化学修饰的凋亡细胞诱导小鼠异体皮肤移植耐受的研究

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《医学免疫学》人卫第9版教材--高清彩色_201-232

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3.肿瘤的免疫检查点治疗解除肿瘤患者的免疫抑制状态以治疗肿瘤是肿瘤免疫治疗理论和 应用方面的最大突破,最突出的进展是免疫检查点疗法。免疫检查点分子是一类免疫抑制性分子如CTLA-4和PD.1,可调节免疫反应的强度和广度,从而避免正常组织的损伤和破坏,在肿瘤的发生、发 展过程中成为诱导肿瘤免疫耐受的主要原因之一。免疫检查点疗法是通过靶向共抑制或共刺激信号 等一系列途径以调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。针对CTLA-4和PD-1或其配体PD-L1研制的系列抗体在临床治疗肿瘤中取得良好效果,被认为是肿瘤免疫治疗的里程碑事件。
(二)免疫效应分子的抗肿瘤作用
免疫细胞产生的免疫分子以及一些酶类分子等也参与了机体的抗肿瘤作用。
1. 抗体在抗肿瘤免疫中的作用 肿瘤细胞因表达肿瘤抗原而能激活B细胞分泌具有抗肿瘤作 用的抗体。这些抗体可通过如下机制发挥抗肿瘤作用(图22-5):①激活补体系统溶解肿瘤细胞; ②IgG可介导巨噬细胞、NK细胞发挥ADCC效应;③抗体的调理吞噬作用;④抗体封闭肿瘤细胞上的 某些受体,如封闭肿瘤细胞表面转铁蛋白受体,抑制肿瘤细胞生长。
三、对病原体所致肿瘤的预防
已知多种病原体感染与高发的肿瘤有关,如HBV或HCV感染与原发性肝癌、HPV感染与宫颈 癌、EBV感染与鼻咽癌、HTLV.1感染与成人T细胞白血病等。制备相关的病原体疫苗或探索新的干 预方式将可能降低这些肿瘤的发生。成功的范例是HPV疫苗应用于宫颈癌的预防。20世纪80年代 初期,我国在肝癌高发地江苏省启东市开展的HBV疫苗的免疫接种在降低了乙型肝炎的发生率的同 时,也大大降低了肝癌的发生率。
第四节肿瘤免疫诊断和免疫防治
―、肿瘤的免疫诊断
通过生化和免疫学技术检测肿瘤抗原、抗肿瘤抗体或其他肿瘤标记物,有助于辅助对肿瘤患者的 诊断及肿瘤状态的评估。检测肿瘤抗原是最常用的肿瘤免疫诊断方法,例如,AFP水平的升高对原发 性肝细胞肝癌有诊断价值,CEA的升高有助于诊断结直肠癌,CA199的检出有助于胰腺癌的诊断,PSA的升高有助于前列腺癌的诊断。除了血清或其他体液内肿瘤标志物外,釆用特异性单抗免疫组 化或流式细胞术等对细胞表面肿瘤标志物的检测愈来愈受到重视,例如对淋巴瘤和白血病细胞表面CD分子的检测,有助于淋巴瘤和白血病的诊断和组织分型,为其治疗提供有价值的线索。此外,将放 射性核素如⑶I与特异性抗肿瘤单抗结合后,从静脉或腔内注入体内可清晰显示和追踪肿瘤的形态和 转移,已应用于肿瘤诊断。对肿瘤抗原、抗肿瘤抗体或其他肿瘤标记物水平的动态检测和评估还有助 于对肿瘤患者预后的判断。

组织工程在皮肤再生中的研究进展

组织工程在皮肤再生中的研究进展

组织工程在皮肤再生中的研究进展皮肤是人体最大的器官,它不仅起到保护身体内部组织和器官的作用,还参与调节体温、感知外界环境等重要生理过程。

然而,由于烧伤、创伤、慢性疾病等原因,皮肤受损的情况屡见不鲜。

传统的治疗方法如自体皮肤移植、异体皮肤移植等存在着供体不足、免疫排斥等问题。

组织工程的出现为皮肤再生带来了新的希望,其在皮肤再生领域的研究取得了显著的进展。

组织工程是一门融合了生物学、工程学和医学的交叉学科,旨在通过构建生物活性替代物来修复、维持或改善受损组织或器官的功能。

在皮肤再生方面,组织工程主要涉及种子细胞、支架材料以及细胞与支架材料的相互作用等关键要素。

种子细胞是皮肤组织工程的基础。

成纤维细胞是皮肤真皮层的主要细胞类型,能够合成胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质成分,对于维持皮肤的结构和功能起着重要作用。

角质形成细胞则是表皮层的主要细胞,负责形成皮肤的屏障功能。

此外,干细胞如间充质干细胞、表皮干细胞等也因其具有自我更新和多向分化的潜能而成为研究的热点。

这些干细胞可以分化为成纤维细胞、角质形成细胞等皮肤细胞类型,为皮肤再生提供了丰富的细胞来源。

支架材料为种子细胞的生长和分化提供了三维空间和适宜的微环境。

天然材料如胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖等具有良好的生物相容性和生物可降解性,但力学性能相对较差。

合成材料如聚乳酸、聚乙醇酸等具有较好的力学性能和可调控性,但生物相容性有待提高。

为了克服单一材料的局限性,研究人员开发了多种复合材料,如胶原蛋白/聚乳酸复合支架、透明质酸/壳聚糖复合支架等,以更好地满足皮肤再生的需求。

细胞与支架材料的相互作用对于皮肤再生至关重要。

支架材料的表面形貌、孔隙率、孔径大小等物理特性以及化学组成都会影响细胞的黏附、增殖和分化。

例如,具有适当粗糙度和孔隙结构的支架材料有利于细胞的黏附和迁移,而表面修饰特定的生物活性分子如生长因子、多肽等可以促进细胞的功能表达。

此外,细胞在支架材料上的接种密度、接种方式以及培养条件等也会对皮肤再生的效果产生影响。

获得诺奖的免疫学家

获得诺奖的免疫学家

1901年以来获得诺贝尔生理学或医学奖的免疫学家1. von Behring(Emil Adorf von Behring, 1854-1917, Germany)是第一届诺贝尔奖得主,因在血清免疫疗法,特别是将抗血清疗法用于抗白喉治疗中所取得的成就而获得1901年诺贝尔诺贝尔生理学医学奖。

von Behring曾在柏林Koch研究所师从Robert Koch。

在1883年Lfler分离出白喉杆菌及1888年Roux和Yersin鉴定白喉外毒素后,vonBehring 和他的同事Kitadato及Wermicke于1890 年至1892年间指出白喉和破伤风病人是经血液循环中的抗毒素而形成免疫力的,并指出主动给病人注射抗毒素血清具有治疗作用,从而开辟了免疫血清疗法新途径也为体液免疫理论的提出奠定了基础。

2. Koch (Robert Koch, 1843-1910, Germany)1905 年因“在结核方面的研究和发现”获得诺贝尔生理学医学奖。

Koch 早年因在炭疽杆菌的生活史和炭疽病因学上的研究而震动医疗界。

在柏林Koch创建了著名的Koch研究所,他和他的一些杰出的学生建立了严格的细菌分离和培养技术,并在病因学证据方面提出了著名的Koch假说,从而使细菌学成为一门真正的学科。

Koch一生中研究过几种疾病,而他对结核杆菌和结核菌素的鉴定以及对结核病的不懈研究尤为突出,结核菌素反应的诊断性实验及已致敏动物对过量皮下注射结核杆菌的皮肤反应被称为Koch现象,它为以后阐明细胞免疫机制发挥了重要作用。

3. Mechnikov ( Iya lyich Mechnikov, 1845-1916, Russa)1908年因“对免疫力认识方面所做出的杰出贡献”与Paul Ehrlich 分享该年度诺贝尔生理学医学奖。

Mechnikov 对免疫学的主要贡献是提出并证明了细胞(巨噬细胞)免疫理论。

早年他主要从事动物学的比较胚胎学方面的研究工作,在意大利的一家海洋生物实验室工作期间,Mechnikov观察到了海盘车幼虫巨噬细胞,为他的细胞(巨噬细胞)免疫理论奠定了基础。

2009年度南京师范大学国家自然科学基金资助项目清单

2009年度南京师范大学国家自然科学基金资助项目清单

2009年度南京师范大学国家自然科学基金资助项目清单学院姓名申请项目名称资助类别金额(万元)数科院(6项)纪春岗L-函数,二次域以及其它数论问题面上项目27魏加群有限维猜测及其相关问题与理论研究面上项目24陈二才动力系统中的拓扑压与维数理论面上项目26曹海涛二维光正交码及相关设计的研究面上项目25王丽大型稀疏非对称线性方程组的预处理及高效算法研究面上项目26赫海龙辛几何中的开“格罗莫夫-威腾”不变量青年基金16物科院(4项)童培庆准周期与非周期系统的若干动力学和相关问题的研究面上项目34马青玉基于声偶极振动矢量的磁感应磁声衍射层析成像技术研究面上项目36肖振军B介子物理高阶QCD修正计算和唯象研究面上项目36张宁异型(复合)铁磁∕铁电复合材料中的电致变磁导效应与微振发电面上项目42化科院(7项)黄晓华稀土作用于辣根细胞膜的若干生物无机化学行为研究面上项目35孙培培高活性纳米金属的制备及其催化有机反应的研究面上项目35魏少华酞菁/二氧化硅靶向给药体系的构建及其光动力活性研究面上项目35杨维本不同结构吸附树脂对典型抗生素类有机物的吸附行为与机理面上项目36韩敏金属纳米晶的可控合成、组装及多功能异质纳米结构的构筑青年基金18李卉卉环境中有机污染物分子与人类肿瘤相关DNA作用机制的研究青年基金19张卉纳米界面上蛋白质构象及其电化学性能青年基金20生科院(11项)陈双林黏菌代表种的DNA标识区段及遗传多样性的研究面上项目25戴亦军不同共代谢基质控制嗜麦芽寡养单胞菌的吡虫啉代谢途径的机理研究面上项目35邵蔚蓝一株嗜冷菌及镶嵌其细胞壁的大型颗粒的研究面上项目35蒋国芳黄脊雷篦蝗的种群遗传结构和系统地理格局研究面上项目31马飞脊椎动物miRNA基因的起源与进化分析面上项目32杨州微囊藻表型转化的野外原位研究面上项目32戴传超广谱植物内生菌优化花生连作土壤微生物区系的研究面上项目30陈龙镉激活神经细胞mTOR通路诱导凋亡及雷帕霉素靶向调控抗凋亡分子机理面上项目31陈华群内皮细胞肌球蛋白轻链激酶调节小鼠肾脏发育及其机制面上项目31裴建军嗜热厌氧乙醇杆菌中还原力感应蛋白介导乙醇代谢调控的分子机理青年基金20陈玉清抗菌肽CM4对癌细胞与正常细胞的选择性与机理青年基金20地科院(17项)汤国安基于DEM的黄土高原地貌形态空间格局研究重点项目150汪涛基于知识网络视角的高科技园区产业空间集聚研究——以苏南为例面上项目30黄震方基于文化视角的区域旅游发展机制与模式研究——以长江三角洲地区为例面上项目30方斌我国东部地区耕地利用的综合优化模式研究——以浙江省浦江县为例面上项目30李云梅面向湖泊水色遥感的多源数据融合与生成研究面上项目35刘学军融合地形结构的DEM质量分析研究面上项目35张雪英面向GIS的文本空间关系解析机制研究面上项目35赵媛中国石油资源流动空间格局演化规律与形成机制研究面上项目36吴江滢辽宁暖和洞年纹层状石笋全新世东亚季风气候记录与驱动机制研究面上项目49张茂恒中更新世以来大九湖盆地泥炭沉积的气候地层学研究面上项目50刘金娥互花米草对苏北盐沼沉积物有机碳库功能格局影响机理面上项目49齐相贞不同繁殖方式的外来入侵植物的扩散机制研究青年基金18周年兴旅游地景观格局演变机制及优化研究:以武陵源为例青年基金18刘会玉植物入侵对不同尺度栖息地时空变异的响应及其预测青年基金20杨昕基于DEM的黄土高原流域边界剖面谱研究青年基金18吴明光基于庞加莱对偶的三维自由拓扑模型青年基金18张卡基于非下采样Contourlet变换的多源影像自动匹配方法研究青年基金18电自院(1项)田恩刚网络控制系统的随机建模、分析与综合面上项目19动院(2项)杨宏旻烟气中单质汞的等离子放电协同光催化氧化特性研究面上项目30王延华生态土壤污水处理系统温室气体的量化和产生机制研究—太湖流域为例面上项目20请项目主持人按照国家自然科学基金项目及经费管理办法,填报项目计划书。

《细胞生物学》学习指南

《细胞生物学》学习指南

第一章细胞概述细胞生物学的发展经历了从细胞的发现、细胞学说的建立,以及对细胞分裂和细胞器做基本描述的经典时期;直到1953年DNA双螺旋分子结构的确立,伴随着研究手段的进展,细胞生物学才得以确立并得到突飞猛进的发展.近代分子生物学的迅速发展极大地促进了细胞生物学的进步,而分子生物学的研究离不开细胞这个平台。

在这两门生命科学前沿学科的相互促进协调发展中逐渐实现了细胞科学从细胞生物学到细胞分子生物学的转变。

无论是根据细胞的进化,细胞的功能和形态,都可以将细胞人为的分成三大系统:细胞的膜系统,细胞的核系统和细胞的骨架系统。

第二章细胞生物学技术细胞生物学是研究细胞结构与功能的学科,细胞生物学研究方法的建立与完善,促进了细胞生物学的发展.本章重点介绍了细胞生物学领域中最常用的技术方法与基本原理,并简要介绍了该技术的基本延伸。

细胞形态结构的观察依赖于显微镜技术。

复式光学显微镜是光镜下观察细胞结构的基础,适用于观察活体或固定染色的样品.荧光显微镜技术与免疫学技术相结合,实现了生物大分子在细胞内的定位与分布的观察。

相差显微镜和微分干涉显微镜技术,适用于观察活体细胞的结构,结合荧光标记技术可以对细胞活体示踪与观察。

激光共聚焦显微镜利用共焦光路和激光扫描技术,可排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率.但光学显微镜具有局限性,它不能分辨﹤0。

2 μm的物体,而利用电子束对样品成像而制成的电子显微镜,已成为研究机体微细结构的重要手段.根据观察样品的需要,可对观察样品采用特殊的制样方法,如超薄切片技术适于观察细胞内部精细结构,而扫描电镜则用来观察细胞表面形貌特征。

细胞组分的分析可以采用细胞化学、免疫荧光、免疫电镜、原位杂交等方法。

超速离心技术与生化提纯可用于细胞组分的分离与纯化.同位素标记技术与放射自显影技术结合,可应用于研究生物大分子在细胞内的动态变化。

细胞培养技术是细胞工程的基础,细胞融合、杂交瘤制备及组织工程都建立在良好的细胞培养技术基础之上。

藁本内酯通过抑制铁自噬延缓小鼠听皮层组织衰老

藁本内酯通过抑制铁自噬延缓小鼠听皮层组织衰老

网络出版时间:2024-03-0918:27:07 网络出版地址:https://link.cnki.net/urlid/34.1086.R.20240306.1725.020藁本内酯通过抑制铁自噬延缓小鼠听皮层组织衰老周颖东1,张梦娴1,王青玲1,康浩然2,张治成2,王庆林3,刘亚敏4,郭向东2(1.河南中医药大学第一临床医学院,河南郑州 450046;2.河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科,河南郑州 450000;3.河南医学高等专科学校,河南郑州 451191;4.河南中医药大学药学院,河南郑州 450046)收稿日期:2023-10-15,修回日期:2024-01-22基金项目:国家自然科学基金资助项目(No81403439);河南省科技攻关计划(No222102310604,232102310430);河南省中医药科学研究专项重点课题(No20-21ZY1045);河南省高等学校重点科研项目(No23A360028)作者简介:周颖东(1998-),硕士生,研究方向:内耳疾病,E mail:zyd786794242@163.com;郭向东(1980-),硕士,副主任医师,硕士生导师,研究方向:内耳疾病,通信作者,E mail:guoxiangdong0618@126.comdoi:10.12360/CPB202309043文献标识码:A文章编号:1001-1978(2024)03-0455-07中国图书分类号:R 332;R284 1;R322 81;R339 38;R591 1;R764 436摘要:目的 探究藁本内酯(ligustilide,LIG)延缓听皮层组织衰老,治疗中枢性老年性聋的机制。

方法 将40只13月龄C57BL/6J小鼠随机分为LIG低剂量组(L LIG)、LIG中剂量组(M LIG)、LIG高剂量组(H LIG)和衰老组(Age),同品系2月龄小鼠10只作为对照组(Ctrl)。

cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定

基金项目:国家自然科学基金项目(81871697)作者简介:张莉(1991-)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究重症机制及防治研究ꎮ通信作者:雷迎峰ꎬ副教授ꎬE ̄mail:yflei@fmmu.edu.cnꎻ侯立朝ꎬ博士生导师ꎬ教授ꎬE ̄mail:45278436@qq.com 论㊀著cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定张莉1ꎬ刘永飞2ꎬ叶传涛3ꎬ边培育3ꎬ雷迎峰4ꎬ侯立朝11.空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科ꎬ陕西西安7100322.空军军医大学唐都医院麻醉科ꎬ陕西西安7100383.空军军医大学唐都医院传染科ꎬ陕西西安7100384.空军军医大学微生物学教研室ꎬ陕西西安710032摘要:目的㊀构建小鼠CXC型趋化因子受体2(CXCR2)基因cxcr2过表达的骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmes ̄enchymalstemcellꎬBMSC)并进行鉴定ꎮ方法㊀全骨髓贴壁法分离培养小鼠BMSCꎬ采用流式细胞术检测干细胞抗原1(stemcellantigen ̄1ꎬSCA ̄1)㊁CD44㊁CD43㊁CD45㊁IA/IE表达率ꎬ并诱导成骨分化ꎮ以含有小鼠cxcr2的质粒为模版进行PCR扩增ꎬ将获得的cxcr2克隆到慢病毒载体ꎬ命名为pLenti ̄cxcr2 ̄GZꎻ将其与慢病毒包装质粒共转染HEK ̄293T细胞ꎬ收获慢病毒后ꎬ通过离心法感染BMSCꎬ经过1μg/mLzeocin压力选择建立了稳定表达CXCR2的小鼠BMSC(CXCR2 ̄BMSC)ꎮ采用流式细胞术和RT ̄PCR分别检测其CXCR2蛋白和mRNA表达水平ꎬTranswell趋化实验检测其迁移能力ꎮ结果㊀90%以上的第3代BMSC表达CD44㊁SCA ̄1ꎬ几乎不表达IA/IE㊁CD34㊁CD45ꎬ且成功诱导成骨分化ꎮ菌液PCR㊁质粒双酶切后ꎬ琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异㊁大小正确的条带及测序鉴定正确ꎬ表明成功构建了pLenti ̄cxcr2 ̄GZ表达质粒ꎮ流式细胞术和RT ̄PCR结果显示ꎬCXCR2 ̄BMSC的CXCR2蛋白和mRNA表达水平均明显高于对照组BMSCꎬ差异有统计学意义(P<0.001)ꎮTranswell结果显示ꎬCXCR2 ̄BMSC迁移能力高于对照组BMSCꎬ差异有统计学意义(P<0.01)ꎮ结论㊀利用慢病毒系统成功构建了稳定表达CXCR2的BM ̄SCꎬcxcr2基因修饰BMSC后可明显增加BMSC的迁移能力ꎮ关键字:CXC型趋化因子受体2ꎻ小鼠ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ细胞迁移中图分类号:R78文献标志码:A文章编号:1005 ̄5673(2019)01 ̄0019 ̄07DOI:10.13309/j.cnki.pmi.2019.01.004Constructionandidentificationofcxcr2geneinmodificationmousebonemarrowmesenchymalstemcellsZHANGLi∗ꎬLIUYong ̄feiꎬYEChuan ̄taoꎬBianPei ̄yuꎬLEIYing ̄fengꎬHOULi ̄chao∗DepartmentofAnesthesiologyꎬXijingHospitalꎬAirForceMilitaryMedicalUniversityꎬXi'an710032ꎬShaanxiProvinceꎬChinaCorrespondingauthor:LEIYing ̄fengꎬE ̄mail:yflei@fmmu.edu.cnꎻHOULi ̄chaoꎬE ̄mail:45278436@qq.comAbstract:Objective㊀Toconstructandidentifythebonemarrowmesenchymalstemcells(BMSC)withoverexpressionofmousechemokinereceptorcxcr2gene.Methods㊀BMSCwereisolatedandculturedbywholebonemarrowadherentmeth ̄odꎬandtheexpressionratesofstemcellantigen1(SCA ̄1)ꎬCD44ꎬCD43ꎬCD45ꎬIA/IEweredetectedbyflowcytome ̄tryꎬandtheosteogenicdifferentiationwasinduced.Thecxcr2cDNAwasamplifiedꎬandtherecombinantlentiviralvectoroftheoverexpressedmousecxcr2genewasconstructedꎬandnamedaspLenti ̄cxcr2 ̄GZ.HEK ̄293Tcellswereco ̄transfectedwithlentiviralpackagingplasmidsandpLenti ̄cxcr2 ̄GZ.TheCXCR2 ̄BMSCwereobtainedthroughcentrifugalinfectionofBMSCwithpLenti ̄cxcr2 ̄GZvirus.CXCR2proteinandmRNAexpressionweredetectedbyflowcytometryandRT ̄PCR.Themi ̄grationabilityofCXCR2 ̄BMSCwastestedbyTranswellexperi ̄ment.Results㊀CD44andSCA ̄1wereexpressedbyover90%ofthethirdgenerationBMSCcellsꎬbutIA/IEꎬCD34andCD45hardlyexpressedꎬandosteogenicdifferentiationwassuccessfullyinduced.AfterPCRanddoubleenzymedigestionidentificationꎬtheagarosegelelectrophoresisshowedthatthebandswerespecificandcorrect.ThesequencingwasidenticalꎬindicatingthatthepLenti ̄cxcr2 ̄GZplasmidwassuccessfullyconstruc ̄ted.FlowcytometryandRT ̄PCRanalysisshowedthattheexpressionlevelsofCXCR2proteinandmRNAweresignificantlyhigherthanthatofnormalcontrolBMSC.ThetranswellexperimentshowedthatthemigrationcapacityofCXCR2 ̄BMSCwasapparentlyhigherthanthatofnormalcontrolBMSC(P<0.001).Conclusion㊀TheBMSCsstablyexpressingCXCR2weresuccessfullyconstructedbyusinglentiviralsystem.Theoverexpressionofcxcr2cansignificantlyincreasethemigrationabili ̄tyofBMSC.Keywords:CXCchemokinereceptor2(CXCR2)ꎻMouseꎻBonemarrowmesenchymalstemcells(BMSC)ꎻCellmigra ̄tion㊀㊀间充质干细胞(mesenchymalstemcellꎬMSC)是一类具有自我增殖㊁多向分化潜能的成体干细胞[1]ꎮMSC具有很强的免疫调节功能ꎬ在免疫和炎症性疾病的治疗中具有良好的潜力[2-4]ꎮ鉴于MSC移植后归巢靶组织的数量有限㊁产生的治疗性和抗炎分子效力不够强ꎬ最近多项研究对MSC进行基因修饰ꎬ从而增加了MSC的治疗效能[5-7]ꎮCXC型趋化因子受体2(CXCchemokinereceptor2ꎬCXCR2)属于G蛋白是偶联受体家族ꎬ是趋化因子CXCL1㊁CXCL2㊁CXCL3㊁CXCL5㊁CXCL6㊁CXCL7和CXCL8的配体[8]ꎮ趋化因子在炎症性疾病中广泛表达ꎬ趋化因子与趋化因子受体结合能调节中性粒细胞㊁单核细胞的迁移ꎬ将它们募集到炎症部位发挥相应的作用ꎮ研究通过构建cxcr2基因修饰的BMSCꎬ并观察修饰后BMSC到达炎症部位的迁徙能力ꎬ为后续炎症性疾病的BMSC治疗策略奠定基础ꎮ1㊀材料与方法1.1㊀细胞与质粒㊀HEK ̄293T细胞株㊁Stbl3感受态细胞㊁pCI ̄neo ̄CD40L ̄GZ㊁pLenti ̄CD40L ̄GZ㊁pCMV3 ̄GFPSpark ̄CXCR2载体质粒㊁辅助包装质粒psPAX2和pMD2.G均由空军军医大学微生物实验室保存并提供ꎮ1.2㊀实验动物㊀SPF级4~6周C57BL/6小鼠4只ꎬ16~18gꎬ均购自空军军医大学动物实验中心ꎮ1.3㊀主要试剂及仪器㊀DMEM培养基㊁青霉素㊁链霉素均购自hyclone公司ꎻ胎牛血清购自Sigma公司ꎻ成骨诱导分化培养基试剂盒购自广州赛业公司ꎻPE标记抗小鼠CD44㊁SCA ̄1㊁IA/E㊁CD34㊁CD45抗体均购自BD公司ꎻPE标记CXCR2抗体购自Bio ̄legend公司ꎻ质粒大量提取DNA试剂盒购自Omega公司ꎻ先锋RNA快速提取试剂盒㊁DNA凝胶回收试剂盒㊁质粒小量提取DNA试剂盒均购自Axygen公司ꎻPrimeSTARDNA聚合酶㊁限制性内切酶NheI㊁MluI㊁BamHI和SalI㊁T4DNA连接酶㊁逆转录试剂盒㊁TakaraSYBRgreen试剂盒均购自Takara公司ꎻ转染试剂MAX由本室配制ꎻmCXCL2蛋白购自亿翘神州公司ꎮCO2培养箱㊁T25细胞培养瓶均购自Thermoscientific公司ꎻIX71倒置荧光显微镜购自Olympus公司ꎻ流式细胞仪购自于美国BD公司ꎻ4ħ离心机购自德国Eppendorf公司ꎻ超速离心机购自Beckman公司ꎻLightcycler480PCR仪购自罗氏公司ꎮ1.4㊀BMSC的分离、鉴定㊀采用全骨髓贴壁法培养小鼠BMSC[9]ꎮ将小鼠颈椎脱臼法处死ꎬ置于75%乙醇中浸泡消毒5minꎻ于超净台中剪开皮肤ꎬ剥开肌肉ꎬ分离小鼠双侧股骨ꎬ剪去两端软骨ꎻ用1mL注射器吸取含10%血清㊁1%双抗的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔ꎬ直至骨髓腔发白ꎻ收集细胞悬液于T25培养瓶中ꎮ将其放入37ħ5%CO2培养箱中培养ꎬ首次48h后换液ꎬ以后视细胞状态而定ꎬ约2d换液1次ꎮ传至第3代ꎬ常规消化细胞ꎻ按流式抗体说明书通过流式细胞术检测干细胞表面标志分子CD45㊁CD34㊁CD44㊁SCA ̄1㊁IA/IEꎬ并按诱导分化培养基试剂盒说明书诱导BMSC成骨分化ꎬ茜素红染色鉴定ꎮ1.5㊀cxcr2过表达的慢病毒载体构建及慢病毒包装1.5.1㊀cxcr2基因片段的制备㊀根据Genbank中的cxcr2设计引物ꎬ以质粒(pCMV3 ̄GFPSpark ̄CXCR2)为模板进行PCR扩增ꎮ引物序列如下:F:GACGTCGCTAGCGGATCCGGCTTCCACCATGGGAGAATTCAAGGTGGA(含NheI和BamHI酶切位点)ꎻR:GACGTCACGCGTGAGGGTAGTAGAGGTGTTTG(含MluI酶切位点)ꎮ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮPCR反应体系为模板DNA2μLꎬ上㊁下游引物各1.5μLꎬ5ˑPrimeSTARBuffer10μLꎬdNTPMixture4μLꎬPrimeSTARDNA聚合酶0.5μLꎬ加超纯水至50μLꎮPCR反应条件为:98ħ变性10sꎬ55ħ退火5sꎬ72ħ延伸75sꎬ30个循环ꎮPCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后ꎬ按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收DNA片段ꎮ1.5.2㊀重组质粒pLenti ̄cxcr2 ̄GZ的构建及鉴定㊀用NheI和MluI分别对cxcr2PCR产物和pCI ̄neo ̄CD40L ̄GZ进行双酶切ꎬ并分别进行胶回收cxcr2基因片段和pCI ̄neo ̄GZꎬ用T4DNA连接酶连接后ꎬ用Stbl3感受态细菌转化ꎬ涂布含有氨苄抗性的琼脂培养基ꎬ过夜培养后挑出单克隆并接种ꎬ37ħ培养12~16h后ꎬPCR鉴定得到阳性克隆保存甘油菌ꎬ并收集菌体沉淀ꎬ按质粒小量提取DNA试剂盒说明书提取质粒ꎬ命名为pCI ̄neo ̄cxcr2 ̄GZꎮ之后ꎬ将其与pLenti ̄CD40L ̄GZ用BamHI和SalI酶切ꎬ分别获得目的片段cxcr2 ̄GZ和pLenti载体ꎬ连接后将连接产物转化Stbl3感受态细菌ꎬ操作同前法ꎬ菌液PCR鉴定单克隆菌落ꎬ鉴定正确菌落委托擎科泽西生物技术公司进行双向测序ꎬ测序结果于NCBI ̄BLAST网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对ꎬ序列正确菌落命名为pLenti ̄cxcr2 ̄GZꎮ1.5.3㊀pLenti ̄cxcr2 ̄GZ慢病毒的包装㊀将重组质粒pLenti ̄cxcr2 ̄GZ12μg与psPAX29μg㊁pMD2.G6μg混合后ꎬ加入转染试剂(MAX溶液)81μLꎬ轻柔混匀ꎬ待其形成DNA ̄脂质体复合物后ꎬ转染HEK ̄293T细胞ꎮ将细胞放置于37ħ5%CO2培养箱孵育48hꎬ收集上清后加入DMEM培养液ꎬ72h后再次收集上清液ꎬ使用0.45μm滤器过滤细胞碎片ꎬ收集病毒上清液ꎬ20%蔗糖作为垫子ꎬ以100000ˑg离心4hꎬ超速离心法沉淀浓缩和纯化慢病毒ꎬ收集并分装pLenti ̄cxcr2 ̄GZ病毒液ꎬ于-80ħ保存ꎮ1.6㊀pLenti ̄cxcr2 ̄GZ稳定转染BMSC的构建及筛选㊀将第3代的小鼠BMSC铺于6孔板中ꎬ培养至细胞汇合度达到60%~70%时ꎬ每孔加入2mLpLenti ̄cxcr2 ̄GZ病毒液和DMEM培养基的混合液(按1ʒ1比例)37ħꎬ1000ˑg离心感染2hꎬ弃去病毒液ꎬ加入含有10%FBS的DMEM培养基于37ħ5%CO2培养箱中继续培养ꎬ48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentproteinꎬGFP)的表达ꎮ然后加入含有1μg/mLzeocin的培养液2mL进行筛选ꎬ每3~4d更换该培养液ꎬ直至不表达绿色荧光的细胞全部死亡ꎮ经过14~21d的筛选后ꎬ获得了稳定表达CX ̄CR2的小鼠BMSC(CXCR2 ̄BMSC)ꎬ同时设置未处理的BMSC作为对照组ꎮ1.7㊀稳定转染细胞系鉴定1.7.1㊀流式细胞术检测CXCR2蛋白表达㊀常规消化CXCR2 ̄BMSCꎬ加入预冷的缓冲液(PBS加入1%胎牛血清)洗涤2次后ꎬ调整细胞浓度为1ˑ105个/孔后加入1μLPE标记CXCR2抗体ꎬ避光冰浴30minꎻ洗涤2次后ꎬ用200μLPBS重悬ꎬ用流式细胞仪检测CXCR2蛋白的表达ꎮ1.7.2㊀Real ̄timePCR检测cxcr2mRNA的表达㊀按照先锋RNA快速提取试剂盒说明书分别提取未感染正常BMSC和CXCR2 ̄BMSC的总RNAꎬ并用微黑子核酸测定仪定量ꎮ取500ng总RNA用逆转录试剂盒制备cDNAꎬ然后按照TakaraSYBRgreen试剂盒说明书用Lightcycler480PCR仪进行荧光定量PCRꎮ根据目的基因设计Real ̄timePCR引物ꎬ序列如下:cxcr2:F:ATGCCCTCCTATTCTGCCAGATꎻR:GTGCTCCGGTTGTATAAGATGAC ̄3ꎻβ ̄actin:F:TGACGGGGTCACCCACACTGꎻR:AAGCTGTAGCCGCGCTCGGTꎮ以β ̄actin为内参基因ꎬ检测试验组(CXCR2 ̄BMSC)及对照组(BMSC)细胞中上述目的基因mR ̄NA的相对表达量ꎮPCR引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮ1.8㊀Transwell趋化试验㊀在24孔Transwell的上室中接种CXCR2 ̄BMSC或BMSCꎬ接种密度为1ˑ105个/孔ꎬ下室加入600μL趋化缓冲液或正常缓冲液ꎮ实验分为4组:①小室上室加入培养的CXCR2 ̄BM ̄SCꎬ下室加入含100ng/mLmCXCL2正常培养液ꎬ命名为CXCR2 ̄BMSC ̄mCXCL2组ꎻ②小室上室加入培养的CXCR2 ̄BMSCꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为CXCR2 ̄BMSC ̄正常组ꎻ③小室上室加入培养的BM ̄SCꎬ下室加入含100ng/mLmCXCL2正常培养液ꎬ命名为BMSC ̄mCXCL2组ꎻ④小室上室加入培养的BMSCꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为BMSC ̄正常组ꎮ每组均放置于37ħ㊁5%CO2培养箱孵育12h后用棉签擦去上室内细胞ꎬ用4%多聚甲醛固定15minꎬ倒置风干后用0.1%的结晶紫染色20minꎬ在显微镜下对上室底部反面的细胞进行计数ꎬ每组设3个复孔ꎬ每孔随机计数5个视野(200ˑ)下迁移至膜背面的细胞数ꎮ1.9㊀统计学方法㊀应用GraphpadPrism5和SPSS17软件进行统计分析ꎮ基因mRNA的相对表达量采用t检验进行比较ꎻ各组迁移的细胞数采用单因素方差分析进行比较ꎬ两两比较采用SNK检验ꎬP<0.05为差异有统计学意义ꎮ2㊀结㊀果2.1㊀BMSC分离及鉴定2.1.1㊀小鼠BMSC形态㊀在显微镜下可以看到ꎬ刚分离的骨髓细胞大多悬浮并呈圆形ꎬ24h后见大量贴壁细胞ꎬ72h后贴壁细胞大多呈纺锤型㊁梭形和圆形ꎬ大约12d细胞长满ꎮ随着培养时间和传代次数的增加ꎬ细胞形态逐渐形似呈梭形ꎬ见图1ꎮ㊀注:A.培养3d的细胞形态ꎻB.培养12d的细胞形态ꎮ图1㊀小鼠BMSC形态(200ˑ)Fig.1㊀Morphologyofmousebonemarrowmesenchymalstemcells(200ˑ)2.1.2㊀BMSC表面标志分子流式鉴定㊀流式结果显示ꎬ超过90%的细胞表达CD44㊁SCA ̄1ꎬ但几乎不表达IA/IE㊁CD34㊁CD45ꎬBMSC表面标志分子鉴定ꎬ见图2ꎮ㊀注:A.CD44ꎻB.SCA ̄1ꎻC.CD45ꎻD.CD34ꎻE.IA/IEꎮ图2㊀BMSC表面标志分子鉴定Fig.2㊀Identificationofsurfacemarkerformousebonemarrowmesenchymalstemcells2.1.3㊀诱导BMSC成骨分化㊀成骨诱导21d后ꎬ细胞呈结节状ꎬ茜素红染色呈红色ꎬ见图3ꎮ表明成骨分化诱导成功ꎮ提示分离获得的小鼠BMSC符合国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞标准ꎮ图3㊀BMSC成骨诱导分化(200ˑ)Fig.3㊀Inductionofosteogenicdifferentiationformousebonemarrowmesenchymalstemcells(200ˑ)2.2㊀cxcr2慢病毒载体的构建㊀琼脂糖电泳结果显示ꎬ扩增的目的条带单一㊁特异ꎬ之后菌液PCR鉴定㊁酶切鉴定㊁测序分析结果均表明成功构建了慢病毒载体pLenti ̄cxcr2 ̄GZꎬ见图4ꎮ2.3㊀pLenti ̄cxcr2 ̄GZ稳定转染BMSC的构建及筛选㊀将pLenti ̄cxcr2 ̄GZ质粒与慢病毒包装质粒共同转染HEK ̄293T细胞ꎬ获得慢病毒后浓缩感染BM ̄SCꎬBMSC经过Zeocin压力选择3周后ꎬ可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光ꎬ对照组未见绿色荧光ꎬ见图5ꎮ2.4㊀稳定转染细胞系鉴定㊀流式鉴定大约78.5%的细胞表达GFPꎬ75.7%的细胞表达CXCR2ꎮReal ̄timePCR结果显示ꎬ试验组的cxcr2mRNA表达水平明显高于对照组ꎬ差异具有统计学意义(P<0.001)ꎮ提示CXCR2 ̄BMSC构建成功ꎬ见图6ꎮ㊀注:A.cxcr2基因片段的制备ꎻB.pLenti ̄cxcr2 ̄GZ菌液PCR鉴定ꎻC.pLenti ̄cxcr2 ̄GZ质粒双酶切鉴定ꎻD.测序结果在NCBIBLAST比对ꎮ图4㊀cxcr2真核表达载体的构建Fig.4㊀Constructionofcxcr2eukaryoticexpressionvector㊀注:A.过表达CXCR2的BMSC的荧光图片ꎻB.未感染正常对照BMSC的荧光图片ꎮ图5㊀pLenti ̄cxcr2 ̄GZ稳定转染BMSC荧光表达(400ˑ)Fig.5㊀FluorescenceexpressionofBMSCtransfectedbypLenti ̄cxcr2 ̄GZ(400ˑ)㊀注:A.流式细胞仪检测GFP表达ꎻB.流式细胞仪检测CXCR2表达ꎻC.Real ̄timePCR检测过表达CXCR2的小鼠BMSC中cxcr2mRNA表达ꎮ∗∗∗.P<0.001ꎮ图6㊀CXCR2修饰的BMSC的鉴定结果Fig.6㊀IdentificationofCXCR2modifiedBMSC2.5㊀cxcr2基因修饰的BMSC迁移能力增强㊀Tran ̄swell结果显示ꎬCXCR2 ̄BMSC ̄mCXCL2组在含有100ng/mL的mCXCL2的趋化液中穿过小室的数目明显高于BMSC ̄mCXCL2组ꎬTranswell实验检测细胞迁移ꎬ见图7ꎮ表明cxcr2基因修饰BMSC可增强其趋化潜能ꎮ㊀注:A.CXCR2 ̄BMSC ̄mCXCL2组ꎻB.CXCR2 ̄BMSC ̄正常组ꎻC.BMSC ̄mCXCL2组ꎻD.BMSC ̄正常组ꎻE.24h后不同组别穿过膜下的细胞数ꎮ∗∗.P<0.01ꎮ图7㊀Transwell实验检测细胞迁移(200ˑ)Fig.7㊀Detectionofcellmigrationbytranswellassay(200ˑ)3㊀讨㊀论20世纪70年代ꎬFRIEDENSTEIN等[10]首次利用贴壁法从骨髓分离得到BMSCꎮ由于其来源方便ꎬ易于分离培养ꎬ且具有多向分化㊁免疫调节㊁输送治疗剂的能力ꎬ是较好的组织工程细胞和基因载体细胞ꎬ常被用于免疫与炎症性疾病的基础和临床研究[11-12]ꎮ通过静脉或腹腔移植的MSC会沿着趋化梯度向受损组织迁移ꎬ在靶组织中检出率有限(只有不到1%)ꎬ大大降低了其治疗效应ꎮ可能的原因是MSC表面趋化因子受体的表达较低ꎮ研究发现ꎬ趋化因子及其受体在BMSC的归巢中起着重要作用ꎬBMSC表面的趋化因子受体通常支配着血管内循环细胞的黏附和滚动[13-14]ꎮCHEN等[15]研究发现ꎬcxcr4过表达的BMSC在小鼠结肠炎模型中可增强BMSC向受损肠黏膜的归巢ꎬ对治疗结肠炎有较好的疗效ꎮHOEGL等[16]研究发现ꎬ在内毒素所致的肺损伤中趋化因子CXCL1㊁CXCL2高表达ꎬNK细胞通过CXCR2介导参与中性粒细胞向肺部炎症部位的募集ꎮ因此ꎬ对BMSC基因修饰趋化因子受体成为提高归巢能力的新策略[17-18]ꎮ研究通过全骨髓贴壁法分离培养BMSCꎬ使用DMEM培养基进行培养ꎬ经过换液㊁传代去除了杂细胞ꎬ从而获得了纯度较高的BMSCꎮ为了检测其是否符合干细胞标准ꎬ通过流式检测干细胞表面标志SCA ̄1㊁CD44㊁CD43㊁CD45㊁IA/IEꎬ结果显示ꎬ其高表达CD44㊁SCA ̄1ꎬ几乎不表达IA/IE㊁CD34㊁CD45ꎬ通过诱导成骨分化观察到茜素红染色阳性的钙结节沉积ꎮ上述结果表明通过全骨髓贴壁法培养出符合细胞表型㊁具有分化潜能的BMSCꎮ由于小鼠的BMSC具有感染率低的特点ꎬ研究通过慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染至HEK ̄293T细胞获得慢病毒ꎬ经超速离心沉淀法浓缩纯化ꎬ获得cxcr2过表达的慢病毒ꎮ通过离心法进行感染ꎬ利用抗性筛选提高阳性细胞的比例ꎬ从而使得CXCR2能稳定表达ꎮ荧光显微镜可以观察到稳定表达CXCR2的BMSC具有绿色荧光ꎻ流式细胞和RT ̄PCR结果显示ꎬCXCR2蛋白和mRNA表达水平均明显高于正常BMSCꎬ证实成功构建稳定表达CX ̄CR2的BMSCꎮ通过Transwell趋化试验比较了cxcr2修饰的BMSC与普通BMSC的迁移和归巢ꎮ结果表明ꎬcx ̄cr2修饰的BMSC更容易迁移ꎬ提示CXCR2参与了BMSC的迁移与归巢ꎮ综上所述ꎬ研究成功构建了cxcr2修饰的BM ̄SCꎬ为进一步研究其直接移植治疗临床疾病及其作用机制奠定了基础ꎮ参考文献[1]㊀ULLAHIꎬSUBBARAORBꎬRHOGJ.Humanmesenchymalstemcells ̄currenttrendsandfutureprospective[J].BioscienceRepꎬ2015ꎬ35(2):1 ̄18.[2]㊀ROSTAMIMꎬHAIDARIKꎬSHAHBAZIM.Geneticallyengi ̄neeredadiposemsenchymalstemcellsusingHIV ̄basedlentiviralvectorsasgenetherapyforautoimmunediseases[J].CellRepro ̄gramꎬ2018.DOI:10.1089/cell.2018.0006.[3]㊀SHAHKꎬZHAOAGꎬSUMERH.Newapproachestotreatosteo ̄arthritiswithmesenchymalstemcells[J].StemCellsIntꎬ2018ꎬ2018:5373294.[4]㊀LEBLANCKꎬMOUGIAKAKOSD.Multipotentmesenchymalstromalcellsandtheinnateimmunesystem[J].NatRevImmu ̄nolꎬ2012ꎬ12(5):383 ̄396.[5]㊀CHENXꎬZHANGYꎬWANGWꎬetal.Mesenchymalstemcellsmodifiedwithhemeoxygenase ̄1haveenhancedparacrinefunctionandattenuatelipopolysaccharide ̄inducedinflammatoryandoxida ̄tivedamageinpulmonarymicrovascularendothelialcells[J].CellPhysiolBiochemꎬ2018ꎬ49(1):101 ̄122.[6]㊀XUXPꎬHUANGLLꎬHUSLꎬetal.GeneticmodificationofmesenchymalstemcellsoverexpressingangiotensinIItype2recep ̄torincreasescellmigrationtoinjuredlunginLPS ̄inducedacutelunginjurymice[J].StemCellsTranslMedꎬ2018ꎬ7(10):721 ̄730.[7]㊀STEWARTANꎬMATYASJJꎬWELCHKORMꎬetal.SDF ̄1overexpressionbymesenchymalstemcellsenhancesGAP ̄43 ̄posi ̄tiveaxonalgrowthfollowingspinalcordinjury[J].RestorNeurolNeurosciꎬ2017ꎬ35(4):395 ̄411.[8]㊀HERTZERKMꎬDONALDGWꎬHINESOJ.CXCR2:atargetforpancreaticcancertreatment?[J].ExpertOpinTherTargetsꎬ2013ꎬ17(6):667 ̄680.[9]㊀SOLEIMANIMꎬNADRIS.Aprotocolforisolationandcultureofmesenchymalstemcellsfrommousebonemarrow[J].NatProtocꎬ2009ꎬ4(1):102 ̄106.[10]㊀FRIEDENSTEINAJꎬCHAILAKHJANRKꎬLALYKINAKS.Tedevelopmentoffbroblastcoloniesinmonolayerculturesofguinea ̄pigbonemarrowandspleencells[J].CellandTissueKi ̄neticsꎬ1970ꎬ3:395 ̄403.[11]㊀FRENETTEPSꎬPINHOSꎬLUCASDꎬetal.Mesenchymalstemcell:keystoneofthehematopoieticstemcellnicheandastep ̄ping ̄stoneforregenerativemedicine[J].AnnuRevImmunolꎬ2013ꎬ31:285 ̄316.[12]㊀LIXꎬWANGMꎬJINGXꎬetal.Bonemarrowandadiposetissue ̄derivedmesenchymalstemcells:characterizationꎬdifferentia ̄tionꎬandapplicationsincartilagetissueengineering[J].CritRevEukaryotGeneExprꎬ2018ꎬ28(4):285 ̄310.[13]㊀IDORNMꎬTHORSP.Chemokinereceptorsandexercisetotack ̄letheinadequacyofTcellhomingtothetumorsite[J].Cellsꎬ2018ꎬ7(8):E108.[14]㊀ZHANGXꎬHUANGWꎬCHENXꎬetal.CXCR5 ̄overexpressingmesenchymalstromalcellsexhibitenhancedhomingandcande ̄creasecontacthypersensitivity[J].MolTherꎬ2017ꎬ25(6):1434 ̄1447.[15]㊀CHENZꎬCHENQꎬDUHꎬetal.MesenchymalstemcellsandCXCchemokinereceptor4overexpressionimprovedthetherapeu ̄ticeffectoncolitisviamucosarepair[J].ExpTherMedꎬ2018ꎬ16(2):821 ̄829.[16]㊀HOEGLSꎬEHRENTRAUTHꎬBRODSKYKSꎬetal.NKcellsregulateCXCR2+neutrophilrecruitmentduringacutelunginjury[J].JLeukocyteBiolꎬ2017ꎬ101(2):471 ̄480.[17]㊀GOLCHINAꎬREKABGARDANMꎬTAHERIRAꎬetal.Pro ̄motionofcell ̄basedtherapy:specialfocusonthecooperationofmesenchymalstemcelltherapyandgenetherapyforclinicaltrialstudies[J].AdvExpMedBiolꎬ2018.DOI:10.1007/5584_2018_256.[18]㊀KARPJMꎬLENGTG.Mesenchymalstemcellhoming:thedevilisinthedetails[J].CellStemCellꎬ2009ꎬ4(3):206 ̄216.收稿日期:2018 ̄10 ̄16㊀修回日期:2018 ̄12 ̄12编辑:陈凌云。

熊果酸对人早幼粒白血病细胞的增殖抑制、周期阻滞及凋亡诱导作用


3 mo/ 置 于 培 养 箱 中 培 养.每 隔 1 5 lL, 2h取 0 0 台 盼蓝 染 液 与 0 4 . 5mL . 5mL细胞 悬 液充 分 混
印 册
匀 , 活细胞计 数 , 生长 曲线. 对 绘制
( )AO/ B复 染 检 测 HL 6 3 E -0细胞 的 凋 亡 将
的分 子机制 , 以期 为具 有 该类 结 构 的化 合物 细 胞毒
作用 机理提供 科学依 据.
浓度为 5 0 个/ ×1‘ mL的细胞接种 于 6孔板 中 , 培养
1 实 验 部 分
1 1 材 料 及 仪 器 .

2 加药 物 , 于 培 养 箱 中分 别 培养 2 、 8h 4h后 置 4h 4
种类 型 的瘤 株 细 胞 的 生 长 阳, 制 癌 变 的启 动 以 。 抑
及抗 致癌 物诱 发 的基 因突变Ⅲ] 同时 还具 有 诱 导肿 ,
收 稿 日期 :0 1 0 — 7 2 1 — 12 基 金 项 目 : 北 师 范 大 学 知 识 与科 技 创新 工 程项 目( W NU— J X - 36 ) 西 N K C GC 0 — 5 *通 讯联 系人 . - i: iga @ ? I . d . r E ma dn l l n I U e u c WI t
a d a pt ss n po o i.
Ke r s u s l cd; r w t n i iin; e l y l r e t a o t ss y wo d : r oi a i g o h ih bt c o c l c ce a r s ; p p o i
熊果 酸 为 乌 苏 烷 型 五 环 三 萜 类 化 合 物 , 许 多 是

国家级大学生创新创业训练计划

齐昱婷
刘汉兰
20000
项目编号
项目名称
项目类型
项目负责
人姓名
指导教
师姓名
项目经费
(元)
201610504079
Bi/rGO/Bi2WO6三元复合材料的合成及光催化
性能研究
创新训练项目
刘文成
瞿阳
20000
201610504080
多孔金棒的生物模板合成方法研究
创新训练项目
梁晨楠
鲁哲学
20000
201610504081
20000
201610504050
白斑病毒分子蛋白A的分子研究
创新训练项目
李卓聪
兰江风
20000
201610504051
团头鲂颗粒溶素NK-lysin的生物学活性研究
创新训练项目
黄浩
袁改玲
20000
201610504052
光照和温度对蚤状溞生殖转化的诱导作用研究
创新训练项目
刘思甜
刘香江
20000
201610504053
创新训练项目
耿佩赟
பைடு நூலகம்刘睿
15000
201610504076
基于矩阵理论的亏损系统灵敏度模型
创新训练项目
黄文琳
沈婧芳
15000
201610504077
后基因组时代农药一基因相互作用数据库构建
创新训练项目
徐芳婷
位灯国,
郑芳
20000
201610504078
醚基离子液体的制备及其对纤维素溶解性能的
研究
创新训练项目
刘灵芝
20000
201610504090
大学生参与和使用众筹创业意愿及其影响因素 研究

Dectin-1_过表达对树突状细胞成熟的抑制作用及其对小鼠心脏移植物免疫耐受的诱导作用

第 49 卷第 4 期2023年 7 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.49 No.4Jul.2023DOI:10.13481/j.1671‐587X.20230421Dectin-1过表达对树突状细胞成熟的抑制作用及其对小鼠心脏移植物免疫耐受的诱导作用张轶西1, 宋飞玉2, 郭义文3, 曾志贵1(1. 首都医科大学附属北京友谊医院普通外科,北京100050;2. 吉林康乃尔药业有限公司,吉林吉林132013;3. 中山大学附属第一医院器官移植科,广东广州510080)[摘要]目的目的:探讨过表达Dectin-1基因对树突状细胞(DCs)功能的影响,阐明Dectin-1基因抑制DCs成熟活化发挥免疫学功能的机制及对小鼠心脏移植物的免疫保护作用。

方法方法:小鼠骨髓干细胞诱导形成DCs后进行体外培养扩增,采用带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的腺病毒载体将Dectin-1基因转染至DCs,经过Dectin-1基因修饰的未成熟DCs(imDCs)为DC-Dectin-1组,同时设未经病毒转染的DCs组和转染GFP(DC-GFP)组,24 h后采用免疫荧光染色法检测腺病毒转染情况,采用Western blotting法检测各组DCs中Dectin-1蛋白表达情况,采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测脂多糖(LPS)刺激前后各组DCs表型、功能和细胞培养上清液中白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素12(IL-12)水平。

建立同种异体小鼠腹部异位心脏移植模型,分为DCs组、DC-GFP组和DC-Dectin-1组,于移植术后第1、3和5天分别输入DCs、DC-GFP和DC-Dectin-1,移植术后第7天HE染色观察各组小鼠心脏移植物病理形态表现,TUNEL染色观察各组小鼠心脏移植物细胞凋亡情况,观察各组小鼠心脏移植物中位存活时间(MST)。

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( 1 4 )
其中 ,e O d i ,缶分别是第 i 阶无阻尼和有 阻尼模态频率 、 阻尼比; 型 的第 , 个元素。
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㈤ = [ 尸 ] { ) 第i 个单元内 一点的应变为{ ) ,
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将 ̄ A l - . 应变—位移关系式【 加 代入式( 3 ) 得到,
J 2f q . o o( t ) 6 ( t ) d t : = - 厂 ( 0 )
将式( 1 7 ) 代 人式( 1 6 ) ,得 到
1 动 应 变 相 关 函数
1 . 1基 本 原理
相关 函数 可简单 描 述成 随机 振动 波形 随 时问
坐标 移 动 时与 别 的波 形 的相 似程 度 。在 随机 振
动下 ,得 到其 n个 测点 的 响应信 号 ,不 同测点 的
响应 x p ( t ) 与x l ( t ) ( , =1 , 2 , 3 , …, , z ) 之 间 的互 相关 函
( ) 1 8 )
[ 】 { ) ) + [ 】 { ( f ) ) 十 [ ] { 占 ( ) )

t [ f ( ) = I
,— 一

t + r h

( t —o - 1 ) h t ( t +f 一 ) c ( 1 9) )
㈣ )
㈩ =
警P 锕 i = 1 ( O d i (

+ s j n ( f ) ]

l l 为Nx N的 应 变模 态振 型矩 阵, { g ( f ) } 为 应
变模 态 下 Nx 1 的广 义 坐标 向量 ,
] c 0 s (
{ e t f ) ) = I l { g ( f ) }
若 厂( f ) 为 白噪声 ,则 f ( t ) 的 自相 关 函数为 , E( f( G 1 ) f ( 0 " 2 ) ) =S S (  ̄ r l 一0 " 2 ) ( 1 7)
[ } ( 8 ) 此处{ ) 为单元内的应变, { ) 为单元节点 位
移 。将 式( 8 ) 转换 到总 体坐标 中,

∽ = t P l { a } ( 4 ) 式中[ 尸 】 为位移函数矩阵, { 口 } 为多项式函 数的系
数列阵, 其元素为待定常数 。 在有限元的节点上 , 每个节点的位置坐标为确定值 ,有下列关系 ,
[ ] [ H 】 , ’ [ ] [ ] _ 【 】 , [ ] 【 】 [ ] _ [ 】 ,
( 1 1 )
( —c )
式中:
] = [ r f 】 [ 町 ,
[ ] = [ 玎 [ [ 】 = [ 町 【 】 [
将应变 响应 表示 为各应变模态贡 献之和 ,
h p ( t ) h l  ̄ ( t +r ) d t
将式( 1 4 ) 代人上式 ,可得
( 6 )
在 ( f ) 作 用下 , 自由度 , 输 出的应变 响应 表
{ 占 ) : [ D I N = 【 D ] [ 尸 ] 【 】 { ) , = [ ] { } ,
( 7 )
e t ( t ) = Lh t ( t — ) f ( t ) d r
Ⅳ个 自由度 系统 的 随机运 动方 程表 示 为 ,
[ 】 { 墨O ) } + [ c 】 { ) } + [ 】 { ( f ) } = { L ) - 厂 O )
( 3)
式中[ 】 、 [ ] 、 [ 】 分 别为 NxN 的质量 、
阻尼和刚度矩阵 ; { 三} 为 Nx 1 的映射 向量 ,f ( t )
_ [ n }
求得 自由度 , 处应变单位脉冲响应 函数 ,
{ ) = 【 】 ,{ 口 ) = [ { ) ( 5 ) [ 】 f 应为数值矩阵。 将系数列阵{ 口 } 表达式
代人式( 4 ) 得
%: ∑ N
‘ 智
P 一 岳  ̄ t s i n ( f )
1 Ⅳ一 1 ,
( ) = 寺∑ ( f + f ) ( 2 )
i = 0
式 中
At
为ห้องสมุดไป่ตู้采样 时 间 ,
为采样 问隔 ,
Ⅳ= +1 是 时 间序 列 的样本 数 , 为 时 问间隔 。 当 P=, 时, ( ) 即 自相 关 函数 。
量 ( 柔度矩阵 、振型曲率等 ) 在内的频域参数是 最常见的损伤特征参数。在时域通过响应信号直 接构 造损 伤特 征参数 是 另一种思 路 。S o h n 和 F a r r a r [ 6 1 将响应信号的 A R模型系数作为损伤敏感 指标 。R u o t o l o [ 7 ] 等采用奇异值分解得到响应信号 矩阵 的秩 ,通过秩 的变化 进行 损伤识别 。陈 晓 强[ 8 1 等基 于响应信号构造了统计矩 曲率 、动能密
方法 不需 要模 态 分析 确定 损 伤位 置和损 伤程 度 。 目前 ,模 态 频率 、振 型 、阻尼 、频 响 函数及 导 出
数R p ( f ) 定 义 为
) = l i m
。。
Z f
J。

( ( f +z . )
( )
对 于离散 的时间序 列( 响应 ) , 上式 可表 示 成 :
和应变模态振型,可以提供损伤位置所需的空间 信息。D o n g [ 3 1 等指出,相 比位移模态振型 ,应变 模态振型对结构损伤更敏感 。 P a n d e y 提出了模态 柔度【 4 J , 其本质是 固有频率和模态振型的综合量 。 有学者利用频响函数进行损伤识别 ,S a m p a i o等 的研究表明【 5 】 ,基于频响函数的曲率的损伤识别
互相 关 函数 R p l ( r ) 可 表示 为 ,
( 1 5 )
式中m为单元数,[ D 】 为微分算子,

【 J [ ) ] [ P


) = E { J — h p ( t — G 1 ) f ( G 1 ) d o " 1
h a t + r — o 2 ) f ( G 2 ) d o ' 2 } ( 1 6 )
第2 4 卷 第3 期
2 0 1 5 年9 月
湖 南 城 市 学 院 学 报
(自然科 学版 )
、 白 1 . 2 4 No . 3 S e p 。2 0 1 5
J OURNAL OF HUNAN CI TY UNI VERS I TY ( Na t u r a l S c i e n c e)
结构 健 康监 测 系统定 义为 从运 营状 态 的结构 中获
度 和伪 比能 三种 损 伤指标 。本文 考虑 在 时域构 造 应 变损 伤指 标 。推 导结 构在 白噪声 激励下 ,应变
时程 的相关 函数幅值 向量与结构 固有频率 、模态 振 型 和阻尼 比的关 系 。通 过 钢梁 的振 动试 验证 明 动应变相关 函数幅值 向量作为损伤敏感特征参数
作者 简 介 :李 苗 ( 1 9 8 0 一 ) ,男 ,湖南 益 阳人 ,博士 ,讲 师 ,研 究 方 向 :土木工 程 。
1 0



市 学
院 学
报 (自然科学版 )
2 0 1 5 年第3 期
是外部激励,f L } f ( t ) 是将激励施加于某自由 度。
[ 】 { ( f ) } + [
动 应 变测试 ,验证 了:( 1 )钢 梁在 无损状态下 ,动应 变相 关函数幅值 向量 曲线呈现 一致的形式;( 2)引入的
损 伤会 导致 相关函数 幅值 向量各元 素的比例 发生改变 ,但 变化量不与损 伤的程度成正比。
关键词 :损伤识 别;动应 变;相 关函数 中图分类号 :N9 4 9 文献标识码 :A d o i : 1 0 . 3 9 6 9  ̄ . i s s n . 1 6 7 2 . 7 3 0 4 . 2 0 1 5 . 0 3 . 0 0 3
me c h a n i c s , 1 9 9 7( 9 ) : 8 9 7 07 1 . 【 2 ] C a wl e y Ad a ms R D. T h e l o c a t i o n o f d e f e c t s i n s t r u c t u r e s f r o m
∽= [ P I N} ( 9 ) 式中【 】 为 坐标 变换矩阵,{ ) 为总 体坐 标中 节
点位 移 向量 。式( 8 ) 可 表示 为 ,
当O " t = o - 2 时, 式中S 是一个常数, 为_ 厂 ( f ) 幅 值的平方 ;f i ( t ) 为单位脉冲函数 ,即 D i r a c 函数。 该 函数具有抽样的特性 ,即
的有 效 性 。
取、 处理数据 , 评估结构主要性能指标 ( 可靠度 、 耐久性等 ) 的有效方法。健康监测 的主要研究 内
容之 一 就是 寻找 结构损 伤 指标 。 结 构发 生损 伤 时 , 其 刚度 和质 量会 随 之变化 ,从 而 引起 动力 特征 参 数的变化 。C a w l e y [ ] 等最早利用结构 固有频率的 变化 进 行损 伤识 别 。模态 振 型包括 位 移模态 振 型
将 式( 1 2 ) 代入 式( 1 1 ) 得
( 1 2 )


叫 I c o a i ] J s i I l (
第2 4卷
李苗等 :动应 变相 关函数幅值 向量在结构异常识别 中的试验研究
1 3
参 考 文献 :
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