荔枝SSR标记的研究

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SSR标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展(一)

SSR标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展(一)论文关键词：种子纯度SSR标记研究进展论文摘要：种子纯度在种子生产中的地位日益提高，以往的形态鉴定等方法难以满足人们的要求。

随着分子标记技术的发展，越来越多地被应用到种子纯度鉴定中。

本文介绍了SSR分子标记技术的基本原理和特点，简要叙述了SSR标记技术在农作物种子纯度鉴定上的研究进展，并就其在杂交种纯度方面的应用潜力进行了探讨。

Keywords:Seedpurity;SSRmarkers;ResearchprogressesAbstract：ThestatusofSeedpurityareincreasedinseedproduction.Itisdifficulttomeetpe oplethatthemethodsofpastidentifications.Withthedevelopmentofmolecula rmarkers,SSRareappliedtotheidentificationofseedpurityincreasingly.Inthisp aper,SSRmolecularmarkertechnology,thebasicprinciplesandcharacteristicsa resummarized.ItisdescribedtheresearchprogressesofSSRmarkersinthepurit yofcropseed.And,itisdiscussedthepotentialapplicationsinthepurityofhybrid.1.前言随着我国农业经济的发展和种子市场的逐步规范，种子的真假和纯度对种子生产具有越来越重要的影响。

为了保护农民以及育种者的利益，发展快速、稳定、可靠的品种纯度鉴定方法具有重要的意义。

种子品种纯度鉴定主要包括品种真实性和品种纯度鉴定两个方面。

品种鉴定主要指对供检样品的真实性进行鉴定。

利用SNP和EST-SSR分子标记鉴定荔枝新种质御金球

利用ＳＮＰ和ＥＳＴ．ＳＳＲ分子标记鉴定荔枝新种质御金球
孙清明李永忠向旭
５１９１００
陈道明杨晓燕・方静吴绪波周东辉：马帅鹏马文朝
１农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广东省农业科学院果树研究所，广卅ｌ，５１０６４０；２珠海市果树科学技术推广站，珠海
Ｚｈｕｈａｉ，５１９１００
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｘｉｎｇａｘｕ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ
Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／Байду номын сангаасｍｐｂ．０１１．０００４０３
分子植物育种，２０１３年，第１１卷，第３期，第４０３－４１４页
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０１３，Ｖｏ１．１１，ＮｏＩ３，４０３— ４１４
研究报告
ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ
ＡｂｓｔｒａｃｔＹｕｊｉｎｑｉｕｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｏｎｎ．），ａｌａｎｄｒａｃｅｏｆＬｉｃｈｅｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎＺｈｕｈａｉｃｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ，
ＡＮｏｖｅｌＬｉｔｃｈｉＧｅｒｍｐｌａｓｍ（ＬｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｏｎｎ．），Ｙｕｊｉｎｑｉｕ，Ｉｎｄｅｎｔｉｉｆｅｄ

一种区分荔枝品种的SSR引物组及其应用[发明专利]

专利名称：一种区分荔枝品种的SSR引物组及其应用
专利类型：发明专利
发明人：徐振江,方超,刘洪,饶得花,江院,陈孟强,唐轩,黄展权,马强,邱友媚
申请号：CN202011085923.3
申请日：20201012
公开号：CN112176088B
公开日：
20220415
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于分子生物学的技术领域，具体涉及一种区分荔枝品种的SSR引物组及其应用。

所述SSR引物组包括6组荔枝SSR引物对，所述6组荔枝SSR引物对中的正向引物和引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO.1～SEQIDNO.12所示。

所得SSR引物在荔枝中扩增的带型清晰容易判读，同时适合普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台和毛细管荧光检测平台检测，所述SSR引物的多态性高且扩增重复性好；本发明的SSR引物应用于荔枝遗传多样性分析、品种区分鉴定、DNA指纹图谱构建等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进荔枝产业的良性发展。

申请人：华南农业大学
地址：510630 广东省广州市天河区五山483号
国籍：CN
代理机构：广州专理知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：张凤
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ssr分子标记原理

ssr分子标记原微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。

研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。

微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。

如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR 在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。

SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。

由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。

由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。

由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR 标记的原理。

RAPD 技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。

其以基因组DNA为模板, 以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增。

扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。

扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。

/////////////////////////////////////////////生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列〔14〕，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。

荔枝两个F1杂交群体的EST-SSR鉴定及多样性分析

Ｔｈｅｓｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｌｙｔｏｔｈｉｓｐａｐｅｒ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．ｘｉａｎｇｘｕ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ
同等贡献作者通讯作者，ｘｉａｎｇｘｕ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ
摘要为了更好地在荔枝杂交育种中判别真杂种，以荔枝两个人工杂交群体 ‘ 雪怀子 ’ Ｘ ‘ 桂味 ’ 和‘ 雪怀子’ × ‘ 焦核三月红 ’ 的Ｆ代为材料，利用ＥＳＴ．ＳＳＲ标记进行真假杂种鉴定，创建作图群体，并对两个群体进
带。经聚类分析发现，群体 ‘ 雪怀子’ Ｘ ‘ 桂味’ １１３个Ｆ单株被聚为６大类（相似性系数０．６８），６３．７２％（７２株）后
代与父本聚为一类，２８．３％（３２株）单株与双亲距离较远，推测这些单株中出现了较大的遗传重组或变异。在相似系数０．６４２处， ‘ 雪怀子 ’ Ｘ ‘ 焦核三月红 ’ 组合的４６株杂种后代分为两大类，该组合大部分单株（６０．８７％１与母本亲缘关系较近，具有偏母本遗传倾向。可见，ＥＳＴ．ＳＳＲ标记适合荔枝真假杂种鉴定，两个Ｆ作图群体
行遗传多样性分析。结果表明，分别采用４对引物组合即可实现对两个杂交群体Ｆ代单株１００％的鉴定，两个群体的１５９个单株均为真杂种；且两个群体后代叶片形态存在变异，基因型上产生了不同于亲本的扩增谱

基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定

基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定
随着科学技术的不断发展，基因组学研究已成为生物学和农业领域的前沿研究方向。

在这个背景下，基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定显得尤为重要。

SSR标记是基于DNA分子中短串重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）的分子标记。

由于其在物种之间普遍存在，且可重复性高、遗传稳定性好，因此，SSR标记已成为分子遗传学和基因组学研究领域中的重要分子标记。

本文基于石榴的全基因组序列，利用生物信息学分析软件对其进行分析和挖掘，筛选出了一批具有重复序列的SSR标记，设计并合成了对应的引物。

通过PCR扩增和多态性分析，我们鉴定和筛选出了一批具有高度遗传多样性的SSR标记，并依据其特征和表型表现进行分类和分组。

进一步，基于我们鉴定出的SSR标记，我们对石榴的种质资源进行了遗传多样性分析，发现在石榴品种间存在着丰富的遗传多样性。

同时，我们对石榴品种的遗传结构、进化历史以及地理遗传分布等进行了深入的研究。

总之，基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定，可以有效地促进石榴品种的分子遗传学研究和遗传多样性分析，为石榴育种和种质资源保护提供科学依据。

未来，我们还将继续以此为基础，开展更深入和全面的研究。

杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化

杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化作者：覃昱茗张宇黄国弟莫永龙罗世杏荣涛来源：《农业研究与应用》2021年第03期摘要：采用正交设计方法，对影响PCR反应体系的5个因素（Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA）进行了优化，建立了适用于杧果的SC-SSR-PCR反应体系。

结果表明，总反应体系25 μL中，包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶浓度1.00 U、dNTPs浓度0.15 mmol·L-1。

利用优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系对10对SC-SSR引物进行验证，均能扩增出清晰、明亮、特异的电泳条带。

因此，优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系适用于杧果种质鉴定和亲缘关系分析。

关键词：杧果 SC-SSR 正交设计体系优化中图分类号：S667.7 文献标识码：A杧果（Mangifera indica L.）为漆树科重要常绿经济果树，原产印度，其果实风味极佳[1]。

国内海南、广东、广西、福建、云南、贵州、四川均有栽培[2-3]。

起始密码子-微卫星扩增多态性（start codon simple sequence repeat，SC-SSR）标记是郭大龙等结合SCoT和ISSR分子标记技术开发出来的一种既能将标记位点与表达序列紧密联系，又具有相对较高多态性的新型分子标记[4]。

目前，SC-SSR标记已应用于猕猴桃遗传多态性分析及其指纹图谱构建，但在其他物种中的应用研究在国内并不多[5]。

由于杧果高度异花授粉，种子高度杂合，且生产交易中往往存在同物异名和异物同名等问题，给杧果育种工作带来了诸多阻碍[6-8]。

SC-SSR分子标记在种质鉴定方面具有独特的优势，但在杧果中尚未有报道。

基于这些问題，本研究较全面地建立并优化杧果的SC-SSR反应体系，为其在杧果种质资源评价、遗传多样性分析等领域的应用提供技术参考。

SSR标记技术在植物基因组研究上的应用

SSR标记技术在植物基因组研究上的应用陆丹;牛楠;李玥莹【摘要】SSR也称作微卫星DNA,是一种广泛应用的分子标记技术.SSR具有丰富的多态性,基于这种多态性,可以对植物基因组进行分析筛选;SSR的检测方法快速、技术简便.目前,这项技术已用于多种植物的基因组研究,如基因定位及遗传图谱的建立、数量性状标记、杂种优势的利用等.在一些重要的农作物中,已定为了丰富的SSR位点.随着技术的发展,基于SSR技术的新的标记方法不断出现,如:ISSR、RAMP、REMAP.概述了SSR标记技术的原理和特点;介绍了与实验相关的技术和方法;着重整理了近年来在SSR技术上发展起来的新的标记方法;探讨了SSR在植物基因组研究中的应用.【期刊名称】《沈阳师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(028)001【总页数】3页(P83-85)【关键词】SSR;基因组研究;植物【作者】陆丹;牛楠;李玥莹【作者单位】沈阳师范大学,化学与生命科学学院,辽宁,沈阳,110034;沈阳师范大学,化学与生命科学学院,辽宁,沈阳,110034;沈阳师范大学,化学与生命科学学院,辽宁,沈阳,110034【正文语种】中文【中图分类】S514简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)也被称为微卫星DNA。

这是一种以一个或几个碱基可变次数的串联重复序列。

这些序列广泛存在于真核细胞的基因组内,被认为是一种理想的分子标记。

当今世界上四大标记系统综合效应大小是AFLP>SSR>PAPD>PFLP。

SSR克服了PAPD和PFLP的不足,还兼具它们的优点,在植物基因组研究中具有广阔的应用前景[1]。

Levinson(1987)等研究认为SSR的来源是由于DNA复制时两条链退火分子滑移(molecular slippage),导致后来在DNA复制、修复及重组时产生错误,插入或删除了一个或几个重复单元,使得SSR序列变长或缩短。

中国96个荔枝种质资源的EST-SSR遗传多样性分析

通讯作者，ｄｌｏ１６ｃｍｇｇｘ＠２．ｏ
摘要
根据本实验室已获得的荔枝果皮ｃＮＡ文库ＥＴ序列，过ＳＲＴ在线检索，３３１条ＥＴ序ＤＳ通ＳＩ从９Ｓ
列中，发现３ｓ列共设计１０对ＥＴＳＲ引物，Ｓ．％９ＳＥＴ序０Ｓ —Ｓ其中６２对在荔枝上有扩增产物，０对有扩增多态性，５即具有一定的通用性。接着从９份荔枝种质中选取ｌ６２个
３３ｉｈｉＴｅｕｎｅｒｅｒｅｅｙＳＲＩｏｉ．ｉｈｉｂｏｔ８．９ｏｈｏａ９１ｌｔｃＥＳｓｑｅｃｓｗｅｅｒｔｉｖｄｂＳＴｎｌｎｅｗｈｃｓａｕ９％ｆｔｅｔｔｌＥＳＴｉｒｒ．ｒｍｌｂａｙＦｏｔｅａｏｅＳＳｌｃ，１０ｐａｒｈｂｖＲｏｉｉｓｏｆＥＳＴ— Ｒｉｍｅｓｗｅｅｄｓｇｄ２ｏｆｗｈｉｈｈｖｍｐｌｅｒｄｃｓｉｈｅ０ＳＳｐｒｒｒｅｉｎｅ，６ｃａｅａｉｄｐｏｕｔｎｔｉｆ
关键词荔枝，Ｓ．Ｓ种质资源，传多样性ＥＴＳＲ，遗
ＥＴＳＲＡｎｌｓｆｎｔｖｒｉ６Ｌｔｈ（ｉｈｈｎｎｉＳｎ．Ｓ —ＳａｙｉｏｅｉＤｉｅｓｙｉ９ｉｉＬｔｉｉｅｓｏｎ）ｓＧｅｃｔｎｃｃｃｓ
ＧｅｍｐａｍｓｕｃｓｉｎａｒｌｓＲｅｏｒｅＣｈｉｎ
ＸｉｇＸｕａＯｉｇｉｎｕＬａｘｎ

基于SSR标记的68份红毛丹种质资源DNA指纹图谱构建

基于SSR标记的68份红毛丹种质资源DNA指纹图谱构建近年来，随着生物技术的不断发展，分子标记技术已经成为植物遗传资源研究中的重要手段。

SSR（Simple Sequence Repeat）标记由于其具有多态性强、稳定、易扩增和分析等特点，在种质资源鉴定和遗传多样性研究中得到了广泛的应用。

红毛丹（Mangifera indica L.）作为热带水果树种之一，具有重要的经济价值和潜在的遗传资源价值。

在红毛丹的遗传资源研究中，建立红毛丹种质资源的DNA指纹图谱，对于分类鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面具有重要意义。

本研究采用SSR标记技术，对68份红毛丹种质资源进行了DNA指纹图谱的构建，旨在为红毛丹的种质资源分类鉴定和遗传多样性研究提供有力的支持，为红毛丹的品种鉴定、新品种选育等提供科学依据。

我们收集了68份红毛丹种质资源的叶片样品，并采用CTAB法提取总DNA。

随后，通过筛选已发表的与红毛丹相关的SSR引物，选择了适合红毛丹的SSR引物进行PCR扩增。

在PCR扩增后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对产物进行分离，最终得到了68份红毛丹种质资源的SSR标记数据。

接下来，我们对得到的SSR标记数据进行了分析和处理。

通过调用不同软件进行数据处理和分析，得到了每个红毛丹种质资源的SSR分型数据。

在得到了SSR分型数据后，我们进一步利用相关软件进行了聚类分析和主成分分析，以了解不同红毛丹种质资源之间的遗传关系和遗传多样性。

通过对SSR标记数据的分析，我们发现了68份红毛丹种质资源之间的遗传差异和遗传多样性。

在聚类分析中，我们发现了一些种质资源之间存在较大的遗传差异，也有一些种质资源之间的遗传关系较为接近。

在主成分分析中，我们也发现了不同红毛丹种质资源之间的遗传差异和遗传结构。

这些结果为我们进一步的红毛丹种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究提供了重要的数据支持和科学依据。

通过构建68份红毛丹种质资源的DNA指纹图谱，我们不仅为红毛丹的遗传资源研究提供了重要的数据支持和科学依据，也为红毛丹的品种鉴定、新品种选育等提供了重要的技术手段和理论基础。

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唯一的缺点是 & & & 因为 > > ? 标记具有种族特异性 # 必须采用特异引物进行 [ 故而存在一个引 W ? 检测 # 物开发的问题 " 开发 > 经 > ? 引物的方法概括起来有以下几种 ’
$ ’% $ &% ! 微卫星富集法$ ! 典的筛选基因组文库的方法 $
! ! " # " $ % ’ " ( )% *+ + ,. / 0 " / 12 (3 2 ) 4 5 2 3 2 ) 4 5 24 5 2 ( " ( 1 2 1" &
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)!$ !% # 有取代 ? 锁图谱非常有效的工具 $ I G [ 之势"
$ \ ’ \ !!> > ? 序列的分离应用 K R 9 0和 > 3 Q T V的选择性扩增微卫星
% $ ( ( 法$ 从无核荔枝 @ > @ A) D @ 中分 & 号的基因组 C 离> 经回收 ! 克隆 ! 测序后 # 用> @ A 片段 # N 5 0 . Z 软件 V
收稿日期 ! 修回日期 ! ! % % ’ $ $ $ (" ! % % & % ’ $ )
既是我们目前进行实生大的海南荔枝种质资源库 $ 选种的基础 $ 又是将来杂交育种的源泉 & 在培育荔枝新品种的过程中 $ 最常用的是实生选种和芽变选种 & 而荔枝杂交育种一直都没有采用$ 因为对现有荔枝种质的遗传背景不清楚 & 而要想从更深层次上发掘和利用那些珍贵的宝藏 $ 就必须找到一个强有力的进行荔枝种质分析的工具 & 为此$ 本研究开展了荔枝简单序列重复! > . , / 9> 9 + V $ 标记的研究工作$ 以便为荔枝 N 9 0 7 9? 9 9 5 > > ?" ; V
# " !
遗!传 ! " # " $ % & ’ (( ) * + + ! % % &!!!!!!!!!!!!!!!!! "卷! , .)
群体遗传结构的研究提供一个强有力的 ! 高效的检测手段 " 一旦这套标记开发出来 # 荔枝家系检测 ! 基群体变异! 因流动 ! C D @ 指纹图谱和遗传连锁图谱的构建 ! 与目的基因连锁的荔枝 > > ? 标记的获得! 分子标记的辅助育种等等许多工作都有可能简化 " 关于荔枝种质分析的研究情况 # 最早是对它进行同工酶分析
遗!传 ! ! " # " # " $ % & ’ (! ) * + + ! " " # $ $!# $ "$ ! % % & , ."
研究报告
荔枝 > > ? 标记的研究
李明芳 ! 郑学勤
! 中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 $ 海口 ) " ( $ $ % $
摘!要! 以无核荔枝 @ 应用选择性扩增微卫星 ! 法分离 ’ 克隆了 $ 序 > @ A" % % 个简单序列重复 ! > > ?" & 号为实验材料 $ 列$ 其中 = 可用 & 加上搜索数据库所获得的 $ 个 > 一共 = = 个非重复 $ > ? 序列 $ # 个序列用于特异引物的设计 & 仅从与) 锚定简并引物配对$ 个别相互配对" $ 对其中 ( $ 个序列的 = ! 个基因座设计出特异引物 & 合成 & $ 条特异引物 ! B 的’ 另外 $ 以’ # 个基因座进行检测 & 其中 $ ) 对引物扩增出相应大小的片段 $ $ 对引物扩增出非预期片段 & 最后 $ ( 个荔枝种质的基因组 C 从! 筛选出多态性引物! 获得了! D @ 为模板 $ " 对出带的引物中 $ $对$ !个荔枝基因座特异性> > ? 标记 & 关键词 ! 荔枝 ( 种质 > > ? 标记 ( > @ A 法( 中图分类号 ! E ( )!!! 文献标识码 ! @!!! 文章编号 ! ! " % ! ) ’F# ( ( ! ! % % & % "F% #1 ) / . 4 ) @5 4 5 / 4 2 $ % %> > ?O 9 N 9 0 7 9 OP 9 Q 9 . O 4 / 5 9 R0 R7 / 4 0 9 RS 9 0 O4 2 > @ A! > 9 / 9 7 5 . U 9 / , / . 2 . 9 RA . 7 Q 4 O 5 9 / + ; T, T@ V " / . 5 9 5 9 7 3 0 . N 9 O0 R0 4 5 3 9 Q4 0 9P O4 S 5 . 0 9 RS 9 Q 7 3 . 0 3 9D W X H0 R* A X GR 5 S O 9 O 6 < 3 9 Q 9P 9 Q 9= #> > ?O 9 + ; TO 15 $ 5 3 9V Q . , 9 Q OP 9 Q 9R 9 O . 0 9 R5 = ! / 4 7 . 2 Q 4 ,( $ 2 Q , 9 0 5 O 6 I 4 Q + N 9 0 7 9 ON O 9 R 2 4 QR 9 O . 04 2 O 9 7 . / Q . , 9 Q O 6 @ OQ 9 O N / 5 1 1 ; 1 V V $ $ 5 + 4 0 9O 9 7 . / Q . , 9 Q OP 9 Q 9O 0 5 3 9 O . 8 9 R 5 4R 9 5 9 7 5 ’ #> > ?/ 4 7 . 6 I . 2 + . Q . 0 . 5 3) B 0 7 3 4 Q 9 RR 9 9 0 9 Q 5 9> > ?V Q . , 9 Q T V V T V 1P 1 5 9 9 04 2 5 3 9 ,, / . 2 . 9 R 5 3 97 4 Q Q 9 O 4 0 R . 0 > ?O 9 N 9 0 7 9 O0 RY 5 3 9 Q $ $> > ?V Q . , 9 QV . Q O, / . 2 . 9 R0 4 0 + 9 : 9 7 5 9 R 2 Q + V V 1> ; V V 1 $ , 9 0 5 O 6 H 0 5 3 99 0 R ! $V 4 / , 4 Q 3 . 7V Q . , 9 QV . Q OP 9 Q 9O 9 / 9 7 5 9 R2 Q 4 ,! "V Q . , 9 QV . Q OP 3 . 7 3, / . 2 . 9 R7 / 9 Q0 RQ 4 S N O 5 T V V $ C D @2 Q , 9 0 5 S O . 0 5 3 91 9 0 4 , 9C D @4 2 ’ ( / . 5 7 3 . 9 Q , / O ,, 5 9 Q . / O 0 R! ! / 4 7 N O + O 9 7 . 2 . 7> > ?, Q Z 9 Q OP 9 Q 94 S + 1 TN 1 1 V V 5 . 0 9 R 6 # ( ( 8 " % / ; 1 9 + 1 7 8 + 7 8 + * @ + @( > > ?, Q Z 9 Q O O 9 / 9 7 5 . U 9 / , / . 2 . 9 R, . 7 Q 4 O 5 9 / / . 5 9 9 Q , / O , TV 1 V 9: