培养基灭菌与空气净化
无菌技术基本操作流程
无菌技术基本操作流程无菌技术是现代生物学和医学领域中非常重要的一项技术，用于防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。
无菌技术的基本操作流程如下：1. 实验室准备在进行无菌技术操作之前，首先要准备好实验室环境。
实验室应保持整洁干净，操作台面和仪器设备要进行彻底的清洁和消毒。
同时，准备所需的培养基、培养皿、试管、移液器等实验用具，并确保其无菌。
2. 消毒操作在进行无菌技术操作之前，必须进行消毒操作，以杀灭空气中的微生物。
常用的消毒方法包括用75%乙醇擦拭操作台面、试管架和实验器皿，并对培养基、培养皿进行高压蒸汽灭菌。
3. 空气净化无菌技术操作时需要保持操作环境的空气净化。
可以使用超净工作台或无菌层流罩等设备，保持空气中的微生物数量低于一定标准。
在操作过程中，操作者应注意尽量减少对操作空间的污染，避免摇晃操作台面，以减少气流扰动。
4. 穿戴防护服无菌技术操作时，操作者必须穿戴防护服，包括实验服、帽子、口罩、手套和鞋套等。
防护服的目的是防止操作者的皮肤、呼吸道和头发等对操作环境产生污染。
5. 操作技巧在进行无菌技术操作时，操作者应掌握正确的操作技巧。
首先，要保持双手的清洁，使用无菌手套，并经常更换新的手套。
其次，要注意避免操作过程中的直接接触，使用无菌的移液器等工具进行操作。
此外，要注意避免试管口与环境接触，以防止试管口的污染。
6. 培养基接种在进行无菌技术操作时，常常需要进行培养基的接种。
接种前，首先要将培养基加热至液态，并在无菌条件下打开培养皿盖。
然后，使用无菌的移液器将待接种的微生物转移到培养皿中，并迅速将盖盖好。
接种后的培养皿要进行彻底的密封，以避免空气中的微生物进入。
7. 培养条件控制在进行无菌技术操作时，要控制好培养条件，使微生物能够正常生长。
通常需要控制温度、湿度和氧气等因素。
不同微生物的培养条件可能有所不同，操作者应根据实际情况进行调整。
8. 结果判断在进行无菌技术操作后，需要根据培养结果来判断是否成功。
无菌技术的原则
无菌技术的原则一、引言无菌技术是指在实验室或生产环境中，采取一系列措施，以保证实验材料或产品不受外界微生物污染的技术。
无菌技术广泛应用于生物医药、食品加工等领域，其重要性不言而喻。
二、无菌技术的原则1. 空气净化空气是微生物传播的主要途径之一，因此，在进行无菌操作时，必须保证空气的洁净度。
通常采用高效过滤器和UV灯等设备对空气进行净化处理。
2. 器具消毒所有与实验材料或产品接触的器具都必须经过消毒处理。
消毒方法有多种，如高温蒸汽灭菌、化学消毒等。
3. 人员防护人员是微生物传播的另一个重要途径。
因此，在进行无菌操作时，必须采取一系列防护措施，如穿戴洁净衣服、戴口罩和手套等。
4. 区域划分为了避免不同区域之间的交叉污染，应将实验室或生产环境划分为不同的区域，并采取相应的措施对不同区域进行隔离。
5. 操作规范无菌操作需要严格按照操作规范进行，如在无菌条件下打开器具、使用无菌棉签等。
6. 实验材料或产品处理实验材料或产品也是微生物传播的来源之一。
因此，在进行无菌操作时，必须对实验材料或产品进行适当的处理，如消毒、过滤等。
三、常见的无菌技术1. 灭菌灭菌是指将器具、介质等杀死所有微生物的方法。
常见的灭菌方法有高温蒸汽灭菌、化学消毒等。
2. 过滤过滤是指通过孔径较小的过滤器将微生物过滤掉。
常见的过滤器有0.22μm孔径的滤膜。
3. 压差检测压差检测是指通过检测过滤器两侧压差来判断过滤器是否堵塞。
当压差超过一定值时，需要更换过滤器。
4. 空气监测空气监测是指通过采集空气样品并培养分析来判断空气中微生物数量及种类。
常见的空气监测方法有活菌计数法、PCR等。
四、无菌技术的应用1. 生物医药领域无菌技术在生物医药领域中应用广泛，如制备无菌培养基、细胞培养、疫苗制备等。
2. 食品加工领域无菌技术在食品加工领域中也有重要应用，如罐头食品的生产、乳制品的生产等。
3. 环境监测无菌技术也可以用于环境监测，如对医院手术室、食品加工车间等进行空气监测和表面检测。
第6章 灭菌及空气净化
(2)蒸料要求
达到熟、软、疏松、不粘手、无夹心，产生熟 料固有的色泽和香气
(3)蒸料过程中蛋白质变化
蛋白质适度变性：若在一定的热力作用下，蛋白 质的二、三、四级结构被破坏，严格的空间排列 被打乱；而一级结构未发生变化。 二次变性（过度变性）：蛋白质进一步变性，分 子结构发生改变。
图中说明，AB曲线的左侧，为原料中残留的未变性蛋白质；CD曲线的 右侧表示蛋白质的二次变性。在AB和CD两曲线之间区域表示蛋白质变 性适度。同时还说明蒸煮压力越高，所需蒸料时间越短，时间控制范 围越小，这就要求时间控制要精确
保 温 阶 段
5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压 和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。 在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各 管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道 则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底， 不留死角。
降 温 阶 段
6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀； 待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通 入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使 培养基降至所需温度。
细胞个数减少速率与残存菌个数:
N----菌的残留个数 t----灭菌时间（s） k----菌死亡的反应速度常数（1/min）
⑵理论灭菌时间的确定
对数残留定律的概念：
—— 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡 的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。 数学表达式：
- dN/d = N
一、常用灭菌方法及原理
1、化学物质灭菌 2、辐射灭菌 3、干热灭菌 4、湿热灭菌☆
一、常用灭菌方法及原理
• 1、化学物质灭菌
甲醛、苯酚、氯化汞、戊二醛 消毒灭菌中使菌体细胞蛋白质变性、改变细 菌细胞膜透性或干扰细菌的酶系统，导致菌 体死亡或生长受抑制。 加入后不易去除，不适于培养基灭菌，只适 于局部空间或某些器械消毒。
几种无菌技术操作方法
几种无菌技术操作方法
无菌技术是一种重要的实验室操作方法，用于防止细菌、病毒和其他微生物的污染。
以下是几种常用的无菌技术操作方法：
1. 灭菌：将实验室器具、培养基、培养皿等物品暴露在高温或化学物质中，以杀灭所有微生物。
常用的灭菌方法包括高压蒸汽灭菌（autoclaving）和干热灭菌（dry heat sterilization）。
2. 空气净化：使用高效过滤器（例如HEPA过滤器）过滤空气中的微生物，以减少实验环境中的微生物数量。
3. 灭火：使用火焰对实验器具进行灭菌处理，例如对培养皿盖进行灭菌，或在实验过程中将工具头置于火焰中。
4. 剥离、涂气体或固体培养基：在无菌环境下，使用微量吸球将微生物转移到培养基上，或使用无菌棉签涂抹在固体培养基上。
5. 消毒擦拭：使用消毒剂润湿无菌纸巾，轻轻擦拭实验台面、操作区域和实验仪器，以消除表面的微生物。
6. 无菌操作罩：在无菌操作罩中进行实验操作，通过过滤器过滤空气中的微生物，以防止实验材料受到污染。
这些无菌技术操作方法的选择和使用取决于实验的特定要求和所处理材料的性质。
无论采用哪种方法，都需要注意操作过程的无菌操作和实验环境的清洁，以确保实验结果的准确性和可靠性。
培养基灭菌与空气净化培训
培养基灭菌与空气净化培训一、引言在微生物实验室和生物制药等领域中，保持培养基的无菌状态以及空气质量的洁净是非常重要的。
为了确保实验结果的准确性和产品的质量，培养基灭菌和空气净化是必不可少的环节。
本文档旨在为实验室和生物制药相关人员提供培养基灭菌与空气净化的培训内容，包括培养基灭菌方法、灭菌设备的选择与操作、空气净化的原理与方法等。
通过培训，希望能够提高各位实验人员对培养基灭菌与空气净化的认识和技能，提升实验室和生产环境的无菌水平。
二、培养基灭菌方法培养基灭菌是指通过外部手段将培养基中的微生物杀灭，防止其污染实验结果。
常用的培养基灭菌方法包括物理灭菌和化学灭菌两种。
2.1 物理灭菌物理灭菌是通过提高温度、压力或辐射等手段来杀灭微生物。
常见的物理灭菌方法有：1.高温灭菌：将装有培养基的容器放入高压高温灭菌器中，在高温高压条件下进行灭菌，常用的温度和时间为121℃/15分钟。
要注意灭菌器的压力和温度控制，以确保达到有效的灭菌效果。
2.剂量灭菌：利用辐射源如紫外线、X射线或γ射线等，照射培养基以达到杀灭微生物的目的。
剂量灭菌需要严格控制辐射剂量，以免对培养基中的营养成分产生不良影响。
2.2 化学灭菌化学灭菌是通过加入能够杀灭微生物的化学物质来实现培养基的灭菌。
常用的化学灭菌方法包括：1.干热灭菌：将装有培养基的容器放入干热灭菌器中，在高温、低湿的条件下进行灭菌。
干热灭菌的温度和时间根据具体需求和培养基成分而定。
2.过滤灭菌：通过将培养基用0.22μm孔径的微孔膜过滤，阻挡微生物进入，达到灭菌的目的。
过滤灭菌适用于无法承受高温或辐射的特殊培养基。
三、灭菌设备的选择与操作选择合适的灭菌设备以及正确的操作方法是保障培养基灭菌效果的关键。
根据需要和实验条件，常见的灭菌设备有高压高温灭菌器、干热灭菌器和紫外线灭菌器等。
3.1 高压高温灭菌器高压高温灭菌器是常用的物理灭菌设备，适用于大部分常规培养基的灭菌。
在使用高压高温灭菌器时，应注意以下操作要点：1.根据培养基的特点和厚度合理选择灭菌温度和时间，避免对培养基造成损害。
第五章 发酵工程的灭菌与空气除菌-董媛
2）分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可
避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。
150
保温
100 温度/℃ 冷却 加热 50
40
80
120
160
200
240
时间/min
分批灭菌包括升温、保温和冷却3个阶段。
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第五章 发酵工程的灭菌与空气 除菌
吉林医药学院 董 媛
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本章内容
1 2 3 4
常用灭菌方法和发酵设备种类 培养基的灭菌 发酵设备的清洗和灭菌
空气的除菌
※※灭菌与消毒
灭菌“ sterilization” ：采用物理或化学方法杀死或 除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，
实验室内哪些操 包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
总 过 滤 器
空 气 加 热 器
丝 网 除 末 器
旋 风 分 离 器
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五、空气过滤除菌流程
（一）空气预处理 空气预处理的主要目的： 1 ．提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的 负荷。 2 ．去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空 气湿度和温度进入空气过滤器。 采风塔: ≥10m ,上风头, 流速8m/s.
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※※第三节 空气的除菌
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分布规律： 微生物在空气中的分布情况与空气环境因 素有关，空气质量愈好，微生物的种类及 数量愈低。发酵工厂通常采用高空采气的 方法。
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二、发酵用无菌空气的概念和质量标准
为确保生产在纯种培养状态下进行，严格无菌条件下
第五章培养基灭菌及空气除菌
第5章培养基灭菌和空气除菌教研室：生物工程教师姓名：余有贵教学过程一、灭菌的意义和方法1、灭菌的意义采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等.保证纯种发酵，防止杂菌和噬菌体污染。
消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。
2、灭菌的方法（1）火焰灭菌：接种时使用, 灼烧是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌(2)干热灭菌法：适于灭菌后要求保持干燥状态的物料，将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时后，即可达到彻底灭菌的目的.在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥,以及各种细胞成分发生氧化。
（3）湿热灭菌法：多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5~10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。
工业生产上广泛使用，常用120℃,20—30min.（4)射线灭菌法：适于表面灭菌,紫外线波长在2600埃左右灭菌效力最强,一般用30瓦紫外灯照射20—30min（5）化学药剂灭菌：1）0.1％—0。
25%的高锰酸钾溶液:皮肤消毒2）2%-5%漂白粉：用具和车间环境的灭菌3)70%-75％酒精溶液:皮肤和玻璃器皿表面灭菌4)0。
25%新洁尔灭: 皮肤、小器皿表面和车间的灭菌5)0。
5%甲醛：用于无菌室、空罐和车间空间的灭菌，10ml/m3，6-12h(6)高压静电灭菌:应用于空气的灭菌（7）介质过滤除菌：滤除血清和抗生素溶液内的微生物和空气过滤除菌。
二、培养基和设备的湿热灭菌1、湿热灭菌的原理1。
1概念致死温度：杀死微生物的极限温度。
致死时间：在致死温度下,杀死全部微生物所需要的时间。
热阻：微生物在某一特定的条件下的致死时间性，表示微生物对热的抵抗力.1.2原理湿热灭菌的基本原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。
课用第五章_发酵工程的灭菌与空气除菌
6、物理法
① 干热灭菌法 ：灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品 在干热灭菌器中，于160℃下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170℃。
②射线灭ห้องสมุดไป่ตู้法：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的γ射线进行 灭菌的方法，波长范围在200～275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用 最强的范围是250 ～270nm，波长为253.7nm的紫外线杀菌作用最强。在 紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 ～5min，芽孢约10min即可 杀灭。但其穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室 及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强， 对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。 ③ 过滤除菌：使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，出去微 生物的方法。主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基） 的灭菌和发酵用无菌空气的制备。
臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。 ①对管道容器的灭菌；
②与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净 区的灭菌；
③对原辅助材料和工作器具的灭菌； ④对密闭空间的灭菌； ⑤对药厂用水的灭菌处理。
3、辐射灭菌
辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭 微生物。 α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超 声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物 质，从而起到杀菌作用。 X射线、γ射线，波长0.1~1.4Å，含有极高的能量，使 菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，产生自 由基，进一步与氧作用，产生一些具强氧化性的过氧 化物，如HO2 、H2O2，使细胞内某些蛋白质和酶发生 变化，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体损伤或迅速 死亡。 X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射， 不适于发酵生产使用。
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罐内细菌无法生存
第二节 空气净化（除菌）
发酵对空气无菌程度的要求
一般要求1000 次使用周期中只允许有 一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度 为N=10 -3。
?空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和
病毒) 含量一般为103 ~ 104个／米3。一般
火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口
? 谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌 方法是（ ） A．高压蒸汽灭菌 B．高温灭菌 C．加入抗生素灭菌 D．酒精灭菌
二、培养基的湿热灭菌
湿热灭菌原理
蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝 时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白
质凝固而杀死各种微生物。
灭菌条件
121℃，30min 。
3. 空气过滤除菌介质
（１）纤维状或颗粒状过滤介质
? 棉花：常用，有弹性，纤维长度适中。 ? 玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。 ? 活性炭：要求质地坚硬，颗粒均匀。
缺点： 体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握， 空气压降大。
（２）纸类过滤介质——超细玻璃纤维纸
3? 6张叠在一起使用，过滤效率高，压降小。 缺点： 强度不大（特别是受潮后）。
线法、化学药品法
防腐（antisepsis）
防腐就是利用种理化因素完全抑制霉腐 微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发 生霉腐的措施。
（1）低温
（4）高渗
（2）缺氧
（5）高酸度
（3）干燥
（6）防腐剂
除菌的方法
? 培养基的加热灭菌 ? 空气的过滤除菌 ? 紫外线或电离辐射 ? 化学药物灭菌
1. 化学试剂灭菌法 2. 射线灭菌法 3. 干热灭菌法 4. 湿热灭菌法 5. 过滤除菌法 6. 火焰灭菌法
灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所 有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到 消毒的目的。
?关于灭菌和消毒的不正确的理解是（ ） A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细
胞、芽孢和孢子 B．消毒和灭菌实质上是相同的 C．接种环用灼烧法灭菌 D．常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外
发酵生产中制备无菌空气的 大致过程
空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热
空气预处理
总过滤器 分过滤器 无菌空气
空气过滤
三、空气的预处理
目的: ?提高压缩前空气的洁净度 ?去除压缩后空气中的油和水
1. 提高压缩前空气的洁净度
（1）提高空气吸气口的位置 （2）在空气入口处设置粗过滤器
甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒
电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱
常用烘箱，灭菌条件：160℃下保温 1h 适用范围：金属或玻璃器皿
利用饱和蒸汽灭菌，条件：121℃，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌
利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气
灭菌不利方面
同时会破坏培养基中的营养成分，甚 至产生不利于菌体生长的物质。
（一）间歇灭菌 （常用）
将配制好的培养基同时放在发酵罐或 其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用 设备一起进行加热灭菌的过程，也称实 罐灭菌。
过程包括：
升温、保温和冷却 三阶段。
各阶段对灭菌的 贡献：
150 温度
100
50
0
20% 、75% 、5% 。
附着在空气中的灰尘上或雾滴上。
?灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，空气
除菌主要去除空气中的微粒(0.6~1μm）。
一、空气除菌的方法
（一） 辐射杀菌 （二） 热杀菌 （三） 静电除菌 （四） 过滤除菌
二、空气过滤除菌的原理与介质 1. 过滤除菌的种类
绝对过滤： 过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。
如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF ）制成的0.3 ? m的微孔滤膜。
（1）配料预热罐， 将配制好的料液预热到
60?70 °C ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温
度相差过大而产生水汽撞击声； （2）连消塔， 用高温蒸汽使料液 温度很快升高
到灭菌温度（ 126 ?132 °C ）；
（3）维持罐， 使料液在灭菌温度下保持 5?7min 。因为：连消塔加热的时间很短，光靠 这段时间的灭菌是不够的 ；
（4）冷却管， 使料液冷却到40? 50°C后（冷
水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。
连续灭菌过程中温度的变化(虚线)
（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较
优点
连 1.高温短时灭菌，培养基 续 营养成分损失少。 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 菌 利用率高。
间 1.设备要求低，不需另外 歇 加热、冷却装置。 灭 2.操作要求低，适合小批 菌 量生产规模
3. 适合含大量固体物料的 灭菌
缺点
1. 设备复杂，操作麻烦, 染菌机会多。
2. 不适合含大量固体物 料的灭菌。
1. 培养基的营养物质损 失大，灭菌后培养基 质量下降
2. 发酵罐的利用率较低 3. 不适合大规模生产的
灭菌
罐头食品在很长时间内不会腐败变质,是 因为( )。
A. 罐头密封很严，细菌无法侵入 B. 罐头密封很严，细菌无法呼吸 C.罐头在封罐前经过高温高压灭菌，封罐后
深层介质过滤： 介质的孔隙一般大于微生物细胞。
如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。
2.深层介质过滤的原理
微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层 阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的 绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生 惯性冲击、 拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力 等作用把 微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。
第三章 培养基灭菌与空气净化
第一节 培养基灭菌 一、灭菌的原理和方法
消毒（disinfection ）与灭菌（sterilization ） 的区别？
消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、 器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞 而不能杀死细菌芽孢。 例如，巴氏消毒法，是将 物料加热至 60℃维持30min ，以杀死不耐高温的 微生物营养细胞。
升温
保温
冷却
80 120 160
240
时间（min)
培养基间歇灭菌过程 中的温度变化情况
（二）连续灭菌（又称连消）
将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行
加热、保温和冷却而进行灭菌。
问题 连续灭菌的基本设备有哪些 ？
蒸汽
蒸汽
冷却水
无菌培养基 发酵罐
配料罐 泵 加热塔 维持罐
冷却管
连续灭菌的流程与设备