卷面成绩不及格率超过%的分析表
WB试验每步原理和技术及试剂的分析
WB试验每步原理和技术及试剂的分析WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。
讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。
一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。
我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。
你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。
另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的目的了。
封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。
如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。
除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。
western blot技术
百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。
利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。
WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。
转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。
通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。
通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
wb蛋白定量
百泰派克生物科技
wb蛋白定量
蛋白质印迹（Western blotting，WB）是细胞和分子生物学中的一项重要技术。
通过使用蛋白质印迹，研究人员能够从细胞中提取的复杂蛋白质混合物中鉴定出特定的蛋白质。
该技术使用通过三个步骤来完成这一任务：（1）按大小进行蛋白分离，（2）将蛋白转移到固体支持物上，（3）使用合适的一级和二级抗体标记靶蛋白进
行可视化。
WB通常用于分离和鉴定蛋白质的研究，也可用于蛋白含量的鉴定。
在这种技术中，根据蛋白质分子质量差异通过凝胶电泳分离蛋白质混合物，然后将分离开来的蛋白条带转移到PV或NC上，每种蛋白质产生一个条带。
将膜与目标蛋白特异性的标记抗体一起孵育，洗去未结合的抗体，只留下与目的蛋白结合的抗体。
最后通过显影薄膜来检测结合的抗体。
由于抗体只与感兴趣的蛋白质结合，因此只能看到一个条带。
条带的厚度对应于存在的蛋白质的量；因此，可以预先做一个条带厚度与含量关系的标准即可对蛋白质的含量进行鉴定。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供快速准确的蛋白质定量鉴定服务技术包裹，可
对各种蛋白进行精确的含量鉴定，包括蛋白质提取物、SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋
白胶点、pull-down及Co-IP等样品中的蛋白质等，还可根据需求提供定制化的检
测方案，欢迎免费咨询。
WB实验步骤(精)
Western blotting实验步骤1．蛋白质的样品制备：取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。
将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。
2 .测定蛋白浓度：2.1 按50：1配置BCA工作液。
2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。
2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。
2.4 分别加PBS定容至20ul。
2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。
2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。
3 SDS-PAGE电泳：3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。
同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。
吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。
3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。
（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。
3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。
WB详细操作步骤
Western blot实验检测蛋白表达，抗体很重要，用到的有一抗、二抗、内参抗体WB步骤1 蛋白样本处理：(1)一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
(2) 一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。
2 分离胶浓缩胶配方如下：分离胶的浓度要根据蛋白的大小来决定，如下表所示：SDS-PAGE分离胶浓度（%）最佳分离范围（kD）6 50-1508 30-9010 20-8012 12-6015 10-40不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：分离胶5%浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 试剂体积去离子水（mL) 5.52 4.8 3.96 2.76 去离子水（mL) 4.0 30%丙烯酰胺（mL) 3.24 3.96 4.8 6.0 30%丙烯酰胺（mL) 1.01.5mol/lTris.cl(PH8.8)（mL) 3.0 3.0 3.0 3.01.0mol/lTris.cl(PH6.8)（mL)1.010%SDS（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%SDS（μL)80.0 10%AP（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%AP（μL)60.0 TEMED（μL)7.2 4.8 4.8 4.8 TEMED（μL)8.0 总体积（mL) 12.0 12.0 12.0 12.0 总体积（mL) 6.03 制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40 min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10 min。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
WB原理、步骤与总结
实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理基于免疫学技术，主要包括以下几个步骤：1. 细胞裂解，首先需要将待检测的细胞或组织样品进行裂解，使得蛋白质释放出来。
2. 蛋白质分离，裂解后的蛋白质需要通过电泳或其他方法进行分离，以便后续的检测。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常采用电泳转印的方法。
4. 抗体结合，将特异性的一抗与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解，将含有蛋白质的细胞或组织样品加入裂解液中，使用超声或搅拌等方法进行充分裂解。
2. 蛋白质分离，将裂解后的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常使用半干法或湿法转印。
4. 抗体结合，将膜中的蛋白质与特异性的一抗结合，通常需要进行过夜孵育，以保证抗体与蛋白质的充分结合。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测抗体与蛋白质复合物的信号，得到目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
在进行WB实验时，需要注意以下几点：1. 样品处理，样品的裂解和处理过程需要在低温和无酶的条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 抗体选择，选择特异性良好的一抗和二抗，以确保实验结果的准确性。
3. 数据分析，对实验结果进行准确的数据分析，包括目标蛋白的相对表达水平和统计学分析。
四、实验应用。
WB实验广泛应用于生物医学研究领域，可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰和相互作用等。
在癌症、免疫学、神经科学等领域具有重要的应用价值。
总之，WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，掌握其原理和步骤对于开展生物学研究具有重要意义。
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教研室意见Βιβλιοθήκη 教研室主任：年 月 日院系意见
院系领导：年 月 日
本次期末采用闭卷笔试考核，由平时成绩和期末考试成绩构成，分别占到该门课程期末总评成绩的40%和60%。其中平时成绩由三部分构成，即作业成绩、考勤成绩和课堂问答与讨论成绩，分别占平时成绩的30%、30%和40%。作业成绩和课堂问答成绩均采用五级制方式记录，最终成绩取各次成绩的平均分，考勤成绩根据每次课堂情况记录考核。平时成绩能够有一定的依据作为支撑，基本可以相对公正的反映学生平时的各项表现。
根据专项检查要求，组织相关人员进行调研，逐一填写如下表格且写出分析报告；建议从试题与大纲的符合度、试题的难易程度、教学内容与方法、对学生学习的指导、平时成绩的信度、学生学习态度等方面分析；一门课程填写一张表格
专业
班级
课程名称
课程编码
任课教师
参加考试学生人数
卷面不及格人数
总评不及格人数
本试卷主要由五部分构成，分为选择题、判断题、简答题、计算题和综合分析题，主客观题分别占到了试卷的40%和60%。试卷所涉及内容覆盖教学大纲中所涉及的全部章节，符合人才培养方案的要求，且试题难易适中。本次试题较往年最大的变化是注重学生实际应用能力的考核及对知识点的理解和应用。简答题共3题，全部可以根据实际体会总结和回答；计算题第2题综合了排队论和流程设计两个章节的内容；分析题的背景也相对开放，需要学生“看图说话”，读懂，理解，并能分析和提出建议。
2、综合运用知识能力还不强。主要体现在最后的综合分析题，因为涉及到对知识点的理解和应用，往往无法清楚表达其理由；在分析中不能切中要害，往往没有阅读清楚背景材料就动笔，导致回答问题不全面，不能准确作答。
3、本次试题的选择上，记忆性的少，综合应用的多，学生在此方面依然表现出薄弱，虽然在日常教学中有所侧重，但还需进一步加强。这可能也是导致卷面整体分数不高的主要原因之一。
从试卷本身来看，卷面整体成绩看，及格率不高，仅达到%，总体卷面平均分为分，其中最高分分，最低分分，整体分数不够理想。从改卷过程中的得分情况看，分数差异主要表现为选择题得分差异较大，另外综合分析题和计算题第2题失分较严重，分析原因可能表现为以下几点：
1、基本概念理解不清。选择题和名词解释考核的都是基本概念的理解和识记，但是单选个别题目错误严重，可见对相关知识点掌握不全面、不准确。日后教学应加强这方面的练习力度。
该门课程为信息管理与信息系统专业的专业必修课，日常教学主要采用讲授为主，适当案例分析、课内外练习和企业运营模拟综合训练的方式进行。本学期共布置4次课外作业，全收全改2次；平时出现的共同问题，利用课上时间集中讲解；此外，全班共分成6组，进行两次生产运营模拟训练。该班学生整体学习态度认真，课堂表现较好，无迟到、旷课等现象，但课堂问答不够活跃，学习技巧和灵活运用能力还有待进一步提高，这也是后续教学设计想达到的目标。