层析介质的寿命和清洗方法
层析介质的寿命与层析介质的清洗验证
●
●
当层析介质寿命的小规模试验确定后， 确认生产规模下的安 全因子。
小规模试验 (Scale-down) 设计要求：
1.使用生产规模的生产物料
2.与生产规模设计一致的层析系统以及层析柱
3.装柱质量 (柱效以及对称性等) 与生产规模一致 4.按照生产规模层析柱体积与样品的比例上样 5.保持与生产规模一致的线性流速 6.将生产规模中层析介质的储存时间记入循环时间中
层析介质的寿命与层析介质的清洗验证
前言 在近 20-30 年生物技术在中国得到了迅猛的发展。 随着生物 制药技术的 发展，生物药物的质量越来越得到重视。生物药 物从研究到上市， 其过程包 括， 实验室成果转化到临床试验， 最终由患者广泛应用。 药物研发成功的关键 是药物的有效性， 同时药物的安全性更为重要。我们需要在严格确保高质量 的 同时，不影响其有效性及工艺的稳定性。这就是法规部门的 要求。 清洗验证是工艺验证中的一项重要部分， 验证是 cGMP 所要 求的“证明 任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统 确实能导致预期结果的有 文件证明的一系列活动” 。 在生物药物的生产过程中，层析技术是其中最关键的步骤。 生物药物通 过培养，收集，经过层析介质的纯化，最终得到 符合要求的生物药物产品。 在生物制药的分离纯化过程中， 培养的物料通过层析介质分离纯化，得到符 合要求的目标产 品。同时，物料中的杂质也污染了层析介质。这些污染物包 括：宿主的蛋白、核酸、脂类，培养过程中的代谢产物、内 毒素、杂菌以及 可能的层析系统的泄漏，试剂中的杂质。这 些污染物在下一次的分离纯化中 将污染目标产品。所以必须 去除或将其降低到安全水平。这就是我们所提到 的层析介质 的清洗(CIP) 过程。 通过您的试验证明清洗有效且污染物的残 留 已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。层析介质是一 种消耗品，层析介 质的经过一段时间使用，清洗后，污染物 的残留量超过了安全水平，那么层 析介质的寿命就到期了，只有更换新的层析介质才能保证生物药品的质量。
GST亲和层析介质使用说明书
GST亲和层析介质使用说明书一、简介GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。
二、性能参数三、适用范围分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
四、操作说明1. 缓冲液配制缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。
缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。
因Glutathione易氧化，需现用现配。
（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。
2. 样品预处理：按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。
3. 装柱：聚苯乙烯层析柱1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。
博格隆疏水层析介质清洁验证
博格隆疏水层析介质清洁验证博格隆疏水层析介质是一种常用于分离和纯化蛋白质的技术。
在使用疏水层析介质之前，需要对其进行清洁验证，以确保其性能和稳定性。
本文将介绍博格隆疏水层析介质清洁验证的重要性和方法。
清洁验证是指通过一系列实验和测试，评估疏水层析介质的清洁程度和性能是否符合要求。
这对于保证层析过程的准确性和可靠性至关重要。
如果疏水层析介质存在污染物或杂质，可能会影响到蛋白质的分离效果，导致结果的偏差甚至失真。
在进行清洁验证之前，首先需要准备一定量的博格隆疏水层析介质样品。
然后，可以选择不同的方法进行清洁验证。
常见的方法包括高效液相色谱（HPLC）、电泳、质谱等。
这些方法可以帮助检测疏水层析介质中的杂质和污染物，并评估其清洁程度。
高效液相色谱是一种常用的清洁验证方法。
通过将疏水层析介质样品注入色谱柱中，然后使用适当的溶剂体系进行洗脱，可以检测出不同组分的峰。
如果样品中存在杂质或污染物，这些峰的形状和强度可能会发生变化。
通过与纯净样品进行比较，可以评估疏水层析介质的清洁程度。
电泳也是一种常用的清洁验证方法。
通过将疏水层析介质样品加入到凝胶中，然后进行电泳分离，可以观察到不同组分的迁移情况。
如果存在杂质或污染物，这些组分的迁移速度和迁移距离可能会有所改变。
通过与纯净样品进行比较，可以评估疏水层析介质的清洁程度。
质谱也可以用于清洁验证。
通过将疏水层析介质样品加入到质谱仪中进行检测，可以获得不同组分的质谱图谱。
如果存在杂质或污染物，这些组分的质谱图谱可能会有所变化。
通过与纯净样品进行比较，可以评估疏水层析介质的清洁程度。
在进行清洁验证时，需要注意选择合适的方法和条件。
不同的方法适用于不同类型的疏水层析介质，因此需要根据实际情况进行选择。
同时，还需要注意样品的制备和处理过程，避免引入新的污染物或杂质。
总结起来，博格隆疏水层析介质清洁验证是确保层析过程准确性和可靠性的重要步骤。
通过选择合适的清洁验证方法，可以评估疏水层析介质的清洁程度和性能是否符合要求。
层析填料寿命如何界定
层析填料寿命如何界定层析填料是目前常用的分离物质的工业设备之一、它广泛应用于化工、制药、食品、环保等行业中的分离、纯化、浓缩等工艺。
填料的寿命是指填料在使用过程中能够保持预定的分离效果和性能的时间。
填料的寿命界定是为了保障工艺的可靠性和稳定性，延长设备的使用寿命，降低企业的运营成本。
本文将从填料的特点、衰减机制、寿命评估和延长寿命的方法等方面，对层析填料寿命的界定进行探讨。
一、填料的特点层析填料作为一种固定相，承担着吸附和分离物质的功能。
填料具有大比表面积、较高的孔隙度和孔径分布，能够提供丰富的吸附位点和通道，从而实现对不同组分的分离。
填料的物理化学性质和结构特点决定了其在使用过程中的效果和性能。
常见的层析填料有树脂、玻璃、陶瓷等。
二、填料的衰减机制填料在使用过程中会受到多种因素的影响，导致其效果和性能逐渐下降。
常见的填料衰减机制包括吸附位点饱和、物理磨损、化学腐蚀、结构变化等。
吸附位点饱和是由于填料吸附一段时间后，填料表面的活性位点逐渐饱和，降低了吸附容量和选择性。
物理磨损是填料在使用过程中由于颗粒之间的摩擦和碰撞造成的表面磨损，降低了填料的表面积和孔隙度。
化学腐蚀是填料在腐蚀性介质中化学反应导致的填料表面的物理结构和化学组成的改变。
结构变化是填料在使用过程中由于温度、压力等外部条件的变化引起的填料内部结构发生变化，从而影响了填料的分离性能。
三、填料寿命的评估填料寿命的评估是通过一系列方法和指标来评估填料的衰减情况和寿命是否到期。
常见的评估指标包括吸附容量、选择性、压力损失、归一化高度等。
吸附容量是指单位质量或单位体积填料吸附物质的能力，是衡量填料性能好坏的重要指标。
选择性是指填料对不同组分的区分能力，选择性越高，说明填料分离效果越好。
压力损失是指在一定流速下，填料对流体的阻力大小。
压力损失越大，说明填料孔隙度和通道状况越差，衰减越严重。
归一化高度是填料层高度和填料颗粒直径的比值，可用于评估填料的压缩程度和颗粒大小变化程度。
层析填料寿命如何界定
层析填料寿命如何界定层析填料寿命如何界定1. 引言层析技术是生物制药下游工艺中的核心技术，在生物制药工艺中层析工艺占有较高的成本，生物制药下游工艺成本中层析工艺通常会高达60%以上，而层析填料作为层析过程的核心耗材，层析填料的使用寿命直接关系到整个层析工艺的成本。
那么如何界定填料的寿命呢？2. 填料寿命的界定层析填料寿命的界定通常指在特定工艺条件下使用过程中，从开始使用到使用时与设定的工艺指标发生偏差的使用次数或者性能（回收率，纯度）趋于下降的趋势时的使用次数。
层介质质用途广泛，在生物制品，血液制品，疫苗，生物制药，日化，医疗器械等领域用做纯化生物大分子或者固定化合物。
不同应用领域或不同应用方式对寿命的界定完全不同。
在生物制药或生物制品行业用来纯化生物大分子时，寿命通常与cGMP或FDA 等法规要求的工艺安全性，稳定性及有效性有关，当使用层析介质的过程中，工艺过程指标发生设定的偏差时寿命就到期了或者预工艺要求指标有偏差趋势时寿命终止。
层析填料用在医疗器械行业用于固定化合物时，通常没有寿命一说，更多的是固定化合物之后的一个保质期或有效期。
抛开工艺过程谈层析填料的寿命没有任何意义。
层析填料的载量，流速是评价其品质的主要指标，寿命并非层析填料的一个指标，结合使用时的工艺指标及载量，流速可以判定介质的使用寿命，也就是说使用寿命可以用载量，流速的变化来表征。
3. 填料寿命认知误区(1) 填料的寿命是使用过程中呈现的，并非填料性能指标。
(2) 在界定填料寿命时，首先要明确使用的属性，确立判断指标，比如纯化生物大分子时纯度及收率的偏差范围等。
(3) 填料寿命都是基于一个特定的工艺过程和目的导向，不同的工艺过程寿命的判断标准及界定有所差异。
如纯化生物大分子时主要考虑其收率及纯度偏差，用于去除内毒素或者HCP时主要考虑其去除率的偏差。
4. 填料寿命界定举例如用 SP Focurose HPR纯化VLP疫苗，根据VLP疫苗的制备SOP,其经此步层析的收率确定在80%偏差5%以内，纯度定为85%偏差5%以内。
层析填料寿命验证实验设计攻略
层析填料寿命验证实验设计攻略层析填料寿命验证实验设计攻略1. 引⾔层析技术是⽣物制药下游⼯艺中的核⼼技术，在⽣物制药⼯艺中层析⼯艺占有较⾼的成本，⽣物制药下游⼯艺成本中层析⼯艺通常会⾼达60%以上，⽽层析填料作为层析过程的核⼼耗材，层析填料的使⽤寿命直接关系到整个层析⼯艺的成本。
如何设计层析填料寿命验证的实验呢？2. 填料寿命验证的理论依据层析介质的寿命界定是通过使⽤过程⼯艺指标的偏差去判断的，那么验证寿命就是使⽤过程偏差发⽣之前的使⽤过程的积累。
验证是通过⼩试实验数据的积累统计分析去完成的。
(1) ⼩试验证实验设计⼩试验证实验是为中试及⽣产提供可靠的依据，在设计⼩试实验时，就要明确层析过程线性放⼤的各种因素及对层析过程有影响的各种因素，综合层析过程放⼤因素及层析过程影响因素来设计⼩试验证实验。
【层析过程放⼤因素】(1) 须保持⼀致的因素：柱床⾼度，层析柱及层析系统类型，线性流速，样品状态及属性，层析过程（平衡，清洗，洗脱体积数及缓冲液种类），清洗试剂的种类及清洗过程，柱效。
(2) 可线性放⼤因素：体积流速，柱床体积。
【层析过程影响因素】环境温度对层析过程有⼀定影响，特别在疏⽔层析过程中，环境因素对层析过程影想较⼤。
环境洁净程度对层析过程，特别是精纯阶段及去内毒素时影响很⼤。
⼈为因素，最难控的因素对层析过程的影响也很⼤。
建⽴SOP及有效可靠的过程监控⽅法是避免⼈为因素对层析过程的稳定可靠的⼀种⽅式。
【寿命验证⼩试实验设计】(1) 在设计⼩试验证实验时需保证层析过程放⼤因素和中试及⽣产规模保持⼀致的因素完全⼀致，可根据层析过程中的可线性⽅⼤因素设计试验规模及层析柱和层析系统的选型。
(2) 避免层析过程影响因素对结果的影响。
设计⼩试实验室必须在⽣产所要求的环境温度及洁净车间进⾏，并且严格执⾏过程SOP，且要对过程进⾏可靠的监管。
3. 寿命验证实验设计寿命验证实验设计必须能够完全反映商业化⽣产规模的性能，寿命验证实验必要要商业化⽣产规模之间的相关性。
层析介质的寿命和清洗方法
ÄKTA ClubGE Healthcare热线电话：800-810-9118；400-810-9118层析介质的寿命和清洗方法一、层析介质寿命的判断标准：判断层析介质的寿命主要以下列参数与产品生产的SOP 做对比，如不在SOP 的控制范围内，说明层析介质应该更换了。
1. 产品的的性质：产品的纯度、收率2. 杂质的性质：杂质的含量 (HCP 、DNA 、聚体)3. 层析介质在生产中的参数：载量、洗脱峰的保留时间，洗脱峰的对称性等4. 层析介质的运行的参数：压力、流速、柱高、再生、在平衡的UV/pH/Cond 等参数5. 泄漏：层析介质的配基泄漏 (尤其为亲和介质的配基泄漏是否在规定的水平)二、层析介质的清洗方法：在位清洗（CIP ）和在位消毒（SIP ）对延长介质的使用寿命十分重要。
对于不同的污染物来说，有不同的清洗条件，以下介绍不同的污染物使用的清洗试剂。
• 可溶性杂质蛋白的清洗 离子交换介质 CIP 柱床体积 接触时间 2M NaCl 0.5 10‐15min 疏水层析介质 CIP 柱床体积 接触时间低离子强度的缓冲液或水30% 异丙醇2-3 2-310-15min 10-15min• 沉淀蛋白杂质的清洗方法CIP 柱床体积接触时间a. 1M NaOHb. 水c. 2M NaCl (除HIC)或 1M NaOH + 1M NaCl 4 CV 1.5CV 1CV 4CV2h 2h 2h或使用盐酸胍需要优化• 疏水性蛋白杂质或脂蛋白杂质 方法 CIP 柱床体积 接触时间0.5-1M NaOH 41‐2h • 脂类杂质的清洗 方法 CIP 柱床体积 接触时间 a. 0.5-2M NaOH 4 1-2h b. 0.5% 非离子去污 4 41‐2h 1‐2h对于吸附较强的脂类杂质可以优化70% 乙醇，30%异丙醇的方法1．杂蛋白的清洗：在物料中含有大量的杂蛋白，这些杂蛋白根据性质不同，可分为：可溶性杂蛋白、沉淀在层析介质、疏水性蛋白、脂蛋白或脂类。
如何有效提升层析填料使用寿命
如何有效提升层析填料使用寿命1 背景介绍层析技术是生物制药下游工艺中的核心技术，在生物制药工艺中层析工艺占有较高的成本，生物制药下游工艺成本中层析工艺通常会高达60%以上，而层析填料作为层析过程的核心耗材，层析填料的使用寿命直接关系到整个层析工艺的成本。
那么我们如何有效的降低层析填料寿命的衰减呢？层析填料随着其重复的装柱，重复接触待纯化的样品，层析工艺过程的各种缓冲液，维护保养（再生，清洗CIP，消毒，保存）过程而使其动态载量及收率下降，非特异性吸附反压增大的变化导致的寿命衰减或者终止。
层析填料寿命的衰减会影响整个工艺过程的成本，且衰减导致填料性能的变化而不能持续有效的满足工艺要求。
2 影响层析填料寿命衰减的因素（1）重复装柱层析过程是填料装填在层析柱中，由于层析体系的漏气，层析柱密封圈的更换等因素导致的必须拆装柱，每次装柱的过程都涉及到填料的脱气处理，及装填柱床时的压缩柱床，然后脱气时的超声或者抽滤都会对填料施压，压缩柱床也要对填料施压，反复的施压及压力控制不当也会使填料的物理性能发生变化从而影响填料的寿命。
（2）样品的状态a.样品澄清度：样品越澄清对填料的寿命影响越小；b.样品粘度：样品的粘度越小，对填料寿命的影响越小；c.样品酸碱度：过酸过碱都会加速填料寿命的衰减；d.样品离子强度：离子强度越高填料寿命衰减的越快；e.样品成分组成：样品成分越复杂，层析过程越复杂，填料的寿命衰减越快。
（3）层析工艺a.柱床高度，流速及反压越大，工艺过程填料受到的外力就会增大，填料的寿命衰减就会增大；b.层析工艺过程的缓冲液的种类及洗脱的CV数也会影响填料的寿命，缓冲液越温和对填料寿命衰减影响越小，洗脱CV数越小对填料寿命衰减影响越小。
（4）维护保养合理的维护保养过程可以降低填料寿命的衰减，但是维护过程的CIP及消毒过程通常都需要剧烈的条件，如强酸强碱等，所以CIP的强度及频率越大对填料的寿命衰减影响越大。
既要及时对填料进行维护保养，又要避免清洗过程对填料寿命的影响，故而层析工艺过程中CIP策略是非常重要的组成部分。
层析系统清洗工艺流程
层析系统清洗工艺流程
1、可溶性杂蛋白的清洗方法
a.凝胶过滤介质：一般使用0.1-0.5M 的NaOH清洗0.5-1 个CV；然后超纯水1-2CV；
b.离子交换介质：2M NaCl清洗0.5 CV；或至少接触10-15 min；
c.疏水层析介质：超纯水(低离子强度的缓冲液) 清洗2-3 个CV，或使用30%异丙醇清洗2-3个CV；
d.亲和层析介质：根据层析介质的性质使用适当的缓冲液清洗可溶性杂蛋白。
2、沉淀蛋白的清洗方法
a.一般层析介质(GF/IEX/HIC) 的清洗方法：0.5-1M NaOH清洗3-4个CV，然后使用超纯水冲洗pH至中性；
b.亲和层析介质：使用尿素或盐酸胍清洗1-2个CV。
3、疏水性杂蛋白或脂蛋白的清洗方法
a.一般层析介质(GF/IEX/HIC)的清洗方法：0.5-1M NaOH清洗3-4个CV，然后使用超纯水冲洗pH至中性；
b.亲和层析介质：使用尿素或盐酸胍清洗1-2个CV。
4、脂类杂质的清洗方法
0.5%的非离子去污剂清洗3-4个CV，对于吸附较强的脂类可以优化70%的乙醇或30%的异丙醇清洗。
5、核酸的清洗方法
一般可以选择用1M NaCl加1M NaOH清洗3-4CV,亲和层析介质要根据介质的性质类型选择不同清洗方法。
6、色素的清洗
不同培养液不同来源的色素的清洗过程差异较大，可根据介质的性质及色素的性质进行清洗，碱、酸、有机溶剂、及去污剂，变性剂等，需要尝试。
7、内毒素的清洗方法
内素素的清洗通常用0.5-1M NaOH清洗1-2CV之后，然后使用超纯水冲洗至中性。
亲和层析介质可通过0.5%的非离子型去污剂及有机溶剂的方式清洗内毒素。
层析介质的寿命与层析介质的清洗验证
层析介质的寿命与层析介质的清洗验证前言在近20-30年生物技术在中国得到了迅猛的发展。
随着生物制药技术的发展，生物药物的质量越来越得到重视。
生物药物从研究到上市，其过程包括，实验室成果转化到临床试验，最终由患者广泛应用。
药物研发成功的关键是药物的有效性，同时药物的安全性更为重要。
我们需要在严格确保高质量的同时，不影响其有效性及工艺的稳定性。
这就是法规部门的要求。
清洗验证是工艺验证中的一项重要部分，验证是cGMP所要求的“证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能导致预期结果的有文件证明的一系列活动”。
在生物药物的生产过程中，层析技术是其中最关键的步骤。
生物药物通过培养，收集，经过层析介质的纯化，最终得到符合要求的生物药物产品。
在生物制药的分离纯化过程中，培养的物料通过层析介质分离纯化，得到符合要求的目标产品。
同时，物料中的杂质也污染了层析介质。
这些污染物包括：宿主的蛋白、核酸、脂类，培养过程中的代谢产物、内毒素、杂菌以及可能的层析系统的泄漏，试剂中的杂质。
这些污染物在下一次的分离纯化中将污染目标产品。
所以必须去除或将其降低到安全水平。
这就是我们所提到的层析介质的清洗(CIP) 过程。
通过您的试验证明清洗有效且污染物的残留已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。
层析介质是一种消耗品，层析介质的经过一段时间使用，清洗后，污染物的残留量超过了安全水平，那么层析介质的寿命就到期了，只有更换新的层析介质才能保证生物药品的质量。
1、层析介质寿命的影响因素：●物料的类型以及该层析介质所在工艺中纯化步骤●层析介质的类型●层析柱的维护●整个层析系统的组成●层析柱的装柱质量●试剂等的质量1.1物料的类型: 物料是指生物生产过程中含有目标产品的料液。
物料的类型是影响层析介质寿命的关键因素。
不同的物料中含有的杂质不同。
如：大肠杆菌的培养液中，培养液的上清液中约为10种蛋白，在外膜与内膜间的胞质中约含100种蛋白质，而细胞膜内的细胞质中含有2000种蛋白质，在细胞质中还含有核酸、脂类等非蛋白的杂质。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ÄKTA Club
GE Healthcare
热线电话：800-810-9118；400-810-9118
层析介质的寿命和清洗方法
一、层析介质寿命的判断标准：
判断层析介质的寿命主要以下列参数与产品生产的SOP 做对比，如不在SOP 的控制范围内，说明层析介质应该更换了。
1. 产品的的性质：产品的纯度、收率
2. 杂质的性质：杂质的含量 (HCP 、DNA 、聚体)
3. 层析介质在生产中的参数：载量、洗脱峰的保留时间，洗脱峰的对称性等
4. 层析介质的运行的参数：压力、流速、柱高、再生、在平衡的UV/pH/Cond 等参数
5. 泄漏：层析介质的配基泄漏 (尤其为亲和介质的配基泄漏是否在规定的水平)
二、层析介质的清洗方法：
在位清洗（CIP ）和在位消毒（SIP ）对延长介质的使用寿命十分重要。
对于不同的污染物来说，有不同的清洗条件，以下介绍不同的污染物使用的清洗试剂。
• 可溶性杂质蛋白的清洗 离子交换介质 CIP 柱床体积 接触时间 2M NaCl 0.5 10‐15min 疏水层析介质 CIP 柱床体积 接触时间
低离子强度的缓冲液或水
30% 异丙醇
2-3 2-3
10-15min 10-15min
• 沉淀蛋白杂质的清洗
方法
CIP 柱床体积
接触时间
a. 1M NaOH
b. 水
c. 2M NaCl (除HIC)
或 1M NaOH + 1M NaCl 4 CV 1.5CV 1CV 4CV
2h 2h 2h
或使用盐酸胍
需要优化
• 疏水性蛋白杂质或脂蛋白杂质 方法 CIP 柱床体积 接触时间
0.5-1M NaOH 4
1‐2h • 脂类杂质的清洗 方法 CIP 柱床体积 接触时间 a. 0.5-2M NaOH 4 1-2h b. 0.5% 非离子去污 4 4
1‐2h 1‐2h
对于吸附较强的脂类杂质可以优化70% 乙醇，30%异丙醇的方法
1．杂蛋白的清洗：
在物料中含有大量的杂蛋白，这些杂蛋白根据性质不同，可分为：可溶性杂蛋白、沉淀在层析介质、疏水性蛋白、脂蛋白或脂类。
参见下列内容：不同类型的杂蛋白的在位清洗程序。
1.1可溶性杂蛋白的清洗方法
a. 凝胶过滤介质：一般使用0.1-0.5 M 的NaOH 清洗0.5-1 个 (CV) 柱床体积；然后超纯水1-2
CV
b.
离子交换介质：2 M NaCl 清洗0.5 CV ；或至少接触10-15 min
c. 疏水层析介质：超纯水 (低离子强度的缓冲液) 清洗2-3 个CV ，或使用30%异丙醇清洗2-3 个CV
d. 亲和层析介质：根据层析介质的性质使用适当的缓冲液清洗可溶性杂蛋白
ÄKTA Club
GE Healthcare
热线电话：800-810-9118；400-810-9118
1.2 沉淀蛋白的清洗方法
a. 一般层析介质 (GF/IEX/HIC) 的方法：0.5-1 M NaOH 清洗3-4 个 CV ，然后使用超纯水冲洗pH 至中性
b. 亲和层析介质：一般使用尿素或盐酸胍清洗1-2 个 CV
1.3 疏水性杂蛋白或脂蛋白的清洗方法
a. 一般层析介质 (GF/IEX/HIC) 的方法：0.5-1 M NaOH 清洗3-4 个 CV ，然后使用超纯水冲洗pH 至中性
b. 亲和层析介质：一般使用尿素或盐酸胍清洗1-2 个 CV
1.4 脂类杂质的清洗方法
a. 0.5%的非离子去污剂清洗3-4 个 CV ，对于吸附较强的脂类可以优化70%的乙醇或30%的异丙醇清洗
2．内毒素的去除
内毒素是生物制药工艺生产中必须去除的物质，NaOH 对内毒素有较好的去除效果，在内毒素的去除试验中0.5-1.0 MNaOH 的浓度作用4-6 h 会有较好的效果。
但是在实际的生产中，如果是连续生产中的CIP 时，一般使用0.1-0.5 M NaOH 接触15-30 min 或清洗1个CV 就可完成去除残余内毒素以及层析介质的消毒工作。
对于已经保存了一段时间的层析介质，一般需要较长的时间，做去除内毒素与消毒工作。
右图所示为不同浓度的NaOH 去除内毒素所需的时间 (去除前溶液内毒素浓度100 ng/ml)。
在内毒素挑战试验中 (Bioprocess 系统＋BPG 层析柱＋Q Sepharose
Fast Flow)，上样中含1200EU/ml 的内毒素，室温23 h 保存。
使用1 M NaOH 去除系统中的内毒素，然后使用无菌水冲洗至pH 中性。
检测TOC 以及LAL 。
证明1 M NaOH 处理1 小时后可以对系统的内毒素 完全去除。
3．核酸：
核酸带负电，与阴离子交换吸附较强，实践证明1 M NaOH+ 1 M NaCl 对核酸的去除效果较好。
4．病毒：
病毒的灭活在工业生产中是极为重要的。
尤其是动物细胞来源的表达产物，对病毒的要求较高。
NaOH 对病毒的灭活有较好的作用，请参看GE Healthcare 公司的应用文献18-1124-57 AF 《氢氧化钠用于层析介质及系统的清洗和消毒》。
根据以上所述，NaOH 在层析介质的清洗和消毒中有重要的作用，有时可以将NaOH 的在位清洗 (CIP) 与在为消毒 (SIP)合并为一步，在CIP 的同时做消毒的工作。