第五章灭菌与空气的净化
第五章灭菌——精选推荐
第五章灭菌第五章灭菌污染杂菌的危害1.消耗营养物质。
2.抑制发酵菌⽣长。
3.改变培养液理化性质。
4.抑制产物⽣物合成。
5.噬菌体污染。
第⼀节灭菌的基本原理⼀、灭菌定义指⽤化学的或物理学的⽅法杀灭或除掉物料或设备中所有的有⽣命的有机体的技术或⼯艺过程。
⼆、常⽤灭菌⽅法1.化学物质灭菌利⽤化学试剂（甲醛、苯酚、⾼锰酸钾等）与微⽣物细胞中某种化学成分反应，如使蛋⽩质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等杀灭微⽣物。
应⽤：实验室和⽆菌室的空间灭菌，设备、器械、双⼿的消毒灭菌，但不能⽤于培养基的灭菌。
2.辐射灭菌原理：利⽤⾼能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微⽣物常⽤：紫外线、X 射线和γ射线紫外线：诱导了胸腺嘧啶⼆聚体的形成和DNA 链的交联，从⽽抑制了DNA 的复制，导致菌体死亡。
波长为260nm 的杀菌⼒最强穿透⼒差。
应⽤：适于表⾯灭菌。
⽆菌室、接种箱3.⼲热灭菌在⼲燥⾼温条件下，微⽣物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，是微⽣物的致死率迅速增⾼的过程。
常⽤⽅法：灼烧和电热箱加热，160℃ 2⼩时发酵的流程空⽓空⽓净化处理保藏菌种斜⾯活化扩⼤培养主发酵碳源、氮源、⽆机盐等营养物质灭菌成品使⽤范围：需要保持⼲燥的器械、容器的灭菌。
玻璃及⾦属⽤具及沙⼟管灭菌4.过滤除菌原理：利⽤微⽣物不能透过滤膜⽽达到除菌⽬的。
⽅法: 0.01~0.45 m孔径滤膜，使⽤范围：⽤于压缩空⽓、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。
5.湿热灭菌由于蒸汽具有很强的穿透⼒，冷凝时可释放出⼤量潜热，且在⾼温有⽔分条件下，蛋⽩质易变性，使微⽣物死亡。
常⽤⽅法：⽔煮常压灭菌：100℃，40-60min⾼压蒸汽灭菌：⼀般121℃，30分钟使⽤范围：培养基和发酵设备灭菌。
湿热灭菌的优点：蒸汽有强的穿透⼒，灭菌易于彻底；蒸汽来源容易，操作费⽤低，本⾝⽆毒；操作⽅便，易管理。
三、湿热灭菌的理论基础1.灭菌指标的确定⼤多数微⽣物最适温度为25~27℃,维持温度为5~50℃，当温度超过最⾼限温时微⽣物就会发⽣死亡。
护理学基础消毒与灭菌技术
紫外线消毒法
注意事项 1)保持紫外线灯管清洁每2周用95％乙醇棉球擦 拭灯管表面一次 (2)紫外线对眼睛和皮肤有刺激作用，照射过程 中产生的臭氧对人亦有危害，故一般不在有人 的环境中使用，必要时应戴防护镜和穿防护衣。
紫外线消毒法-注意事项
3)消毒物品时应定时翻动物品使其表面受到直 接照射
(4)为保证消毒效果，应定时检测灯管照射强度 (一般每3～6个月测定一次)，如灯管强度低于 70μW/cm2时应更换，或建立使用时间登记本， 凡使用时间超过1000h需更换灯管。
要求 适用 方法 注意
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燃烧灭菌法
❖特点
❖适用 范围
❖禁用
❖方法
燃烧法
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第五章注射剂（重点章节）教学要求：1、掌握注射剂的定义、质量要求
第五章注射剂（重点章节）教学要求：1、掌握注射剂的定义、质量要求、制备工艺及质量检查方法2、掌握注射用水的质量要求和制备注射用水的原理和方法3、掌握注射剂的附加剂4、掌握输液剂，注射用无菌粉末的特点及其生产工艺5、熟悉注射剂生产车间的设计要求，常规洁净室与层流洁净室的特点及其在生产中的应用6、熟悉注射用油的要求7、熟悉渗透压的调节与计算方法8、了解其他注射用溶媒的性质与应用范围一、掌握注射剂的定义、质量要求定义：注射剂系指药物与适宜的溶剂或分散介质制成的供注入体内的灭菌溶液、乳状液或混悬液及临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液。
注射剂的分类：注射剂可分为注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。
1.注射液系指药物制成的供注入人体内用的无菌溶液、乳状液或混悬型注射液。
可用于肌内注射、静脉注射等。
如氯化钠注射液、静脉脂肪乳输液、醋酸氢化可的松注射液等。
2.注射用无菌粉末系指药物制成的供临用前用适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物。
如青霉素等。
3.注射用浓溶液系指药物制成的供临用前用前稀释供静脉滴注用的无菌浓溶液。
注射剂的特点：1.药效迅速、作用可靠注射剂是直接注射入人体内，所以吸收快，作用迅速。
特别是静脉注射，药液可直接进入血液循环，更适于抢救危重病症之用。
2. 适用于不宜口服的药物某些药物，如青霉素易被消化液破坏，链霉素口服不易被胃肠道吸收。
3. 适用于不宜口服给药的患者在临床上常遇到昏迷、抽搐、惊厥或消化系统障碍的患者均不能口服给药，采用注射剂是有效的给药途径。
4.发挥局部定位作用如局麻药、某些诊断用药以及需要延长药效的注射剂，都具有局部定位作用。
质量要求：1.无菌2.无热原无热原是注射剂的重要质量指标，特别是供静脉及脊椎注射的制剂，均需进行热原检查，合格后方可使用。
3.安全性注射剂不能对组织有刺激性或毒性，特别是一些非水溶剂及一些附加剂，必须经过严格的动物实验，以确保安全。
第6章 灭菌及空气净化
(2)蒸料要求
达到熟、软、疏松、不粘手、无夹心，产生熟 料固有的色泽和香气
(3)蒸料过程中蛋白质变化
蛋白质适度变性：若在一定的热力作用下，蛋白 质的二、三、四级结构被破坏，严格的空间排列 被打乱；而一级结构未发生变化。 二次变性（过度变性）：蛋白质进一步变性，分 子结构发生改变。
图中说明，AB曲线的左侧，为原料中残留的未变性蛋白质；CD曲线的 右侧表示蛋白质的二次变性。在AB和CD两曲线之间区域表示蛋白质变 性适度。同时还说明蒸煮压力越高，所需蒸料时间越短，时间控制范 围越小，这就要求时间控制要精确
保 温 阶 段
5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压 和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。 在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各 管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道 则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底， 不留死角。
降 温 阶 段
6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀； 待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通 入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使 培养基降至所需温度。
细胞个数减少速率与残存菌个数:
N----菌的残留个数 t----灭菌时间（s） k----菌死亡的反应速度常数（1/min）
⑵理论灭菌时间的确定
对数残留定律的概念：
—— 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡 的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。 数学表达式：
- dN/d = N
一、常用灭菌方法及原理
1、化学物质灭菌 2、辐射灭菌 3、干热灭菌 4、湿热灭菌☆
一、常用灭菌方法及原理
• 1、化学物质灭菌
甲醛、苯酚、氯化汞、戊二醛 消毒灭菌中使菌体细胞蛋白质变性、改变细 菌细胞膜透性或干扰细菌的酶系统，导致菌 体死亡或生长受抑制。 加入后不易去除，不适于培养基灭菌，只适 于局部空间或某些器械消毒。
生物工艺学知识点
生物工艺学知识点第一章绪论1、生物工艺学biotechnology：又称为生物技术,它是应用自然科学及工程学原理,依靠生物作用剂biologicalagents的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术;特点：多学科和多技术的结合、生物作用剂生物催化剂的参与、应用大量高、精、尖设备;;2、生物催化剂是游离的或固定化的细胞或酶的总称;生物催化剂特点：优点：①常温、常压下反应②反应速率大③催化作用专一④价格低廉缺点：稳定性差控制条件严格易变异细胞生物反应过程实质是利用生物催化剂以从事生物技术产品的生产过程processengineering;3、生物技术研究的主要内容：基因工程DNA重组技术,geneengineering、细胞工程cellengineering、酶工程enzymeengineering、发酵工程fermentationengineering、蛋白质工程proteinengineering、第二章菌种的来源1、工业生产常用的微生物细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类;2、分离微生物新种的过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定;含微生物材料的预处理方法：物理方法加热；化学方法pH；诱饵法;诱饵技术：将固体基质加到待检的土壤或水中,待其菌落长成后再铺平板;分离的效率影响因素：1培养基的养分；2pH；3加入的选择性抑制剂;3、高产培养基成分的选择准则：制备一系列的培养基,其中有各种类型的养分成为生长限制因素C、N、P、O；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳葡萄糖或氮NH4+,它们可能引起分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+加入缓冲溶液以减小pH变化;4、代谢控制发酵MetabolicControlfermentation：用人工诱变的方法,有意识地改变微生物的代谢途径,最大限度地积累产物,这种发酵形象地称为代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用;5、菌种的衰退表观现象有哪些目的产物的产量下降营养物质代谢和生长繁殖能力下降发酵周期延长抗不良环境的性能减弱6、菌种的衰退的原因菌种保藏不当提供不了当的条件或不利的条件经诱变得到的新菌株发生回复突变7、菌种的复壮方法：纯种分离通过寄主体进行复壮淘汰已衰退的个体8、菌种的保藏的原理根据菌种的生理生化特点,人工创造条件,使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低,以减少其变异;一般可通过保持培养基营养成分在最低水平,缺氧状态,干燥和低温,使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力;9、菌种的保藏方法：A斜面冰箱保藏法B沙土管保藏法C石蜡油封存法D真空冷冻干燥保藏法E液氮超低温保藏法第三章菌种选育1、常用菌种选育方法1自然选育:是指在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自发突变spontaneousmutation而进行菌种筛选的过程;特点：自发突变的频率较低,变异程度不大;所以该法培育新菌种的过程十分缓慢; 2诱变育种:是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变率大幅度提高,然后采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株,以供生产实践或科学研究使用;诱变育种的理论基础是基因突变;常用诱变剂：物理诱变剂、化学诱变剂碱基类似物、与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质、生物诱变剂3分子育种DNA重组、基因工程：用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来,在离体条件下切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术;4杂交育种Hybridization：常规杂交育种Hybridization：一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、F因子转移、转导和转化等过程,促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组,以获得性能优良的生产菌株;原生质体融合技术：通过人工方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合,并产生重组子的过程,亦称为“细胞融合”cellfusion;原生质体融合的基本过程：原生质体形成、原生质体融合、原生质体的再生;3、工程菌的不稳定性表现质粒的不稳定质粒的丢失、重组质粒的DNA片段脱落、表达产物的不稳定第三章微生物的代谢调节1、微生物代谢调节方式代谢流向的调控分为代谢物的合成和代谢物的降解；通过快速启动蛋白质的合成和有关的代谢途径,平衡各代谢物流和反应速率来适应外界环境的变化;代谢速度的调控分为酶量粗调酶合成的诱导和酶合成的阻遏和酶活细调酶活性的激活、酶活性的抑制反馈阻遏是转录水平的调节,产生效应慢；影响催化一系列反应的多个酶反馈抑制是酶活性水平调节,产生效应快;只对是一系列反应中的第一个酶起作用底物对酶的影响称为前馈;产物对酶的影响称为反馈;2、微生物初级代谢调节包括酶活调节、酶合成调节、遗传控制1酶活性的调节细调：一定数量的酶,通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率;酶活调节的影响因素包括：底物和产物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其他酶的存在等等;特点是反应快速;酶活性的调节包括：酶活性的激活和酶活性的抑制反馈抑制2酶合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制;这类调节在基因转录水平上进行,对代谢活动的调节是间接的、缓慢的3酶合成的阻遏：在某代谢途径中,当末端产物过量时,微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成,从而彻底地控制代谢,减少末端产物生成,这种现象称为酶合成的阻遏;末端代谢产物阻遏:由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的反馈阻遏;分解代谢物阻遏：当细胞内同时存在两种可利用底物碳源或氮源时,利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成;这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果,而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的,所以称为分解代谢物阻遏过去被称为葡萄糖效应;3、改变细胞膜通透性的方法A限制培养基中生物素浓度在1～5mg/L,控制细胞膜中脂质的合成；B加入青霉素,抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联；C加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂如聚氧化乙酰硬脂酰胺,将脂类从细胞壁中溶解出来,使细胞壁疏松,通透性增加；D控制Mn2+、Zn2+的浓度,干扰细胞膜或细胞壁的形成；E可以通过诱变育种的方法,筛选细胞透性突变株;5、人工控制微生物代谢的两种手段：1生物合成途径的遗传控制2发酵条件的控制6.谷氨酸棒杆菌生物素缺陷型生产谷氨酸的调控第四章微生物次级代谢与调节1、次级代谢产物：某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质,它们一般是在菌生长终止后合成的;其生物合成至少有一部分是与核内和核外的遗传物质有关,同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关;微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等;2、初级与次级代谢途径相互连接次级代谢物通常是由初级代谢中间体经修饰后形成的修饰初级代谢中间体的三种生化过程生物氧化与还原、生物甲基化、生物卤化3、前体：指加入到发酵培养基中的某些化合物,它能被微生物直接结合到产物分子中去,而自身的结构无多大变化有些还具有促进产物合成的作用;中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质,他们均被进一步代谢,最终获得该途径的终产物;4、次级代谢物生物合成的原理①一旦前体被合成,在适当条件下它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径;②在某些情况下单体结构单位被聚合,形成聚合物;这些特有的生物合成中间体产物需做后几步的结构修饰,修饰的程度取决于产生菌的生理条件;有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的;第五章发酵培养基1、培养基通常指人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料,同时,培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必需的环境条件2、发酵培养基的要求①培养基能够满足产物最经济地合成②发酵后所形成的副产物尽可能的少③培养基的原料应因地制宜,价格低廉；且性能稳定,资源丰富,便于采购运输,适合大规模储藏,能保证生产上的供应;④所用培养基应能满足总体工艺的要求,如不应影响通气、提取、纯化及废物处理等;3、工业上常用的碳源：葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖工业上常用的氮源：无机氮源：氨水,铵盐,硝酸盐等;有机氮源：玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等;生理酸性物质,如硫酸铵;生理碱性物质,如硝酸钠;提供生长因子的农副产品原料：1玉米浆2麸皮水解液3糖蜜4酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉;产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物,又非前体,但加入后却能提高产量的添加剂;4、发酵培养基的设计和优化方法正交试验设计、均匀设计、响应面分析正交试验设计：利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法;它是由试验因素的全部水平组合中,挑选部分有代表性的水平组合进行试验,通过对这部分试验结果的分析,了解全面试验的情况,找出最优的水平组合;正交实验数据分析,见教材P112-114例题,表4-16,同时确定因素的主次顺序、各因素的优水平、各因素水平的最优组合;小数点后保留一位;第六章发酵培养基灭菌和空气净化在发酵工业生产中,为了保证纯种培养,在生产菌种接种培养前,要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌,还要对生产环境进行消毒,防止杂菌和噬菌体的大量繁殖;1.微生物热阻：微生物在某一特定条件下主要是温度和加热方式下的致死时间;2.对数残留定律中各符号的意义;3.理论灭菌时间的计算间歇实罐灭菌时间的计算连续灭菌的灭菌时间计算：4.灭菌温度的选择：随着温度升高,灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数;即当灭菌温度升高时,微生物杀灭速度提高,培养基营养成分破坏的速度减慢;5.影响培养基灭菌的因素：所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间,培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响;6.无菌空气：指通过除菌处理使空气中含菌量降低至一个极低的百分数,从而能控制发酵污染至极小机会;此种空气称为“无菌空气”;7.介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层,将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中,而达到除菌的目的;是大多数发酵厂广泛采用的方法;按除菌机制可分为：绝对表面过滤和深层介质过滤;介质过滤除菌的机理：空气流通过这种介质过滤层时,借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用,将其尘埃和微生物截留在介质层内,达到过滤除菌目的;第七章种子的扩大培养1、种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程;这些纯种培养物称为种子2、种子扩大培养的目的与要求1种子扩培的目的①接种量的需要②菌种的驯化③缩短发酵时间、保证生产水平2种子的要求①菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长,延迟期短②生理性状稳定③菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求④无杂菌污染⑤保持稳定的生产能力;3、种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数,取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积;种子罐级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响;级数大,难控制、易染菌、易变异,管理困难,一般2～4级;4、种子制备分两个阶段：实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段5、种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间;接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例;通常接种量：细菌1-5%,酵母菌5-10%,霉菌7-15%,有时20-25%青霉素生产的种子制备过程：安瓿管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵第八章发酵工艺控制1、微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的性能和合适的环境条件;2、发酵过程的代谢变化从产物形成来说,代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化培养基和培养条件和产物形成速率这三者之间的关系;在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系,将微生物产物形成动力学分为①生长关联型和②非生长关联型;3、发酵方式1补料－分批发酵：指分批培养过程中,间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法;优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度;低基质浓度的优点：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并维持适当的菌体浓度,使不至于加剧供氧的矛盾；②克服养分的不足,避免发酵过早结束;2半连续发酵：是指在补料－分批发酵的基础上,间歇地放掉部分发酵液的培养方法;优点：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并维持适当的菌体浓度,使不至于加剧供氧的矛盾；②克服养分的不足,避免发酵过早结束；③缓解有害代谢产物的积累;3连续发酵：指培养基料液连续输入发酵罐,并同时放出含有产品的发酵液的培养方法;在这样的环境中培养,菌的生长就受到所提供基质的限制,培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态;与传统的分批发酵相比,连续培养有以下优点：①维持低基质浓度：可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并维持适当的菌体浓度,使不至于加剧供氧的矛盾；②避免培养基积累有毒代谢物；③可以提高设备利用率和单位时间的产量,节省发酵罐的非生产时间；④便于自动控制;4、发酵控制参数按性质分类：物理参数、化学参数、生物参数按检测手段分类：①直接参数：⑴在线检测参数⑵离线检测参数②间接参数5、发酵热发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量;Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射生物热biologicalheat是菌体生长过程中直接释放到体外的热能,使发酵液温度升高;搅拌热agitationheat是搅拌器引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量;6、发酵过程pH值的一般变化规律1生长阶段：菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质,生成铵离子,使pH上升至碱性；随着菌体量增多,铵离子的消耗也增多,另外糖利用过程中有机酸的积累使pH 值下降;2生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定;3自溶阶段：随着养分的耗尽,菌体蛋白酶的活跃,培养液中氨基氮增加,致使pH又上升,此时菌体趋于自溶而代谢活动终止;7、引起发酵液pH值异常波动的因素pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件pH下降：①培养基中碳、氮比例不当;碳源过多,特别是葡萄糖过量,或者中间补糖过多加上溶氧不足,致使有机酸大量积累而pH下降；②消泡剂加得过多；③生理酸性物质的存在,铵被利用,pH下降;pH上升：①培养基中碳、氮比例不当;氮源过多,氨基氮释放,使pH上升；②生理碱性物质存在；③中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多;8、临界氧浓度criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度;如对产物形成而言便称为产物合成的临界氧浓度;呼吸强度又称氧比消耗速率,是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量,以QO2表示,单位为mmolO2／g干菌体·h;耗氧速率又称摄氧率,是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量,以r表示,单位为mmolO2／L·h;9、引起溶氧异常下降,可能有下列几种原因：①污染好气性杂菌,大量的溶氧被消耗掉,可能使溶氧在较短时间内下降到零附近,如果杂菌本身耗氧能力不强,溶氧变化就可能不明显；②菌体代谢发生异常现象,需氧要求增加,使溶氧下降；③某些设备或工艺控制发生故障或变化,也可能引起溶氧下降,如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢,影响供氧能力,使溶氧降低;10、泡沫的形成及其对发酵的影响在大多数微生物发酵过程中,通气、搅拌以及代谢气体的逸出,再加上培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂的存在,培养液中就形成了泡沫;形成的泡沫有两种类型：一种是发酵液液面上的泡沫,气相所占的比例特别大,与液体有较明显的界限,如发酵前期的泡沫；另一种是发酵液中的泡沫,又称流态泡沫fluidfoam,分散在发酵液中,比较稳定,与液体之间无明显的界限大量的泡沫引起的负作用：发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小；增加了菌群的非均一性；造成大量逃液,增加染菌机会；严重时通气搅拌无法进行,菌体呼吸受到阻碍,导致代谢异常或菌体自溶；消泡剂的添加将给提取工序带来困难;泡沫的消除调整培养基中的成分如少加或缓加易起泡的原料或改变某些物理化学参数如pH 值、温度、通气和搅拌或者改变发酵工艺如采用分次投料来控制,以减少泡沫形成的机会;采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素;采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫;常用的消泡剂有4大类：天然油脂类、脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类11、造成染菌的主要原因设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善第十章下游加工过程概论1、下游技术工程downstreamprocessing：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料,经提取分离、加工并精制目的成分,最终使其成为产品的技术;2.发酵液的特点1含水多,产物含量低；2含菌体蛋白；3溶有原来培养基成分；4相当多的副产物和色素；5易被杂菌污染或使产物进一步分解；6易起泡,粘性物质多;3、整个下游加工过程应遵循下列四个原则1时间短；2温度低,选择在生物物质的温度范围内；3pH适中;4严格清洗消毒包括厂房、设备及管路,注意死角;4、一般下游加工过程可分为4个阶段1培养液发酵液的预处理和固液分离；2初步纯化提取；3高度纯化精制；4成品加工;5、下游加工过程的一般流程第十二章发酵液的预处理和固液分离方法1、改善发酵液过滤特性的物理化学方法：调酸等电点、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等;2、凝聚——指在电解质作用下,由于胶粒之间双电层电排斥作用降低,电位下降,而使胶体体系不稳定的现象；常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2SO4318H2O明矾；氯化铝AlCl36H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下,基于桥架作用,使胶粒形成较大絮凝团的过程;工业上使用的絮凝剂可分为三类：1有机高分子聚合物,如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2无机高分子聚合物,如聚合铝盐、聚合铁盐等；3天然有机高分子絮凝剂,如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等;目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺polyacrylamide类衍生物3、杂蛋白的去除方法有沉淀法、变性法、吸附法4、固液分离的方法：重力沉降、浮选、旋液分离、介质过滤、离心;5、根据过滤机理,过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤;第十三章细胞破碎1、细胞破碎的阻力：细菌破碎的主要阻力:肽聚糖的网状结构,网状结构越致密,破碎的难度越大,革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁破碎的阻力:主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构,其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高;2、常用破碎方法机械法：珠磨法固体剪切作用、高压匀浆法液体剪切作用、超声破碎法液体剪切作用、X-press法固体剪切作用;非机械法：酶溶法酶分解作用、化学渗透法改变细胞膜的渗透性、渗透压法渗透压剧烈改变、冻结融化法反复冻结-融化、干燥法改变细胞膜渗透性3、破碎率的测定方法1直接测定法2目的产物测定法3导电率测定法第十四章沉淀法Precipitation1、固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件,使生化产物溶解度降低,以固体形式沉淀和晶体从溶液中沉降析出的分离纯化技术;结晶法：在固相析出过程中,析出物为晶体称为结晶法;沉淀法：在固相析出过程中,析出物为无定形固体称为沉淀法;常用的沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等;2、盐析Saltinducedprecipitation：在高浓度的中性盐存在下,蛋白质酶等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低,产生沉淀的过程;原因如下：1无机离子与蛋白质表面电荷中和,形成离子对,部分中和了蛋白质的电性,使蛋白质分子之间的排斥力减弱,从而能够相互靠拢；2中性盐的亲水性大,使蛋白质脱去水化膜,疏水区暴露,由于疏水区的相互作用导致沉淀；Ks盐析法：在一定pH和温度下,改变体系离子强度进行盐析的方法；β盐析法：在一定离子强度下,改变pH和温度进行盐析；常用的盐析用盐：硫酸铵、硫酸钠,磷酸盐,柠檬酸盐;3、有机溶剂沉淀：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂,降低溶质的溶解度,使其沉淀析出;原理：1降低了溶质的介电常数,使溶质之间的静电引力增加,从而出现聚集现象,导致沉淀;2有机溶剂的水合作用,降低了自由水的浓度,降低了亲水溶质表面水化层的厚度,降低了亲水性,导致脱水凝聚;常用的有机溶剂沉析剂：乙醇：沉析作用强,挥发性适中,无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强,用量省,但毒性大,应用范围不广；4、等电点沉淀：调节体系pH值,使两性电解质的溶解度下降,析出的操作称为等电点沉淀;原理：蛋白质是两性电解质,当溶液pH值处于等电点时,分子表面净电荷为0,双电层和水化膜结构被破坏,由于分子间引力,形成蛋白质聚集体,进而产生沉淀;第十五章膜过滤法1、膜过滤法指以压力为推动力,依靠膜的选择性,将液体中的组分进行分离的方法;基本原理是筛孔分离过程;在压差的推动下,原料液中的溶剂和小的溶质粒子从高压的料液侧透过膜到低压侧,所得到的液体一般称为滤出液或透过液,而大的粒子组分被膜截留;包括微滤MF、超滤UF、纳滤NF和反渗透RO四种过程;在工业上用得最广的膜材料是醋酸纤维素和聚砜;浓差极化：当溶剂透过膜,而溶质留在膜上,使膜面浓度增大,并高于主体中浓度,这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中,这种现象称为浓差极化;在超滤中,为减少浓差极化,通常采用错流操作;膜的污染：膜在使用中,尽管操作条件保持不变,但通量仍逐渐降低的现象;污染原因：膜与料液中某一溶质的相互作用；吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用;。
培养基灭菌与空气净化培训
培养基灭菌与空气净化培训一、引言在微生物实验室和生物制药等领域中，保持培养基的无菌状态以及空气质量的洁净是非常重要的。
为了确保实验结果的准确性和产品的质量，培养基灭菌和空气净化是必不可少的环节。
本文档旨在为实验室和生物制药相关人员提供培养基灭菌与空气净化的培训内容，包括培养基灭菌方法、灭菌设备的选择与操作、空气净化的原理与方法等。
通过培训，希望能够提高各位实验人员对培养基灭菌与空气净化的认识和技能，提升实验室和生产环境的无菌水平。
二、培养基灭菌方法培养基灭菌是指通过外部手段将培养基中的微生物杀灭，防止其污染实验结果。
常用的培养基灭菌方法包括物理灭菌和化学灭菌两种。
2.1 物理灭菌物理灭菌是通过提高温度、压力或辐射等手段来杀灭微生物。
常见的物理灭菌方法有：1.高温灭菌：将装有培养基的容器放入高压高温灭菌器中，在高温高压条件下进行灭菌，常用的温度和时间为121℃/15分钟。
要注意灭菌器的压力和温度控制，以确保达到有效的灭菌效果。
2.剂量灭菌：利用辐射源如紫外线、X射线或γ射线等，照射培养基以达到杀灭微生物的目的。
剂量灭菌需要严格控制辐射剂量，以免对培养基中的营养成分产生不良影响。
2.2 化学灭菌化学灭菌是通过加入能够杀灭微生物的化学物质来实现培养基的灭菌。
常用的化学灭菌方法包括：1.干热灭菌：将装有培养基的容器放入干热灭菌器中，在高温、低湿的条件下进行灭菌。
干热灭菌的温度和时间根据具体需求和培养基成分而定。
2.过滤灭菌：通过将培养基用0.22μm孔径的微孔膜过滤，阻挡微生物进入，达到灭菌的目的。
过滤灭菌适用于无法承受高温或辐射的特殊培养基。
三、灭菌设备的选择与操作选择合适的灭菌设备以及正确的操作方法是保障培养基灭菌效果的关键。
根据需要和实验条件，常见的灭菌设备有高压高温灭菌器、干热灭菌器和紫外线灭菌器等。
3.1 高压高温灭菌器高压高温灭菌器是常用的物理灭菌设备，适用于大部分常规培养基的灭菌。
在使用高压高温灭菌器时，应注意以下操作要点：1.根据培养基的特点和厚度合理选择灭菌温度和时间，避免对培养基造成损害。
卫生消毒
下排气式蒸汽灭菌器
预真空蒸汽灭菌器
下排气式蒸汽灭菌器，根据蒸汽比空 气轻的原理，将蒸汽缓慢均匀由上方 不断通入灭菌器内，将空气由下方排 气口挤压排出。 预真空蒸汽灭菌器，即在关闭柜门后， 先用抽气机将空气抽出，使至－98.64 kPa(绝对压力20mmHg)，然后再通入蒸 汽进行灭菌。
Chemical indicator：
灭菌指示胶带 灭菌指示卡 灭菌指示管
34
生物指示物:
将嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC 7953 或 SSIK 31株)染于纸片载体上，干 燥后装入纸袋或安瓿内备用。
生物指示物的质量要求:
菌量 5.0×105～5.0×106cfu/片； 在 121℃±0.5℃条件下
指可杀灭所有种类微生物(包括细 菌芽孢)达到消毒要求的消毒剂 。
部分高效消毒剂通过增加剂量 （浓度和/或时间 ）能达到灭菌要求， 成为灭菌剂（strilant）
Intermediate-level disinfectant
可杀灭细菌繁殖体(包括结核杆菌)、大 多数种类的病毒与真菌(不包括细菌芽 孢)，达到消毒要求的消毒剂 。
①导致核酸突变
如形成嘧啶二聚体、DNA断链等；
②产生氧化自由基
自由基的作用使相关的结构和功能 障碍，最终促使细胞死亡。
紫外线消毒的应用
应用范围
空气消毒和物品表面消毒
穿透力弱 紫外辐照度监测 人员防护
4. 紫外线消毒监测项目
（1）测定辐照度值：用辐照度值测定仪 或化学指示卡距放射源l m处测定。 （2）表面消毒的效果监测：菌片定量法 或棉拭涂抹采样定量法。 （3）空气消毒效果的监测：琼脂平板沉 降法或撞击法采样。消毒后菌落总数不应超 过国家规定的卫生标准。
发酵应掌握的知识
第一章绪论1、发酵的概念利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程，统称为发酵。
2、发酵工程的概念发酵工程是利用微生物生长与代谢活动，通过现代工程技术手段进行工业规模生产的技术。
由于它以培养微生物（发酵）为主，所以习惯上也称为微生物工程。
3、发酵工程研究的内容1、工业生产菌种的选育。
2、最佳发酵条件的选择和控制。
3、生化反应器（发酵罐）的设计。
4、产品的分离、提取及精制等过程。
4、获得一种发酵产品应具备的条件适宜的微生物;保证或控制微生物进行代谢的各种条件;进行微生物发酵的设备;精制成产品的方法和设备第二章菌种选育及种子扩培1、工业微生物菌种的分离筛选方法分离：①平板划线分离法②稀释分离法③简单平板分离法④涂布分离法⑤毛细管分离法⑥小滴分离法筛选：①平板筛选：用水解圈、变色圈、抑菌圈、透明圈等方法②药瓶发酵筛选2、几种鉴别圈的概念和鉴别的原理1. 变色圈：直接用显色剂或指示剂。
在菌体筛选中直接用显色剂或指示剂掺入培养基中或喷洒已生长的菌落的培养基表面，由于培养基中所筛选出的微生物产生酸或碱性物质从而使培养基的pH值降低或升高，由于显色剂在不同pH值条件下显色不同，从而形成围绕菌落周围的变了颜色的圈叫变色圈。
2.透明圈：混浊底物被分解后形成透明圈。
如可溶性淀粉、碳酸钙等。
在固体培养基中加入酶作用的底物或其他物质（都能使培养基产生浑浊）培养微生物，能够利用此底物的酶的产生菌得以生长或微生物能利用此种物质，则在其菌落周围形成一个透明的圈，叫透明圈，也叫水解圈。
3.生长圈：利用某些具有特殊营养要求的微生物为工具菌（如营养缺陷型菌株）若分离的微生物能在一般的培养条件下（缺乏上述营养要求的物质）生长而合成该物质，则能使工具菌生长，则在分离的微生物的菌落周围形成工具菌的生长圈，这种圈叫生长圈。
4.抑菌圈：有害菌与能够产生抑菌物质的微生物菌种一起在固体培养基上进行培养时，则在产生抑菌物质的微生物菌落周围产生一个透明的圈（即有害微生物不能生长的形成的圈）叫抑菌圈。
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▪ ⑶ 75％酒精溶液 75％酒精溶液的杀菌作用 在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对 营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用， 但对细菌的芽孢杀死作用较差。常用于皮肤 和器具表面杀菌。
▪ ⒋ 湿热灭菌法
▪ 利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌 法。其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生 物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化 学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的 变性，使微生物死亡。由于蒸汽有很强的穿 透能力，湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说，温 度升高10 ℃时，灭菌速度常数可增加8～10 倍，对营养细胞更高。蒸汽来源方便，价格 低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭 菌方法。一般的湿热灭菌条件为121 ℃，30 min。
培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基
连续灭菌流程
▪ ⑵ 间歇灭菌
▪ 间歇灭菌即实消，是在每批培养基全部流 入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭 菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温 度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭 菌。
▪ 其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备 十分耐压，则可采用较高的温度，但必须 注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸 汽不能到达的部位。
▪ ⑷ 新洁尔灭 新洁尔灭是表面活性剂类洁净 消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体 表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性。 10 min能杀死营养细胞，但对细菌芽孢几乎 没有杀灭作用。一般用于器具和生产环境的 消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝 制品。
▪ ⑸ 甲醛 甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与 蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨 基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲 醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以2份37 ％甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37％甲 醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。 甲醛灭菌的缺点是穿透力差。
第二节 空气的净化
▪ 一、空气净化的方法 ▪ 对空气灭菌的要求一般可按10-3的染菌概率，
即在1000次培养过程中，只允许一次是由于 空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养过程 失败。
▪ ⒈ 热灭菌法 ▪ 空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩
机压缩，提高压力，空气经压缩后温度能够 升到200 ℃以上，保持一定时间后，便可实 现干热杀菌。
▪ ⑶ 固体培养基灭菌
▪ ⒉ 影响培养基灭菌的因素 ▪ ⑴ 培养基成分 ▪ 油脂、糖类 ▪ 低质量分数(1％～2％)的NaCl溶液 ▪ ⑵ pH值 ▪ pH值6.0～8.0，微生物最耐热；pH<6.0，氢
离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的 生理反应促使其死亡
▪ ⑶ 培养基中的颗粒 ▪ ⑷ 泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传
▪ ⒌ 化学药剂灭菌法
▪ 某些化学药剂能与微生物发生反应而具有 杀菌的作用。
▪ 化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种 操作前小型器具的灭菌等。
▪ 化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象 的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态灭菌作用是 使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡， 一般用0.1％～0.25％的溶液。
▪ ⒍ 过滤除菌法
▪ 利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌 的目的，这就是过滤除菌法。
▪ 此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工 业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好 氧微生物培养过程使用。
▪ 二、湿热灭菌的原理
▪ 三、培养基的灭菌
▪ ⒈ 培养基湿热灭菌方法
▪ ⑴ 连续灭菌 连续灭菌也叫连消，其温度 一般以126～132 ℃为宜，总蒸汽压力要求 达到0.044～0.049 MPa以上。培养基采用连 续灭菌时，需在培养基进入发酵罐前，直接 用蒸汽进行空罐灭菌（空消），用无菌空气 保压，待培养基流入罐后，开始冷却。灭菌 时对培养基的加热可采用各种加热器。培养 基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、 薄板换热器式几种方式，其过程均包括加热、 维持和冷却。
▪ 四、培养基与设备、管道灭菌条件 ▪ ⑴ 杀菌锅内灭菌 ▪ ⑵ 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空
罐灭菌及管道灭菌 ▪ ⑶ 空气总过滤器和分过滤器灭菌 ▪ ⑷ 种子培养基实罐灭菌 ▪ ⑸ 发酵培养基实罐灭菌 ▪ ⑹ 发酵培养基连续灭菌 ▪ ⑺ 消泡剂灭菌 ▪ ⑻ 补料实罐灭菌 ▪ ⑼ 尿素溶液灭菌
▪ ⒉ 静电除菌 ▪ 静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子
而达到除尘灭菌的目的。
1—升压变压器； 2—整流器； 3—沉淀电极； 4—电晕电极
静电除尘灭菌器示意
▪ ⒊ 介质过滤除菌法
▪ 过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质， 以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空 气的方法。
▪ 通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并 有足够的压力和适宜的温度以供好氧培养 过程之用。
▪ 该法是目前广泛应用来获得大量无菌空气 的常规方法。在空气的除菌方法中，介质 过滤除菌生产中使用最多。
▪ 二、空气的过滤除菌原理和介质
▪ ⑹ 过氧乙酸 过氧乙酸是强氧化剂，它是 广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养 细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀 灭作用。
▪ ⑺ 戊二醛 在酸性条件下，不具有杀死芽 孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀 死芽孢的能力，常用2％的溶液，常用于器 具、仪器和工具等灭菌。
▪ ⑻ 酚类 苯酚毒性较大，易污染环境，且 水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生 物的使用，扩大了作为消毒剂的使用范围。
热困难，热难穿透过去杀灭微生物
▪ ⒊ 分批灭菌和连续灭菌比较 ▪ 连续灭菌与分批灭菌比较的优点： ▪ ① 可采用高温短时灭菌，培养基受热时间
短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产 率；
▪ ② 发酵罐利用率高； ▪ ③ 蒸汽负荷均衡； ▪ ④ 采用板式换热器时，可节约大量能量； ▪ ⑤ 适宜采用自动控制，劳动强度小。