【2019年整理】五种烟草病毒TMV
烟草花叶病毒
TMV的形态特征
TMV的形态特征
烟草花叶病毒具有杆状外观。它的衣壳由2130分子衣壳蛋白和一分子基因组单链正义RNA组成，长6400个碱基。外壳蛋白在RNA周围自组装成杆状螺旋结构（每螺旋圈16.3个蛋白质），形成发夹环结构。蛋白质单体由158个氨基酸组成，这些氨基酸被组装成四个主要的α-螺旋，这些螺旋通过近于病毒体轴的突出环连接在一起。病毒粒子的长度约为300nm，直径约为18nm。负染色的电子显微照片显示出半径为2nm的独特内部通道。RNA位于4nm的半径处，并被外壳蛋白保护免受细胞酶的作用。基于3.6Å(0.36纳米)分辨率的电子密度图，研究了完整病毒的X射线纤维衍射结构。衣壳螺旋内部的核心附近是卷曲的RNA分子，它由6395±10个核苷酸组成
TMV病毒基因组
TMV基因组由6.3–6.5 kb单链（ss）RNA组成。 3'末端具有类似tRNA的结构，而5'末端则具有甲基化的核苷酸帽——m7G5’pppG。基因组编码4个开放阅读框（ORF），其中两个由于泄漏的UAG终止密码子的核糖体通读而产生单一蛋白质。 这4个基因编码一个复制酶（具有甲基转移酶[MT]和RNA解旋酶[Hel]域）和RNA依赖性RNA聚合酶，所谓的运动蛋白（MP）和衣壳蛋白（CP）。
致谢
TMV的发现
TMV 的第一张电子品微镜图像是1939年由 Gustav Kausche , Edgar Pfankuch 和 HelmutRuska 制成的1955年， Heinz Fraenkel-Conrat 和 Robley Williams 表明纯化的TMV RNA 及其衣壳(外壳）蛋白自行组装成功能性病毒，表明这是最稳定的结构（自由能最低的结构）1958年，晶体学家罗莎琳德 • 富兰克林(Rosalind Franklin）设计并制造了 TMV 模型，她推测该病毒是空心的，而不是固体，并推断TMV 的 RNA 是单链的TMV是第一个被鉴定为病毒的病原体
烟草病毒病简介及防治
CMV
PVY PVX TEV TRSV BCTV TVBMV TCMV TSV TBRV
黄瓜花叶病
马铃薯Y病毒 马铃薯X病毒 烟草蚀纹病毒 烟草环斑病毒 甜菜曲顶病毒 烟草脉带花叶病毒 烟草褪绿斑驳病毒 烟草条纹病毒 番茄黑环病毒
Cucumber mosaic virus
Potato virus Y potato virus X Tobacco etch virus Tobacco ring spot virus Beet curly top virus Tobacco vein banding mosaic virus Tobacco chlorotic mottle virus Tobacco Streak Virus tomato black ring nepovirus
蚜虫
蚜虫 机械传播 蚜虫 种子、美洲剑线虫 、蓟马、蚜虫、叶蝉 等 叶蝉
线虫
ToMV
TuMV TLCV TSWV TYLCV
番茄花叶病毒
芜菁花叶病毒 烟草曲叶病毒 番茄斑萎病毒 番茄黄化曲叶病毒病
tomato mosaic virus
Tunip mosaic virus Tobacco leaf curl spot virus Tomato spotted wilt virus Tomato yellow leaf curl virus
TMV、CMV、PVY TMV、CMV、PVY、 TEV、TSWV、TRV TMV、CMV、PVY、 TEV、BCTV、PVX、TLCV、TRSV、TSV、 TBRV、ToMV、TuMV、 TMV、CMV、PVY、 TLCV、TVBMV、 TMV、CMV、PVY、 ToMV、TuMV
湖南
广西 湖北
烟草花叶病毒（TMV）基因编码蛋白研究进展
烟草花叶病毒（TMV）基因编码蛋白研究进展摘要：烟草花叶病毒属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.本文综述了近年来有关这四个蛋白质的表达、功能和外壳蛋白合成抑制物等方面的一些研究结果，以期为这方面的研究提供理论依据。
关键词：TMV基因编码蛋白表达功能烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）属于烟草花叶病毒属。
该属基因组编码四种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和17.5kD.其中126kD和183kD蛋白参与病毒的复制，称为RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亚基；183kD的蛋白是126kD 蛋白的阅读框终止子通读的产物；30kD蛋白参与病毒在寄主细胞间的移动，称为运动蛋白（Movementpro2tein，MP）；17.5kD的蛋白为病毒的外壳蛋白（Capsidprotein，CP）。
烟草花叶病毒（TMV）侵染后30～40小时感病叶内126KDa和183KDa蛋白质达到高水平；外壳蛋白在侵染后10小时才开始合成，30～40小时达到高峰；相比之下，体内30KDa蛋白质早就出现，在侵染后20小时达最高值，这很可能与30KDa涉及负责病毒在细胞与细胞间的转运有关。
1 126kD/183kD蛋白1.11 26kD/183kD蛋白表达烟草花叶病毒通过机械伤口或者借助媒介昆虫进入细胞内，在病毒颗粒部分脱壳露出基因RNA的5′端时即侵染后1-10分钟内，翻译开始首先合成126KDa和183KDa的两种蛋白质。
183KDa 是由126KDa基通读而产生，Tyr插在这个琥珀型终止子上，有6个保守的核苷酸［1］。
1.21 26kD/183kD蛋白功能烟草花叶病毒复制所需依赖的RNA的聚合酶由两部分组成：一是由寄主提供的亚基，一是由病毒编码的特异的复制酶亚基组合成有专一性的全酶。
[2]183KDa有RNA依赖的RNA聚合酶的结构，126KDa的C端有类似于螺旋酶和甲基转移酶的基本结构［3，4］。
烟草病毒病
烟草病毒病Tobacco Viral Diseases烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类重要病害，种类很多，国外报道已从烟草上分离到的病毒有27种左右，国内已发现16种，其中发生普遍的有烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和烟草蚀纹病毒（TEV）等。
各种病毒病在不同的地区间分布略有差异，TMV主要分布在东北、云南、贵州、广东、四川等烟区，CMV 主要发生在黄淮、西南、西北、福建等烟区，在很多地区还存在TMV和CMV的复合侵染。
马铃薯Y病毒90年代以前在大多数烟区发生较轻，90年代中后期在某些烟区如山东、安徽、云南及东北等省区危害加重，1996年皖北烟区马铃薯Y病毒的暴发流行，曾给烟叶生产造成巨大损失，山东的PVY与CMV复合侵染也是生产上亟待解决的问题。
症状TMV引起的烟草花叶病：苗期至大田期均可发生，烟株感病后一般5~7d表现症状。
发病初期，新叶叶脉颜色变浅，呈半透明状明脉，随后叶脉两侧叶肉组织褪绿，形成黄绿相间的斑驳或花叶。
田间症状因气候条件、病毒株系不同而异，大致可分为两种类型：一是轻型花叶，仅表现为叶片褪绿，形成黄绿相间的花叶或驳斑，植株高度及叶片形状、大小均无明显变化。
一般成株期感病，易表现此类症状；另一种为重型花叶，叶片上部分叶肉组织增大或增多，叶片厚薄不匀，形成很多泡状突起，叶片皱缩，扭曲畸形，叶尖细长有时叶缘背卷。
若苗期感病，则发病更重。
整个植株节间缩短，严重矮化，生长缓慢，几乎无经济价值。
后期不能正常开花结实，或结出的蒴果小而皱缩，种子量少，多数不能发芽。
CMV引起的烟草花叶病：与TMV在田间症状相似，有时不容易区别。
发病初也表现明脉，然后形成花叶，重病叶也会表现扭曲，形成泡状突起等症状。
但随病毒株系、品种不同而症状有较大变化。
除表现花叶外，有时伴有叶片狭窄，叶基呈拉紧状，叶片上茸毛稀少，叶色发暗，无光泽。
病叶有时粗糙，发脆呈革质，叶基部伸长，侧翼变窄变薄，叶尖细长。
烟草常见病害
烟草常见病害Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】烟草常见病害烟草在我国分布十分广泛，东起黄海之滨，西至伊犁边陲，南起海南岛，北迄白山黑水间。
在经度74°～135°，纬度180°～53°范围内，从低于海平面的吐鲁番盆地到海拔3000米以上的高原山区，到处都有烟草的足迹。
因此,了解我国烟草的常见病害,对从事烟草病害的工作者是有益的。
一、烟草黄瓜花叶病毒病烟草黄瓜花叶病毒病分布于全世界，其重要性仅次于普通花叶病毒病。
在我国各烟区都有发生，而以黄淮、华中及华南烟区发生较重。
在山东、河南、辽宁、陕西、安徽、湖南、湖北及台湾烟区，其危害程度已远远超过普通花叶病。
近几年烟草黄瓜花叶病毒病已成为我国烟草上的主要病害，对烟叶生产带来很大的威胁。
重病区在流行年份减产25%-30%，严重时常减产50%左右。
病叶碳水化合物含量减少，含氮量增加，施木克值降低，品质下降，尼古丁含量稍降。
但总的来说，产量的损失要超过品质的损失。
黄瓜花叶病毒病的寄主范围广泛，是第一个发现可以同时侵染单子叶植物和双子叶植物的病毒。
可侵染茄科、葫芦科、十字花科、菊科等作物达45个科的300多种植物。
(1)症状：烟草黄瓜花叶病毒病的主要特征是引致烟草花叶，苗期和大田期均可发生。
发病初期表现脉明，几天后病叶形成深绿、浅绿相间的花叶，并常呈现疮斑。
有的病叶表面呈革质、叶畸形、成线状；有的叶基变长，侧翼变狭变薄，叶片细长；有的病叶叶缘向上卷曲，有的沿叶脉出现闪电状坏死，有的叶片呈现黄色斑驳，有的整株黄化。
早期受侵染的烟株，严重矮化，高度不及健株一半。
这一病毒的株系很多，不同烟草品种间对病毒的反应也不一致，因此表现的症状常有变化。
病叶中的栅栏组织细胞缩短、海绵组织的薄壁组织被压紧，叶片变薄，病叶的叶绿体数量虽然很多，但受压而缩小，病叶维管束直径也小于健叶，病叶细胞内无细胞内含物。
烟草普通花叶病毒病 烟草病毒病
大田期：病苗、土壤中残存的 病毒及其它带毒的寄主。
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三、侵染循环
传染： 只能通过微伤口侵入，极少从气孔侵入。
由TMV引起的花叶病流行，主要是通过农 事操作中借人和工具的机械接触传染，风 使叶片相互之间的摩擦发病的。
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二、病 原 物
1. TMV 粒体杆状。增殖适温为28～30 ℃， 钝化温度为93～98 ℃，稀释限点为10-7。
2. CMV 粒体球状。钝化温度为65～70℃； 稀释限点约10-4，体外存活期为3～4天。
3. PVY 粒体线形。钝化温度为55～65 ℃， 稀释限点为10-3，体外存活期为1～2天。
种病害，在北美所有烟草种植区都有发生， 其流行程度仅次于TMV。 我国山东、河南、陕西、黑龙江等卜省、 自治区均有零星发生，危害较轻，云南、 安徽两省发生稍重。
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一、病原与症状
烟草环斑病毒病由线虫传的烟草 环斑病毒(TRSV)侵染所致。
其粒体为等轴对称球形。
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一、症状
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二、病 原 物
引致烟草花叶病的病毒主要有烟草花叶病毒 Tobacco mosaic virus ，TMV、黄瓜花叶 病毒Cucumber mosaic virus, CMV和马 铃薯Y病毒Potato virus Y, PVY。分别属于 烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、黄瓜花叶 病毒属(Cucumovirus)和马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)。
烟草上常见的病毒病简介
烟草病毒病一烟草普通花叶病毒病（tobacco mosaic virus）1 症状发病时期：整个生育期，移栽后20天到现蕾期为高峰期。
发病部位：系统感染，整株发病。
症状特点：首先新叶出现“明脉”，蔓延至整个叶片形成黄绿相间的斑驳，明脉4-6天后，新叶“花叶”常见症状可分三类：轻型花叶—叶片上形成黄绿相间的花叶斑驳，基本不变形，叶肉明显变薄或薄厚不均；重型花叶—叶缘缺刻、向下卷，皱缩扭曲，有的甚至细带状；花叶灼斑—大面积红褐色坏死斑。
根系受影响不大2病原物TMV。
细胞核附近呈圆形或不定形的X体；大小不规则的六角棱形或长方形的结晶体，此为病毒与寄主蛋白的结合体，可作区别3 发病规律病株残体造成初次浸染；其他作物寄主及野生寄主作为初侵染源；土壤传毒4 防治栽种抗耐性品种加强栽培措施，发挥营养抗性作用a. 选种及种子消毒无病株上采种单收单藏，0.1%硝酸银/硫酸锌浸种10分钟b.加强苗床管理，培育无毒壮苗；c.坚持卫生栽培；d.轮作；e.加强栽培管理，提高营养抗性使用抗病毒药剂二烟草黄瓜花叶病毒病（cucumber mosaic virus）1 症状发病时期：整个生育期，旺长期出现高峰。
发病部位：系统感染，整株发病。
症状特点：初期“明脉”，逐渐在新叶上花叶，病叶变窄，伸直呈拉紧状，叶表面绒毛稀少失去光泽。
有的病叶粗糙，发脆，如革质，叶基部常伸长，两侧叶肉组织变窄变薄，甚至完全消失。
叶尖细长，有些病叶边缘向上卷曲。
与tmv区别：病叶基部伸长，绒毛脱落呈革质状，病叶边缘向上翻卷，对根系的影响很大。
2 病原CMV烟蚜、棉蚜等传毒3 发病规律病害循环：主要在越冬蔬菜、多年生树木及农田杂草中过冬。
蚜传、机械传4 防治利用抗耐病品种避蚜防病：利用银灰地膜覆盖，可以有效趋避蚜虫向烟田内迁飞；利用铝箔纸避蚜；悬挂铝膜带。
药剂治蚜：40%乐果兑水喷桃树菜田实行烟麦套种为中心的农业防治措施坚持卫生栽培抗病毒药剂的应用与推广致弱卫星RNA的应用三烟草马铃薯Y病毒病（potato virus Y）1 症状发病时期：自苗期到成株期，大田成株期发病多发病部位：系统感染，整株发病。
五种烟草病毒的多重RT-PCR同步检测探索
的 模 板量
核 酸 片段 的
特 征 是 经 济 性 和 高效 性
,
结 果证 实
时
,
已 经 有所 加 强 了 T M V 片 段 亮 度
。
TV BM V
中会 有
。
目前 在 检 测病 原 微 生 物 和 和 基 因 诊 断 中
具 有 广泛 的 应 用
并运用
P CR RN A
隐约 的 条带 出现
5
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5
多 重 R 丁 p C R 检 测 结 果 分析 首先将
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年加 重
CMV
、
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目前
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、
,
我 国烟 草 常 见 的病 毒 种 类 为
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,
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、
对 引物 加 人
℃
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,
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,
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及
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,
它们 能对 叶的 质 量 和产 量
。
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0
.
分 析结果 提升
T
在
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、
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.
产 生 直 接 的影 响 和 预 防上
PC R
,
导 致 经济 损 失 巨 大
,
在 对 烟 草 病 毒 的 控制
。
,
不 出现 在
。
T V BMV
片段
:
保持
T v BMv
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检测步骤
1.3 单重RT-PCR
单果重RT-PCR用2P电5CMμR泳-LMb检PuLC测fVfeR结反r 标［转准7录5反0酶m应反m体转o系l录/L:合1T4成r．is各-H3病Cμl毒L( pdcHdDH8N．2AO8第，) 一2，．链2050μmLm10ol×/L 以TMV、CM(2VNμ、HLT4dEN)V2T、SPO( 各4，2．0．5m1%moTlw/Le)e，n210］μL，上2游μL和2下5 游mm引o物l /混L M合g物Cl2， PVY 和TVBM( 各V 150种μm病ol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL 毒的反转录产cD物N作A 为模P板C。R PCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性 反应的模板，30经sP，C4R8℃扩退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸 增分别得到大10小m为in2。37取、5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带
检测步骤
1．2引物的设计与筛选
应用Primer Premier 5． 0 引物设计软件分别设计这5 种病 毒的特异引物TMV cpF /TMV cpR、CMV cpF /CMV cpR、 TEV cpF /TEVcpR、PVY cpF /PVY cpR 和TVBMV cpF /TVBMVcpR。由于多重RT-PCR 要求在同一退火温度下同 时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选， 选择Tm 值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同 时检测到TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 这5 种病毒
病毒混合侵染烟草的检测
2007 －2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样 品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒 ( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟 草脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染. 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草 中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。
检测步骤
1.4 多重RT-PCR
优C1板∶.M4化的PV∶V后比∶Y1的例∶T∶为5ETV对VT1BM∶引∶多 P反 R加MV物VPTV1重转入∶VY-比=∶PYCR录一例1:1和CM．T.T为5合个VRVT，-4BTP∶V∶成反5M反MCB种VVT1c应R应ME∶=∶模DV管V的反NA5进模应，种行板体将病P，系RC毒将:TR取的各产反T混病M物应合毒V随。、病特机C株异混M提性合V取、引作总T物为ER同V多N、时重A， 1∶ 1∶ 1． 6退。。火结温果度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、 显示，退火温度54在℃48和℃和575℃1℃;所延伸时间分别为40、50、60、70、 获得的目的条带80相和对较90好。s;延循伸环次数选择20、25、30、35、40 时间在60 和90和s4能5获个得循理想环的进结行多重RT-PCR体系优化
检测步骤
1．1 病毒总RNA 的提取 TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 核酸均为线状单链正义 RNA。植物总RNA 的浓度及纯度是影响RT-PCR 检测的关键 因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但 是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长， 容易造成总RNA 降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对 植物病毒进行PCR 检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总 RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV 、TEV、 PVY 和TVBMV等5 种主要烟草病毒
小结
一直以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针 对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等 方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常 关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要 使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要 尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比 对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了 引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致， 保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和 TVBMV 5种病毒 DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素， 若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本 研究扩增5 个片段大小选择在200 ～ 500 bp 之间。由于多重 RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段 的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同， 因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要 的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和 模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量
我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒 ( TMV) 、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草 蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病( PVY) 和烟草脉带花叶病( TVBMV) ，通常发 生复合侵染。本研究对我国5 种烟草病 毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物， 建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、 PVY 和TVBMV 的多重RT-PCR 检测 体系。对田间样品检测结果证明，多 重RT-PCR 体系能够同时检测5 种病毒， 并且灵敏度高
目前检测手段
目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及 PCR 技术。其中PCR 技术具有快速、便捷、灵敏度高和 特异性强等显著优点。
多重RT-PCR技术：多重PCR 是在同一反应体系中加入两 对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应， 具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于 基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。
果，而且40、50、70 和80 s 之 间没有明显 的差别(
检测步骤
1. 6 PCR产物的克隆和测序
多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.＆.Q.凝胶回收试 剂盒回收纯化后，纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4℃ 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM109 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性 和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经 菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委 托金思特科技( 南京) 有限公司测序。
五种烟草病毒TMV、CMV、 TEV、PVY 及
TVBMV 的多重RT-PCR同步检 测
植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41( 2): 146-153( 2011)
介绍
烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus； TMV），又译为烟草花叶病毒，是一 种RNA病毒，专门感染植物，尤其是 烟草及其他茄科植物，能使这些受感 染的叶片看来斑驳污损