第9章 催化策略(刘建华)解析

Ser 195的侧链与His 57的咪唑环形成氢键，咪唑环的 NH又与Asp 102形成氢键，活性位点氨基酸残基这样 的排布称为 催化三联体。
这种排布使Ser 195特别活泼。组氨酸残基定位Ser残基侧链，极 化Ser侧链的羟基（去质子）。底物存在时，His 57侧链接受Ser 195侧链羟基的质子，因此His 57是碱催化剂。Ser 195丢失氢离 子，产生烷基氧离子，其亲核性比羟基大得多。Asp 102协助 His57定位，通过氢键和静电相互作用使His 57更能接受Ser 195 的质子。
第7步： His 57作为酸催化剂，提供质子导致四面体 碳原子崩溃，断裂形成羧基。
第8步：释放羧酸产物和游离酶。
图9.8 胰凝乳蛋白酶水解肽键的催化反应 可以解释共价催化和酸碱催化机制。反应过 程包括8步：（1）底物结合；（2）丝氨酸亲核攻击肽键的羰基碳原子；（3）四面体 崩溃；（4）氨基组分释放；（5）分释放。虚线表示氢键。
图9.2 胰凝乳蛋白酶具有一个高度活泼的丝氨酸。用 DIPF 处 理，胰凝乳蛋白酶分子28个丝氨酸残基中 195位丝氨酸 与DIPF 反应，导致胰凝乳蛋白酶失活。
图9.3 颜色底物。胰凝乳蛋白酶水解 N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基 苯酚酯 产生 黄色产物对硝基苯酚。在pH7.0，对硝基苯酚解离。
Berg • Tymoczko • Stryer
Biochemistry
Sixth Edition
Chapter 9: Catalytic Strategies
( 催化策略 ）
Copyright © 2007 by W. H. Freeman and Company
国际象棋和酶都使用策略，国际象棋通过比赛发展策略，而酶则通 过进化建立酶促反应机制。右边是能够酶切肽键的活性位点，由三 个氨基酸残基（化学键是白色）构成。用黑色化学键表示的底物分 子如同左边比赛中已经落入圈套的国王，面临被裂解的命运。
胰凝乳蛋白酶促水解反应的两个步骤涉及酶与底物的共价结 合（图9.5）。第一步，底物的酰基与酶共价结合，同时释放 对硝基苯酚或胺类（如果底物是酰胺键）。酶-酰基复合物称 为酰化酶中间物。第二步，酰化酶中间物水解，释放底物的 羧酸组分和游离酶。酶酰化并释放对硝基苯酚的速度很快， 但是水解酰化酶“恢复”游离酶的速度很慢。
第3步，四面体崩溃产生酰化酶。His57的正电荷侧链给 要断裂肽键的氨基提供质子（酸催化）。
第4步，断裂肽键的氨基成分离开酶
第二阶段是酶的脱酰反应。
酰化酶酯键的水解反应基本上是重复第2至第4步。
第5步：水分子占据先前底物氨基成分所在的位置。
第6步：His 57（作为碱催化剂）的咪唑环吸收水分 子的质子，产生的OH-离子攻击酰基的碳原子，形 成四面体碳原子。
每类酶的催化机制能解决各种化学反应所面临 的问题。
•蛋白酶：将缺乏催化剂和pH 7.0几乎不发生的反应 (蛋 白质水解）进行下去。
•碳酸脱水酶：将化学反应加速到能够与其他快速生理 过程融合的水平。
•限制性内切酶：实现酶切反应的高度特异性。
•NMP激酶：把磷酸基团从ATP转移给另一个核苷酸（ 而不会转移到水分子）。
停留法(stopped-flow method) 检测反应的起始状态，能够在毫 秒范围内混合酶和底物、跟踪毫秒时间内的反应结果。结果显 示起始状态迅速形成一种颜色产物，随后缓慢（即进入稳态） （图9.4）。这些结果提示：酶促反应过程有两个步骤，第一步 很快，第二步很慢。
图9.4 胰凝乳蛋白酶催化的动力学。酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸p-硝基苯酚酯有两个阶段：快速（稳态前）阶段和稳态阶段。
图9.5 共价催化。胰凝乳蛋白酶水解有两个阶段：（A）酰化形 成酰化-酶中间体；随后(B)去酰化释放游离酶。
图9.6 1967年 David Blow 解析了胰凝乳蛋白酶的三维结构。
球状、三条多肽链、二硫键连接在一起。
酶促活性位点有Ser 195，位于酶表面的裂缝中（图9.6）。活性 位点的结构说明Ser 195特别活泼（图9.7）。
酶采用的几个基本的催化原则
底物与酶结合启动催化。结合能是酶和底物 之间形成大量弱相互作用所释放的自由能。 这种结合能 既可建立底物特异性，又能增 加酶促效率。当底物转化成转化态，底物与 酶之间完全互补。因此底物和酶之间的相互 作用稳定转化态，从而降低反应的活化自由 能。结合能对底物和酶分子的结构变化都有 促进作用，使它们相互间匹配度更高（诱导 匹配），有助于催化反应。
酶催化效率高、特异性强、条件温和。 这些特征的基础是什么？
介绍四类酶促反应的机制：丝氨酸蛋白酶、碳 酸脱水酶、限制性核酸内切酶、和核苷单磷酸 激酶。前三类将水分子加成到底物分子上，第 四类避免水分子的加成。
经过大量的实验研究（包括蛋白质结构测定、 定点突变），发现：酶的催化机制基本策略是 结合能、诱导匹配、和一些特殊的催化策略， 协助底物形成转化态
第一阶段反应（酶的酰化）：
第1步：底物与酶结合。
第2步： His57 （碱催化）接受Ser 195质子，后者的氧 亲核攻击目标肽键的羰基碳原子，使这个碳从平面结构 转化成四面体结构。羰基碳原子的四面体结构不稳定（ 因为羰基原来的氧原子带有负电荷），但是氧负离子与 酶蛋白的氧负离子洞的NH基团（图9.9）相互作用稳定 ，从而稳定羰基碳原子四面体（转化态）。
4. 金属离子催化。金属离子起催化作用的方式有几种：有的是配 位作用产生OH-离子（亲核试剂）；有的本身是亲电试剂，稳 定带负电荷的中间体；还有的作为底物与酶结合的桥梁，增加 结合能、将底物置于酶分子合适位置适于催化。
蛋白酶能促进非常难于发生的反应
图9.1 胰凝乳蛋白酶的特异性。裂解芳香氨基酸或大的疏水氨基 酸（已经用桔色涂出）C-端肽键（用红色标出）。
酶通常采用下列一种或几种策略催化特定化学反应。
1. 共价催化。共价催化的活性位点有活泼基团，通常是很强的亲 核基团。在酶促过程中亲核基团能暂时性共价连接底物。胰凝 乳蛋白酶就采用这种策略。
2. 酸碱催化。酸碱催化中，水分子之外的物质提供质子或接受质 子。
3. 接近催化。很多酶有两个不同的底物，将两种底物置于一个酶 分子的同一结合面能显著增加反应速度。