中显示 出明显的高磷酸化趋势。 S4099 未发现明显改变。 （图7C）在心衰心脏和DO心脏 中，我们发现CaMKII的表达和活 性都大约增加了一倍。
讨论
• CaMKII磷酸化对Fpassive有潜在机械作用，并且由于弹性I-带titin区域的磷酸化影响心肌细胞 Fpassive，[8，18，19]，I-带titin内有CaMKII依赖的磷酸位点。在N2BA和N2B心脏titin亚型 的N2Bus和PEVK-弹簧元件中发现了保守的CaMKII位点，CaMKII介导的磷酸化降低了心肌 细胞的Fpassive。
摘要
• 原理：心肌舒张刚度和心肌细胞被动力（Fpassive）在一定程度上依赖于titin亚型组成和磷酸 化。
• 目的：探讨CaMKII对正常和衰竭心肌的titin磷酸化及Fpassive的调节作用。 • 结论：CaMKII在保守的丝氨酸/苏氨酸处磷酸化titin，从而降低Fpassive。CaMKII依赖性titin
实验结果
用Weste blot法研究了CaMKIIÄ/ÃDKO、CaMKIIÄC-TG 和匹配的WT小鼠心脏中的位点特异性titin磷酸化。 对于 每一种磷酸特异性抗体，使用相应的序列特异性抗体来 监测蛋白质负载（图5）。 （图5A和5B）在DKO与WT中，S3991和S12742处的磷 酸化未发生改变，但在S4043、S4080和S12884处显著 降低。 在S4043和S12884处观察到最大的减少。 （图5C和5D） 在TG与WT中，S4080、S12742和 S12884处的磷酸化未改变，但在S3991和S4043处显著 增加。 S4043（N2Bus）和S12884（PEVK）是CaMKII的主要 位点
实验结果
（图6A）CaMKIIÄ诱导的所有titin（离体）磷酸化的增加，在 用两种针对N2Bus和PEVK的抗宿主titin抗体混合孵育WT小鼠 心脏组织（用碱性磷酸酶预处理）时减弱。 （图6B）作为对照，组织与抗人titin抗体一起孵育到不识别小 鼠titin的序列，这种非特异性抗体并不能阻止CaMKIIÄ诱导的 所有titin磷酸化的显著增加。 （图6C）用抗宿主titin抗体混合物孵育单层小鼠心肌细胞可减 弱卡姆基治疗后的Fpassive下降。 （图6D）当心肌细胞与非结合性抗人titin抗体孵育时，没有发 现这种钝化效应。 这些结果表明，S4043或S12884处CaMKII依赖性磷酸化或两 者都调节基于titin的Fpassive。
• 两个主要的titin亚型在哺乳动物心脏中表达，N2B（3000 kDa）和N2BA（>3200kDa）。 由选择性剪接产生的titin亚型，其位于肌节I带的弹性段的分子长度有很大的不同。[11]该片 段包含3个可扩展的分子弹簧元件[15]：免疫球蛋白（Ig）样结构域；PEVK结构域（富含 脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸和赖氨酸）；以及心脏特异性N2B元件内的唯一序列，即titin N2B唯一序列（N2Bus）[11-13]。