荧光定量PCR原理Ct值共55页文档
一文讲清qPCR(荧光定量PCR)的Ct值
一文讲清qPCR（荧光定量PCR）的Ct值做qPCR不可能不知道Ct值。
直到现在，所有做qPCR的童鞋们，都认为Ct值就是荧光定量PCR的YYDS。
真的是这样吗？大家慢慢分析吧，可以未雨绸缪的关注一下。
我在之前的长文中讲到，对qPCR有三阶认识，如果还没有看过的，出门左转-右转-向东-向西-向南-向北，最后点击下面的链接。
不出所料，你必须掉头，再也不回来，因为文章在万里里有点长。
今天我们要说的问题，也是对qPCR的更高阶的认识。
1、Ct值到底是不是YYDS？2、Ct值跟哪些因素有关？3、同样的模板，Ct值大试剂盒就差吗？要不要换试剂盒？先从这张盗版图说起。
你必须了解以下概念和问题。
Ct值-阈值-基线1、阈值循环数（Cycle threshold，Ct值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
这就是荧光定量PCR的理论基础。
2、阈值怎么确定呢？阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。
为什么是10倍，而不是5倍8倍？就是为了和基线拉开距离，证明PCR扩增进入指数扩增期。
为什么不是20倍30倍？因为每个一PCR循环都会放大误差，而此时误差还未被放大。
我们当然可以把阈值设置到30个循环，但是30个循环以后，扩增效率和其它误差带来的数据偏差，估计他妈妈都不认识了。
3、基线又是怎么确定呢？基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。
很显然，基线一变，阈值就改变了，阈值改变，Ct值就跟着改变。
由于每次实验的样本和仪器，甚至混合情况不一样，使得基线有所差异，最终会影响Ct值。
所以拿上一次实验的样本去检测本次实验的Ct值是否一致，本身就是刻舟求剑，没有可比性，所以童鞋们应该明白了，为啥qPCR一做就要放在一起做，就是这个原因。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
荧光定量pcr原理ct值
目的基因克隆
目目的的基基因因
基因组 DNA
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
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质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
平均Ct值
优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增效率为 100 %；
假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
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相对定量分析——2 -△△Ct法
实验数据：
Sample
处理前 处理后
Jun(MeanCt) GAPDH(MeanCt) E
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），
也可通过温度梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同
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内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
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常用荧光标记方法
非特异性荧光标记 SYBR Green I
特异性荧光标记 TaqMan Probe
荧光定量PCR的原理及使用
荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。
其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。
2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。
下面介绍常用的几种检测方法：1、双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。
在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。
SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。
当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。
因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。
SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。
2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。
3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。
4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。
要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。
在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。
2、TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。
由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。
简述荧光定量pcr的基本原理
简述荧光定量pcr的基本原理宝子，今天咱来唠唠荧光定量PCR这个超酷的技术哈。
PCR你可能听说过，就是聚合酶链式反应啦。
它就像一个神奇的复印机，能把咱想要研究的那一小段DNA，不断地复制，让它的数量蹭蹭往上涨。
那荧光定量PCR 呢，它可是PCR的超级进化版哦。
想象一下，咱们有一个装满各种小零件的DNA世界。
在这个世界里，有模板DNA，这就是咱们要复制的蓝本啦。
然后呢，还有引物，引物就像是两个小向导，它们会精准地找到模板DNA上特定的位置，说：“就从这儿开始复制吧！”接着就轮到DNA聚合酶上场啦，这个酶可厉害着呢，它就像一个勤劳的小工匠，按照引物指定的位置，把一个个核苷酸连接起来，慢慢地就把那段DNA复制出来啦。
这是普通PCR干的事儿，但是荧光定量PCR可不止这么简单哦。
荧光定量PCR最特别的地方就是加入了荧光染料或者荧光标记的探针。
这个荧光就像是一个小信号灯。
如果是用荧光染料的话呢，它就像一个很调皮的小精灵，它特别喜欢钻进双链DNA的小缝隙里。
当DNA被不断复制，双链越来越多的时候，这个小精灵就有了更多的藏身之处，然后就会发出荧光啦。
而且呢，荧光的强度和双链DNA 的数量是成正比的哦。
就好像是说，双链DNA越多，这个小信号灯就越亮。
要是用荧光标记的探针呢，这就更有趣啦。
这个探针是一段专门设计的单链DNA，它的一头有个荧光基团，另一头还有个猝灭基团。
这两个基团就像两个小冤家，当探针孤零零地待着的时候，荧光基团发出的光会被猝灭基团给弄没了，就像被小冤家给压制住了。
但是当这个探针和模板DNA结合，也就是在PCR反应过程中，DNA聚合酶在复制的时候会把这个探针给“切开”，这时候荧光基团就自由啦，就开始发出明亮的荧光啦。
那这个荧光有啥用呢？这可太有用啦。
我们可以通过检测荧光的强度来知道咱们复制出来的DNA到底有多少啦。
比如说，最开始的时候，模板DNA可能只有一点点，那荧光就很微弱。
随着PCR反应一轮一轮地进行，DNA不断地被复制，荧光就越来越强。
荧光定量PCR的CT值
PART FOUR 工 作 概 述
2、荧光定量PCR是否为定量方 法？
虽然名字里有“定量”，但是qPCR 的间接定量方式又复杂，又受很多 因素影响，又不准确，在计量领域 是不被认可的。目前的核酸检测方 法中只有数字PCR是真正的定量检测 方法，其余的都是定性检测方法。
PART FOUR 工 作 概 述
PART
关于qPCR中Ct值的几点思考
PART FOUR 关于qPCR中Ct值的几点思考
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1、Ct值能否直接 换算成模板拷贝数？
2、荧光定量PCR是 否为定量方法？
3、Ct值能否作为 评价qPCR试剂盒的 指标？
4、能否通过增加 扩增循环数来增加 试剂盒的敏感性？
PART FOUR 工 作 概 述
PART ONE CT值的基本概念
Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样 品、不同仪器的影响，即使相同的样品 在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存 在差异。
模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线 性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板 量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的 循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期）， 此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同 含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。
3、Ct值能否作为评价qPCR试剂 盒的指标？
qPCR试剂的评价需要从分析敏感性 （最低检测限），分析特异性（交 叉反应），重复性（精密度），诊 断敏感性，诊断特异性等多个指标 去衡量 。仅凭Ct值的高低去判断一 个qPCR试剂盒的优劣太片面，不同 试剂盒的Ct值不具有可比性。有些 试剂盒采取先进行几个循环的预扩 增，再进行正式循环的做法就是为 了使Ct值看起来更低。
定量PCR中_ct值的含义
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一、实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术,就是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1、Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念——Ct值。
C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义就是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。
图1、Ct值的确定2、荧光域值(threshold)的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置就是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10 ´SD cycle 6-153、Ct值与起始模板的关系研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值(如图2所示)。
因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2、荧光定量标准曲线4、荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针与荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下:1）TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团与一个淬灭荧光基团。
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团与淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量pcr实验原理及数据分析
阈值设定
确定荧光信号与背景噪声的界限， 用于计算Ct值。
标准化处理
消除实验间的差异，使数据具有可 比性。
荧光定量PCR数据质量控制
01Biblioteka 0203重复性检验
检查同一样本不同孔之间 的Ct值差异，确保实验可 重复性。
扩增效率评估
通过标准曲线计算扩增效 率，确保实验的准确性。
熔解曲线分析
检查产物的特异性，避免 非特异性扩增对结果的影 响。
荧光定量PCR技术特点
高灵敏度、高特异性、宽线性范围、可重复性好等。
荧光定量PCR技术分类
根据荧光标记物的不同，可分为探针法和染料法两大类。 探针法包括TaqMan探针法、分子信标法等；染料法包括 SYBR Green I染料法等。
02
荧光定量PCR实验原理
PCR技术基本原理
DNA聚合酶作用
PCR技术利用DNA聚合酶的酶促反应， 以单链DNA为模板，合成与之互补的 双链DNA。
多重荧光定量PCR技术的完善与应用
未来将继续优化多重荧光定量PCR技术，提高检测的准确性和通量，并拓展其在临床诊 断和个性化医疗等领域的应用。
与其他技术的融合与创新
荧光定量PCR技术可以与其他技术如质谱技术、蛋白质组学技术等相结合，实现多组学 数据的整合分析，为生物医学研究提供更全面的信息。
THANKS
酶浓度
酶的浓度直接影响扩增效率，需根据实验需 求进行优化。
dNTP浓度
dNTP浓度过高会导致非特异性扩增，过低 则会影响扩增效率，需进行优化。
反应体积
反应体积的大小会影响扩增效率和荧光信号 的检测，需根据实验需求进行调整。
05
荧光定量PCR技术在生物医 学研究中的应用
荧光定量PCR原理-Ct值
目录
CONTENTS
• 荧光定量PCR原理 • CT值概念 • 荧光定量PCR实验步骤 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的局限性 • 荧光定量PCR的发展趋势
01 荧光定量PCR原理
荧光染料与DNA结合原理
荧光染料与DNA结合
荧光染料是一种能够与DNA结合的物质，通过荧光染料与DNA的结合，可以 实现对DNA的定量检测。
突变定位
荧光定量PCR结合特定设计的引物和探针，可以对突变进行精确定位，有助于研究突变的生物学效应和临床意义。
病原体检测
病原体鉴定
荧光定量PCR可以对病原体进行快速、准确的鉴定，通过检测特定病原体的核酸序列，可以确定感染 的病原体种类，有助于疾病的诊断和治疗。
病原体载量监测
荧光定量PCR可以用于监测病原体在体内的载量，通过比较不同时间点的CT值，可以了解病情的发展 和治疗效果，为制定治疗方案提供依据。
荧光定量PCR技术可以用于检测特定 基因的表达水平，通过比较不同样本 中目标基因的CT值，可以计算出基因 的表达差异，有助于研究基因功能和 疾病发生机制。
基因表达差异分析
荧光定量PCR可以检测同一基因在不 同组织或不同处理条件下的表达差异， 有助于理解基因的调控机制和功能。
突变检测
突变筛查
荧光定量PCR可以用于检测基因突变，通过比较野生型和突变型DNA的扩增效率，可以确定是否存在突变，有助 于遗传性疾病的诊断和筛查。
蛋白质组学技术
将荧光定量PCR与蛋白 质组学技术相结合，实 现对蛋白质的表达和功 能进行检测和分析。
生物信息学技术
将荧光定量PCR与生物 信息学技术相结合，实 现对基因和蛋白质表达 数据的整合、分析和挖 掘。
定量PCR中_ct值的含义
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´SD cycle 6-153. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。