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工艺07 第四章 灭菌与空气的净化.
利用热空气将微生物 体内的蛋白质氧化进 行灭菌 利用高温蒸汽将物料 的温度升高使微生物 体内的蛋白质变性进 行灭菌 用射线穿透微生物细 胞进行灭菌
利用化学试剂对微生 物的氧化作用或损伤 细胞等进行灭菌 利用过滤介质将微生 物菌体细胞过滤进行 除菌
特点
适用范围
方法简单、灭菌彻底、 适用于接种针、玻璃
但适用范围有限。
2、喷射加热——真空冷却连续灭菌流程
3、薄板换热器连续灭菌流程
利用冷培养液作冷却剂，即冷却了热培养基， 又预热了冷培养基，节约用水和蒸汽。
间歇灭菌
又称实罐灭菌，实消，是在每批培养基全 部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热 至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接 种温度。此法对设备要求简单，灭菌可靠， 无需专门的灭菌设备，投资少，是中小型 工厂厂采用的一种方法。
判断采用高温或是在低温条件下杀菌是由该反应的 活化能的大小决定。灭菌温度升高时，微生物杀死 速率的提高要超过营养成分破坏的速率。在灭菌度 相同的条件下，Nt=常数，因而高温K值增大，时 间必定大大缩短，营养物质总的损失可以减少，因 此高温短时灭菌比低温长时要好。此为灭菌动力学 得出的最重要的结论之一。
湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体内 的蛋白质发生凝固作用而致死。 由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量 的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是 目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。一 般条件为：121℃，30 min。
火焰灭菌法
利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭 菌彻底，但适用范围有限，接种针、玻璃棒等。
） 0.1-0.25%
器物消毒浸泡 30 min 作用10-15min
加热熏蒸4h
浸泡30min
化学消毒剂方法的局限性
利用化学试剂对微生 物的氧化作用或损伤 细胞等进行灭菌 利用过滤介质将微生 物菌体细胞过滤进行 除菌
特点
适用范围
方法简单、灭菌彻底、 适用于接种针、玻璃
但适用范围有限。
2、喷射加热——真空冷却连续灭菌流程
3、薄板换热器连续灭菌流程
利用冷培养液作冷却剂，即冷却了热培养基， 又预热了冷培养基，节约用水和蒸汽。
间歇灭菌
又称实罐灭菌，实消，是在每批培养基全 部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热 至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接 种温度。此法对设备要求简单，灭菌可靠， 无需专门的灭菌设备，投资少，是中小型 工厂厂采用的一种方法。
判断采用高温或是在低温条件下杀菌是由该反应的 活化能的大小决定。灭菌温度升高时，微生物杀死 速率的提高要超过营养成分破坏的速率。在灭菌度 相同的条件下，Nt=常数，因而高温K值增大，时 间必定大大缩短，营养物质总的损失可以减少，因 此高温短时灭菌比低温长时要好。此为灭菌动力学 得出的最重要的结论之一。
湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌。使微生物体内 的蛋白质发生凝固作用而致死。 由于蒸汽有很强的穿透力，冷凝时放出大量 的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是 目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法。一 般条件为：121℃，30 min。
火焰灭菌法
利用火焰直接把微生物杀死。方法简单、灭 菌彻底，但适用范围有限，接种针、玻璃棒等。
） 0.1-0.25%
器物消毒浸泡 30 min 作用10-15min
加热熏蒸4h
浸泡30min
化学消毒剂方法的局限性
第6章 灭菌及空气净化
(2)蒸料要求
达到熟、软、疏松、不粘手、无夹心，产生熟 料固有的色泽和香气
(3)蒸料过程中蛋白质变化
蛋白质适度变性：若在一定的热力作用下，蛋白 质的二、三、四级结构被破坏，严格的空间排列 被打乱；而一级结构未发生变化。 二次变性（过度变性）：蛋白质进一步变性，分 子结构发生改变。
图中说明，AB曲线的左侧，为原料中残留的未变性蛋白质；CD曲线的 右侧表示蛋白质的二次变性。在AB和CD两曲线之间区域表示蛋白质变 性适度。同时还说明蒸煮压力越高，所需蒸料时间越短，时间控制范 围越小，这就要求时间控制要精确
保 温 阶 段
5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压 和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。 在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各 管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道 则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底， 不留死角。
降 温 阶 段
6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀； 待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通 入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使 培养基降至所需温度。
细胞个数减少速率与残存菌个数:
N----菌的残留个数 t----灭菌时间（s） k----菌死亡的反应速度常数（1/min）
⑵理论灭菌时间的确定
对数残留定律的概念：
—— 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡 的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。 数学表达式：
- dN/d = N
一、常用灭菌方法及原理
1、化学物质灭菌 2、辐射灭菌 3、干热灭菌 4、湿热灭菌☆
一、常用灭菌方法及原理
• 1、化学物质灭菌
甲醛、苯酚、氯化汞、戊二醛 消毒灭菌中使菌体细胞蛋白质变性、改变细 菌细胞膜透性或干扰细菌的酶系统，导致菌 体死亡或生长受抑制。 加入后不易去除，不适于培养基灭菌，只适 于局部空间或某些器械消毒。
培养基灭菌与空气净化培训
培养基灭菌与空气净化培训一、引言在微生物实验室和生物制药等领域中，保持培养基的无菌状态以及空气质量的洁净是非常重要的。
为了确保实验结果的准确性和产品的质量，培养基灭菌和空气净化是必不可少的环节。
本文档旨在为实验室和生物制药相关人员提供培养基灭菌与空气净化的培训内容，包括培养基灭菌方法、灭菌设备的选择与操作、空气净化的原理与方法等。
通过培训，希望能够提高各位实验人员对培养基灭菌与空气净化的认识和技能，提升实验室和生产环境的无菌水平。
二、培养基灭菌方法培养基灭菌是指通过外部手段将培养基中的微生物杀灭，防止其污染实验结果。
常用的培养基灭菌方法包括物理灭菌和化学灭菌两种。
2.1 物理灭菌物理灭菌是通过提高温度、压力或辐射等手段来杀灭微生物。
常见的物理灭菌方法有：1.高温灭菌：将装有培养基的容器放入高压高温灭菌器中，在高温高压条件下进行灭菌，常用的温度和时间为121℃/15分钟。
要注意灭菌器的压力和温度控制，以确保达到有效的灭菌效果。
2.剂量灭菌：利用辐射源如紫外线、X射线或γ射线等，照射培养基以达到杀灭微生物的目的。
剂量灭菌需要严格控制辐射剂量，以免对培养基中的营养成分产生不良影响。
2.2 化学灭菌化学灭菌是通过加入能够杀灭微生物的化学物质来实现培养基的灭菌。
常用的化学灭菌方法包括：1.干热灭菌：将装有培养基的容器放入干热灭菌器中，在高温、低湿的条件下进行灭菌。
干热灭菌的温度和时间根据具体需求和培养基成分而定。
2.过滤灭菌：通过将培养基用0.22μm孔径的微孔膜过滤，阻挡微生物进入，达到灭菌的目的。
过滤灭菌适用于无法承受高温或辐射的特殊培养基。
三、灭菌设备的选择与操作选择合适的灭菌设备以及正确的操作方法是保障培养基灭菌效果的关键。
根据需要和实验条件，常见的灭菌设备有高压高温灭菌器、干热灭菌器和紫外线灭菌器等。
3.1 高压高温灭菌器高压高温灭菌器是常用的物理灭菌设备，适用于大部分常规培养基的灭菌。
在使用高压高温灭菌器时，应注意以下操作要点：1.根据培养基的特点和厚度合理选择灭菌温度和时间，避免对培养基造成损害。
第四章灭菌与空气净化
= 2.303 lgN0/N /
121℃某些细菌芽孢的值
细菌芽孢名称
枯草芽孢杆菌FS5230 硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518
值 min-1
3.8-2.6 0.77
硬脂嗜热芽孢杆菌FS617
产气梭状芽孢杆菌PA3679
2.9
1.8
4、灭菌温度与时间的选择
培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基 成分被破坏，如在加热条件下氨基酸、维生素等受破坏。
对数残留定律的概念：
—— 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死 亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定 律。 数学表达式：
- dN/d = N
N —— 培养基中残存活的微生物个数； —— 死亡时间，即杀菌时间（s）; —— 比死亡速率（s-1） (死亡速率常数) dN/d —— 微生物的瞬间变化率，即死亡速率
温度由T1升高到T2，值分别为：
1= A e 2= A e
－ ——— R T1
E
－——
R T2
E
相除取对数
2 E 1 － 1 ln = 〔 〕 1 R T1 T2
同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：
ln
2 ′ 1 ′
〔T T 〕 = R 1 2
E ′1
1
上面两式相除，得
◆
培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养 基成分破坏减至最少的条件。
◆
灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残 留定律表达式可知）。
◆
在其它条件不变时，比死亡速率与温度的关系可用阿仑尼 乌斯方程式表示。
◆
Svante August Arrhenius
5第五章 灭菌与空气的净化
• 培养基中的含菌数以1mL培养基的含菌数 来计算，计算公式如下： • t=2.303/klg(c0/ct)
• C0－单位体积培养基灭菌前的含菌个数，个/mL • Ct－单位体积培养基灭菌后的含菌个数，个/mL
例 题
• 有一发酵罐内装40m3培养基，在131℃温度下进行 连续灭菌。原污染程度为每1mL有2×105个耐热细 菌芽孢，131 ℃时灭菌速度常数为1.5min-1。求灭 菌失败几率为0.001时灭菌所需要的维持时间。
ψ通常必要的灭菌条件是110～130℃，5～ 20min。 ψ芽孢对热耐受强，并不始终符合对数残留定 律。 ψ培养液灭菌多采用高温短时间加热的方式。 ψ一般以芽孢细菌和细菌芽孢的数量合作为依 据来计算灭菌时间。 ψ在实际操作中，要达到Nt＝0，即t为∞，是 不可能的，因此，在设计时常采用
(1)/(2)
ln(k' /k' ) 2 1
E’
>1
灭菌时活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E’
ln(k2/k1 ) ln(k'2/k'1 )
>1
ℓ所以，随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养 成分分解的速率常数的增加 ℓ 灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高超过了培养基营养成分破 坏的速度 ℓ 温度升高时，微生物死亡的速度更快
氧化剂
过氧化氢 过氧乙酸
卤素类 醇类
碘液 乙醇 石炭酸
酚类 来苏 表面活性剂 酸碱类 新洁尔灭 生石灰
染料
龙胆紫
2～4
表浅创伤消毒
二.湿热灭菌的原理及影响因素
1. 湿热灭菌的原理
湿热灭菌：就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时 释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热 破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物 因代谢障而死亡。
发酵工程第7章 灭菌与空气净化
• 2．常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是 用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适 于一般生产单位和专业户使用。大小可 根据需要而定，但最大的锅每次装料也 最好不超过500公斤。 3．烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干 燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。
5.1.5 培养基的灭菌
• (一）湿热灭菌的基本原理：
消毒试验
• ⑴ 以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面 污染大肠杆菌液。
• ⑵ 消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭 于含5ml稀释液试管中沾湿， 在规格板空心处旋 转自左至右涂抹整个区域
第五章 发酵工厂灭菌与空气净化
• 第一节 严格消毒灭菌 • 第二节 空气除菌
第一节 严格消毒灭菌
5.1.1 严格消毒灭菌
• 控制有害微生物主要有以下几种措施
（一）灭菌（sterilization）
• 指利用物理和化学的方法杀灭或 除去物料及设备中一切微生物的过程， 称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。
• 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前 者指菌体虽死，但形体尚存，后者则 指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消 失的现象 。
（二）消毒（disinfection）
• 从字义上来看，消毒就是消除毒害， 这里的“毒害”就是指传染源或致病菌 的意思，英文中的“dis-infection”也是 “消除传染”的意思。
• （5）在大规模发酵工业中，可采用连续 加压灭菌法进行培养基的灭菌
• 5.1.4灭菌设备
• l、高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型 号很多。
• 手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。
• 立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种 培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。
• 灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培 种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。但 投资太大，适合大型菌种场使用。
灭菌与空气净化
第三章 灭菌与空气净化
第三章 灭菌与空气净化
1. 概念 2. 常用的灭菌方法 3. 发酵工业培养基灭菌 4. 空气净化
3.1 概念
灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除 物料或设备中所有微生物的过程。
消毒:用物理或化学的方法杀灭或去除 物料或设备及环境中的病原微生物，不 能杀死芽孢。
3. 2 常用的灭菌方法
空消：将高压蒸气直接通发酵罐灭菌
连续灭菌：又称连消，培养基先灭菌, 后 通入空消的发酵罐
配料罐 连消塔
20s-30s 126-132
维持塔 冷却管 发酵罐
5-7min
40-50
配液设备
（二）培养基灭菌设备
2. 加热设备：在配料罐里培养基被加热到70℃， 然后，用泵送到加热设备，在20秒的时间内继续 加热到130～140℃。常用的加热设备有塔式和喷 射式两种。
手提式压力蒸汽灭菌器灭菌方法： ①在主体内加入适量的蒸馏水，放入待灭菌物； ②将顶盖上的排气管插入内壁的管中，盖盖并拧紧； ③将灭菌器的热源打开，开启排气阀排完空气后关 闭排气阀； ④温度达121℃，维持到规定时间（20min~30min） ⑤需要干燥的物品，打开排气阀，慢慢放气，待压 力恢复到零位后开盖取物。 ⑥液体类物品，待压力恢复到零位，自然冷却到 60℃以下，再开盖取物。
灭菌条件为：160℃------170℃，1 ---1.5 h。 用于灭菌后器具的干燥保存
２. 湿热灭菌
湿热灭菌法：是将待灭菌物品置于加压的饱 和蒸气中进行灭菌的方法。饱和蒸气潜热大， 穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固、酶失 活，灭菌效率较干热空气灭菌法高。
适用范围： 用于耐高温、耐高湿的医疗器械和物料的灭菌。
4）盘、盆、碗等器皿类物品，尽量单个包装；包装时 应将盖打开；若必须多个包装在一起时，摞放时，
第三章 灭菌与空气净化
1. 概念 2. 常用的灭菌方法 3. 发酵工业培养基灭菌 4. 空气净化
3.1 概念
灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除 物料或设备中所有微生物的过程。
消毒:用物理或化学的方法杀灭或去除 物料或设备及环境中的病原微生物，不 能杀死芽孢。
3. 2 常用的灭菌方法
空消：将高压蒸气直接通发酵罐灭菌
连续灭菌：又称连消，培养基先灭菌, 后 通入空消的发酵罐
配料罐 连消塔
20s-30s 126-132
维持塔 冷却管 发酵罐
5-7min
40-50
配液设备
（二）培养基灭菌设备
2. 加热设备：在配料罐里培养基被加热到70℃， 然后，用泵送到加热设备，在20秒的时间内继续 加热到130～140℃。常用的加热设备有塔式和喷 射式两种。
手提式压力蒸汽灭菌器灭菌方法： ①在主体内加入适量的蒸馏水，放入待灭菌物； ②将顶盖上的排气管插入内壁的管中，盖盖并拧紧； ③将灭菌器的热源打开，开启排气阀排完空气后关 闭排气阀； ④温度达121℃，维持到规定时间（20min~30min） ⑤需要干燥的物品，打开排气阀，慢慢放气，待压 力恢复到零位后开盖取物。 ⑥液体类物品，待压力恢复到零位，自然冷却到 60℃以下，再开盖取物。
灭菌条件为：160℃------170℃，1 ---1.5 h。 用于灭菌后器具的干燥保存
２. 湿热灭菌
湿热灭菌法：是将待灭菌物品置于加压的饱 和蒸气中进行灭菌的方法。饱和蒸气潜热大， 穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固、酶失 活，灭菌效率较干热空气灭菌法高。
适用范围： 用于耐高温、耐高湿的医疗器械和物料的灭菌。
4）盘、盆、碗等器皿类物品，尽量单个包装；包装时 应将盖打开；若必须多个包装在一起时，摞放时，
第三章 灭菌与空气净化
空气净化
1．空气净化方法 不同菌种、培养过程、培养基pH值，对空 气灭菌的要求也不相同。 空气净化的方法很多，适用于供给发酵需 要的大量无菌空气的除菌方法主要有以下 几种：
（1）加热灭菌：空气在进入培养系统前， 一般都需用压缩机压缩以提高压力。 压缩机在活塞高速运行和空气被压缩的过 程中会产生大量的热，被压缩空气温度可 达200℃左右，保持一定时间便可达到灭菌 目的。 空压机进口空气温度提高，则出口空气温 度也提高。
（1）干热灭菌法：在干燥高温条件下， 微生物细胞内各种与温度有关的氧化反应 速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增 加的过程。如火焰灼烧、电热干燥箱等。 干热灭菌所需温度一般为160℃~170℃， 1 h~1.5h。
（2）湿热灭菌法：是指利用加压的饱和蒸 气对物料或设备容器进行灭菌的方法。 蒸气具强大穿透力，冷凝时放出大量潜热， 极易使微生物细胞中的蛋白质发生不可逆 的凝固变性，使微生物在短时间内死亡， 蒸气冷凝形成的水分使蛋白质更易变性， 且变性温度显著降低。
实 罐 灭 菌 设 备 示 意 图
连续灭菌：也称连消。培养基在发酵罐外 经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却 后送入空消后的发酵罐的灭菌法。 空消即空罐灭菌，指通入蒸气对末加培养 基的空罐内部进行湿热灭菌。 连续灭菌时料液在配料罐中配料后，由连 消泵送入连消塔底端，料液在20 s~ 30 s 内被直接蒸气立即加热到灭菌温度 126℃~132℃，由顶部流出，进入维持罐 维持保温5min~7min，罐压保持在 0.4MPa，然后进入冷凝管冷却。 一般冷却到40℃~50℃后送入预先空消的 贮罐内。
（1）冷热空气直接混合除菌流程
压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分 进入冷却器冷却到较低温度，经分离器分离 油、水后，与另一部分未处理的高温压缩空 气混合，混合后（温度为30℃~35℃，相对 湿度为50％~60％）进入过滤器过滤。 此流程适用于中等湿含量地区，其特点是可 省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设 备，流程较简单，热能利用合理，但操作要 求较高，要经常根据气候条件调节两部分空 气的混合比。