微核试验课件(专业教学)

4、M期(有丝分裂期)：前期，早中期，中期， 后 期（微核形成期），末期
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图13-1 细胞周期可划分为四个阶段
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微核（micronucleus）
是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体 受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在 细胞质中，末期后，单独形成一个或几个规则的 次核，包含在子细胞的胞质内，比主核小，故叫 微核。
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微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中 难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数 PCE细胞中的微核，因为在此阶段，主核排出，易 于观察微核，这些细胞保持其嗜碱性约24小时， 然后成为正染红细胞（NCE）,并进入外周血。
注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中
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操作步骤：
一 染毒：
染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 0、24小时各染毒一次，6h后取样
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原理：
1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞 质中
2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向 移动，从而遗留在细胞质中
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结论：
微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生 的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗 传学终点
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小鼠骨髓细胞微核试验
受试物: 环磷酰胺 受试动物: 小鼠
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实验目的
学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验的原理和方法苍柏课资源自2细胞分裂分为四个期：
1、G1期（DNA合成前期）：细胞生长，为DNA复制做 准备。
2、S期（DNA合成期）：体细胞的DNA含量由2C增加 到4C
3、G2期(DNA合成后期)：该期主要为M期作准备，包 括复制因子的失活和有丝分裂促进因子的分化,有 关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成
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结果与分析：
1 结果：试验只计数PCE中的微核，微核率 以千分率表示。每组的雌雄动物分开计数 微核PCE均值。
2 分析：正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2）， 如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果 不可靠。
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图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （× 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （× 400）
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流程图
处死小鼠，取胸骨 推片 固定（甲醇固定15分钟） 染色（吉姆萨染色15分钟）
观察并记数
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染毒剂量：50mg/kg
二 处死：
颈椎脱臼法处死小鼠
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三：骨髓液的制备和涂片
1 处理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去 每节骨骺，用弯止血钳将骨髓挤于预先滴有小牛 血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片
2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇 固定15分钟，取出晾干
3 染色：用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储 备液一份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10－ 15分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干
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微核 嗜多染细胞
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注意事项：
1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块 胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断
2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时 要涂匀，以便推片
4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细 胞分散度是否良好
5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
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四 观察和计数：
１ 观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，
再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染红 细胞（NCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形， 边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以 出现一个或多个微核。
２ 计数：1000个PCE中含微核的PCE数，并计算 200个细胞中PCE/NCE的比值