第八章 动物基因工程
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动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程是农业和食品生产中利用生物技术来修改和优化
动物基因组以实现预期目标的一种技术。
它涉及研究和开发改良动物性状，提高动物产量，增强动物健康，改善食品品质和动物营养，以及建立更安全，更有效和更合理的动物繁殖和饲养方法等。
动物基因工程可以把有用的基因组合插入动物体内，以获得更好的性状和能力，从而提高生产效率。
它的应用可以从肉类，乳制品，蛋类，水果和蔬菜等多个方面来看，改善产品的质量和性能，增加其生产量和可持续性。
实施动物基因工程的主要技术有转基因技术和编辑技术。
转基因技术通过将有用的基因插入动物体内来修改它们的性状，通常是将来自其他生物体中的基因插入动物体内。
编辑技术则是在动物体内编辑现有基因，而不是添加新基因，以获得预期的性状。
动物基因工程也是值得讨论的话题，它有助于提高食品安全，增强抗性，延长保质期，改善质量，提高产量，简化品种，等等。
这些改变的从繁殖和遗传学角度都是永久的，即使留下的影响是未知的也可以预见。
当然，它也可能带来一些负面影响，例如引发环境污染或威胁多样性。
因此，必须在研究和使用动物基因工程技术时，严格遵守环境和健康安全法规，并进行足够的监管。
总之，动物基因工程在提高动物的性能和效率方面提供了一种新的途径，但实施此项技术要非常小心，以确保安全和优势的持续使用。
- 1 -。
《动物基因工程》课件
基因工程可以帮助提高动 物的抗病性和生产效率， 促进农业可持续发展。
动物基因工程面临的挑战
技术难度
动物基因工程涉及到复杂 的生物学和遗传学知识， 技术难度较大。
伦理和法律问题
动物基因工程涉及到伦理 和法律问题，需要制定相 应的法规和伦理规范。
社会接受度
动物基因工程需要得到社 会的广泛接受和支持，需 要加强宣传和教育。
增强农业生产力
动物基因工程可以提 高农业生产效率，保 障粮食安全。
THANKS
感谢观看
生态平衡维护
基因工程动物释放到环境中可能对生态平衡产生影响，引发伦理考 量。
基因歧视
基因工程动物可能引发对某些人群的基因歧视，需要关注平等和公正 的伦理原则。
国际动物基因工程法规
《关于转基因生物安全性的准则》
联合国粮食及农业组织与世界卫生组织共同制定的国际法规，旨在确保转基因生物的安全使用 和释放。
常见的基因修饰动物包括基因敲入动物、基因 敲除与敲入相结合的动物、条件性基因敲除动 物等。
基因修饰动物制备过程中需要关注基因修饰位 点的选择、修饰效率、表型变化等多个因素， 以确保基因修饰动物的制备成功和实验效果。
04
动物基因工程伦理与法规
动物基因工程伦理问题
动物权益保护
基因工程对动物福利的影响，如疼痛、疾病和死亡在实验过程中所 涉及的伦理问题。
福利。
动物基因表达调控
1 2
基因表达调控机制
包括转录水平调控、转录后水平调控和翻译水平 调控等。
调控方式
包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调节等 。
3
调控的意义
通过调控基因表达，可以影响动物的生长发育、 生理功能和行为表现等。
动物基因工程面临的挑战
技术难度
动物基因工程涉及到复杂 的生物学和遗传学知识， 技术难度较大。
伦理和法律问题
动物基因工程涉及到伦理 和法律问题，需要制定相 应的法规和伦理规范。
社会接受度
动物基因工程需要得到社 会的广泛接受和支持，需 要加强宣传和教育。
增强农业生产力
动物基因工程可以提 高农业生产效率，保 障粮食安全。
THANKS
感谢观看
生态平衡维护
基因工程动物释放到环境中可能对生态平衡产生影响，引发伦理考 量。
基因歧视
基因工程动物可能引发对某些人群的基因歧视，需要关注平等和公正 的伦理原则。
国际动物基因工程法规
《关于转基因生物安全性的准则》
联合国粮食及农业组织与世界卫生组织共同制定的国际法规，旨在确保转基因生物的安全使用 和释放。
常见的基因修饰动物包括基因敲入动物、基因 敲除与敲入相结合的动物、条件性基因敲除动 物等。
基因修饰动物制备过程中需要关注基因修饰位 点的选择、修饰效率、表型变化等多个因素， 以确保基因修饰动物的制备成功和实验效果。
04
动物基因工程伦理与法规
动物基因工程伦理问题
动物权益保护
基因工程对动物福利的影响，如疼痛、疾病和死亡在实验过程中所 涉及的伦理问题。
福利。
动物基因表达调控
1 2
基因表达调控机制
包括转录水平调控、转录后水平调控和翻译水平 调控等。
调控方式
包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调节等 。
3
调控的意义
通过调控基因表达，可以影响动物的生长发育、 生理功能和行为表现等。
动物基因工程
（gene therapy）——就是 向有功能缺陷的细胞补充相应功能基 因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而 达到治疗的目的。 对象： 体细胞 生殖细胞
二、基因治疗的必要条件 1.发病机制在DNA水平上已经清楚
2.要转移的基因已经克隆分离，其表
达产物有详尽的了解
建立人类疾病的动物模型等
Growth hormone gene
Normal mouse
Transgenic mouse
二、动物生物反应器(Animal Bioreactor)
将有医学价值的活性蛋白基因导入家畜 或家禽的受精卵，然后从体液（乳汁、血 液）或组织中收获基因产物。这种技术有 人称为动物个体表达体系，有人称为动物 器官的生物反应器。
四、基因治疗的基本方式
1. 体内直接转基因
体内法
in vivo
2.体细胞介导的基因治疗 回体法 ex vivo
五、反义RNA、核酶和三链DNA在基 因治疗中的作用
（一）反义RNA在基因治疗中的意义及 需解决的问题 反义RNA与特异的mRNA结合而调控其 翻译 1. 体外合成反义RNA 2. 构建转录反义RNA的重组质粒
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志
HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒 (herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
基因敲除（knock out of gene）
利用基因打靶技术，用无功能的外 源基因转入细胞与基因组中同源序列进 行同源重组，把具有功能的同源序列置
讨论： 基因治疗的 前景与问题
DICER
基因工程
(三)科技发展必需和人文社会科学发展相结合：
1.当代各种全球性问题出现，从一定意义上来说是由 于科学技术广泛应用于社会而引发的，如TMD、NMD(布 什对萨达姆)
2.科学技术是第一生产力，而文化水平是人类把握科 学技术的一个尺度。
3.科学技术是一把双刃剑，原子核技术可以给人类带 来光明，原子弹却可以把长崎、广岛夷为平地；克隆技术， 基因工程技术可以挽救濒临灭绝的动物（国宝熊猫），也可 以动摇人类以性爱为基础的生产方式……（冷冰冰克隆人和 自然人，×情人节少了一个经济增长点；克隆战争狂人和反 战英雄；克隆idea孙悟空齐天大圣）。基因工程技术是当 代科学技术重要的前沿。
（四）此克隆非彼克隆
供体细胞 受体细胞 发育场所 关键区别
胚胎细胞克隆 胚胎细胞（核） 去核未受精的卵细胞 母体宫腔 克隆的是子代（多生了一个）
体细胞克隆 体细胞（核）
去核未受精的卵细胞 母体宫腔
复制的是自己（复制了一个）
（五）克隆是一把双刃剑
试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你” 去犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的政治野心家一下 子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克 隆技术，世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行 的社会伦理道德很难为其“名份”定位，又该怎么办？因此说克隆对 人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、 是父非父、是妻非妻、是子非子之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社 会伦理角度看，用克隆技术培育出的人，有其特定的生理性状，这对 人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响。
二．基因工程的概念
（一）基因（gene） 基因 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序
动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程是一种在生物界中运用现代生物学技术，借助细胞和分子技术，通过调节和改造动物基因，以达到调节生物学特性的技术。
近年来，动物基因工程受到了广泛关注，它在生物科技进步中起到了重要作用。
首先，动物基因工程能够为人类带来很多益处。
动物基因工程可以用于产生药物，例如，经过基因工程处理的牛胰岛素可以治疗糖尿病，经过处理的野毒蛋白可以抑制艾滋病毒。
此外，动物基因工程也可以用于制作生物医药制品，例如抗癌药物，抗病毒药物和镇痛药等。
其次，动物基因工程在农业和畜牧业发展中也有重要作用。
例如，经过基因工程处理的动物抗病力增强，体型变大，体重增加，产量更高、抗寒性更强，抗病虫更强等等，都能够使农业和畜牧业的生产效率提高。
而且，基因工程还能够改进动物的营养成分，改善动物体内结构，从而获得更高品质的动物产品，例如更高蛋白质含量的牛奶、肉等等。
最后，动物基因工程还可以用于维护动物多样性。
人类文明的发展导致动物多样性日益减少，基因工程技术可以帮助科学家们对濒危物种进行基因重组，以恢复其基因组，从而拯救这些濒危动物，挽救它们的灭绝。
从上述可以看出，动物基因工程在生物科技发展中发挥了十分重要的作用。
它不仅可以为农业和动物畜牧业带来巨大的经济效益，而且还可以为人类提供更强效的药物，以及维护动物多样性的能力。
因
此，未来有可能要继续加大动物基因工程技术的研发投入，以推动生物科技的发展，使其更好地服务于人类和动物。
第08章动物基因工程
15
失去磷酸二酯键的缺口 连接酶封闭缺口
缺失核苷酸的缺口 连接酶无法封闭缺口
16
平末端DNA片段的末端加尾连接法
5’
3’
5’
3’
3’
+dATP
5’
末端核苷酸转移酶
3’ +dTTP
5’
5’
5’
3’
AAAAA 3’
3’ TTTT
3’
5’
5’
DNA聚合酶和
T4DNA连接酶
17
5 核酸酶
核酸酶S1(nuclease S1) 核酸外切酶Ⅲ
经PCR扩增后，扩增产物有多少个碱基？
28
分析
1 CTGAAGAAGAGACAAGTTTTGGGACTGGTGACAATTGTCTAGAGAGCATG GACTTCTTCTCTGTTCAAAACCCTGACCACTGTTAACAGATCTCTCGTAC
51 GAGGGCCATGTCAAGCGCCCCATGAATGCATTTATGGTGTGGTCCCGTGG CTCCCGGTACAGTTCGCGGGGTACTTACGTAAATACCACACCAGGGCACC …………………………………………………………………
Xba I
300bp 500bp
600bp 150bp
11
酶切反应的基本步骤
加反应液 37℃ 1h
电泳
－
CK T M
CK T M
紫外分析
＋
Buffer (10×) 2.0 µL
Water
16.5 µL
DNA
1.0 µL
1.0kb
Enzyme
0.5 µL
Volume
20.0 µL
失去磷酸二酯键的缺口 连接酶封闭缺口
缺失核苷酸的缺口 连接酶无法封闭缺口
16
平末端DNA片段的末端加尾连接法
5’
3’
5’
3’
3’
+dATP
5’
末端核苷酸转移酶
3’ +dTTP
5’
5’
5’
3’
AAAAA 3’
3’ TTTT
3’
5’
5’
DNA聚合酶和
T4DNA连接酶
17
5 核酸酶
核酸酶S1(nuclease S1) 核酸外切酶Ⅲ
经PCR扩增后，扩增产物有多少个碱基？
28
分析
1 CTGAAGAAGAGACAAGTTTTGGGACTGGTGACAATTGTCTAGAGAGCATG GACTTCTTCTCTGTTCAAAACCCTGACCACTGTTAACAGATCTCTCGTAC
51 GAGGGCCATGTCAAGCGCCCCATGAATGCATTTATGGTGTGGTCCCGTGG CTCCCGGTACAGTTCGCGGGGTACTTACGTAAATACCACACCAGGGCACC …………………………………………………………………
Xba I
300bp 500bp
600bp 150bp
11
酶切反应的基本步骤
加反应液 37℃ 1h
电泳
－
CK T M
CK T M
紫外分析
＋
Buffer (10×) 2.0 µL
Water
16.5 µL
DNA
1.0 µL
1.0kb
Enzyme
0.5 µL
Volume
20.0 µL
动物基因工程
第一节 哺乳动物基因转移的遗传选择标记
常用的选择基因有： 胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基 因(dhfr)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、细 菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (Eco-gpt)、细菌的新霉素磷酸转移酶基因 (Eco-neo)等。
二氢叶酸还原酶
嘌呤嘧啶的 生物合成
腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶 黄嘌呤黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶 次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶
利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序 利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序
病毒晚期基因启动子 插入外源基因 SV40 载体 去除细菌序列
ori
转化
重组分子
筛选
增殖
筛选标记 分离病毒DNA 分离病毒DNA 感染
缺陷的SV40 缺陷的SV40 辅助病毒
pcDNA3.1CAT
CAT： ransferase（氯霉素乙酰转移酶;用于分析表达量） CAT：Chloramphenicol Acetyl Transferase（氯霉素乙酰转移酶;用于分析表达量）
选择原理：
tk(thymidine kinase)基因及hprt基因的筛选：受体细胞必须是 相应的tk-或hprt-，将细胞培养在含HAT（H：hypoxanthine黄嘌呤， A：aminopterin氨甲喋呤，T：thiymidine胸苷）的培养基中。在A 存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。 这三中核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或hprt基因 的存在细胞才可生长。
二氢叶酸还原酶 胸苷激酶
互补选择的分子基础： 适当的使用这些抑制物，我们可以选择性的控 制某一个合成途径。这就是说，当细胞的一种代 谢途径发生缺陷时，可以从另一种代谢途径得到 补偿，从而能继续存活，因此容易得到突变体； 但是，另一种代谢途径也被一种特殊的药物所阻 断时除非导入野生型基因取代突变的基因，否则 细胞就会死亡。 另一方面，有一些对抑制补救合成途径的药物 呈抗性的基因，在没有补救前体合成的情况下， 也可以用作显性选择标记。
动物基因工程实验教案
动物基因工程实验教案一、实验目的本实验旨在通过实践操作，加深对于基因工程相关知识的理解，并了解动物基因工程技术的基本原理和操作手段。
二、实验器材与试剂器材：1. 微注射仪2. 显微镜3. 实验动物（小鼠）试剂：1. 肌肉松弛剂2. 盐水3. DNA 载体4. 基因编辑工具（如 CRISPR-CAS9 等）三、实验步骤1.准备实验室工作台，拉上实验动物（小鼠）。
2.给实验动物肌肉注射肌肉松弛剂，使其完全放松。
3.以微注射仪将 DNA 载体和基因编辑工具（如 CRISPR-CAS9 等）注射入小鼠体内，可选择不同注射部位。
4.观察实验动物的反应情况，完成实验操作。
四、实验结果与分析通过实验操作，可以得到以下数据及分析结果：1.检测实验动物体内的 DNA 变化情况，发现基因工程技术可以对实验动物体内的基因进行定点编辑，提高精准度。
2.进一步研究实验动物在生物学和医学领域的应用，为相关科研领域提供技术支持。
五、实验结论通过本次实验，我们可以得出以下结论：1.动物基因工程技术可以高效、精准地编辑体内基因，为生物学和医学领域提供技术支持。
2.在实践操作中，我们需要对实验动物进行肌肉松弛处理，避免动物扭曲和抵抗，同时我们还需要在操作过程中注意注射的时机和注射部位等因素，保证实验的可靠性。
六、参考文献1.张三，李四. 基因编辑技术在动物研究中的应用[J]. 生物技术杂志，2020(6).2.王五，赵六. 动物基因工程技术发展现状及其应用[J]. 生命科学学报，2019(3).。
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（1）转基因胚胎干细胞的获得 （2）囊胚注射 （3）嵌合体的检测和育种
胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998)
判断是否是种系嵌合
首先用转基因嵌合体的小鼠与正常的小 鼠交配，对其后代进行检测，如果后代中 有转基因个体出现，证明为种系嵌合，然 后将转基因杂合子个体进行横交就会获得 转基因纯合子和杂合子个体。如果在后代 中没能发现转基因纯合子，应注意是否因 为转基因的纯合造成了胚胎的早期死亡， 无法得到成活个体所致。
转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整
合。
为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有
位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可 以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和 MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么 位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表 达。
AAV具有以下几个方面特点：
非致病性、无免疫原性和无炎症反应 能感染静止期的细胞，如神经元细胞 插入的外源基因表达时间长，可达到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化
（3）反转录病毒
反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主 细胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶， 以单链的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形 双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整 合到宿主的基因组内，此时整和的病毒序列被称为 前病毒。 反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其 DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5`-LTR中的 一个强启动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因 组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白 和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链 和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒 以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。
（3）基因下调（knock-down）
RNA干扰（RNAi）又被称为基因下调，通过 干扰RNA（siRNA）分子的作用达到转录后基 因沉默的效应。 siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和 siRNA表达载体两种。体外合成的siRNA易转 染细胞，进入细胞后，可直接发挥作用，一般 不存在siRNA 表达载体的转录效率低及细胞毒 性等问题。但是体外合成的siRNA 只能瞬间干 扰，不能达到长久抑制病毒的效果。
3、转基因体细胞核移植法生产转基因牛
基因的准备 供体细胞获取 卵母细胞的获得 体外成熟培养
传代培养、扩增
供体细胞的转基因
卵母细胞的去核
转基因供体细胞的筛选与扩增
核移植
获得转基因个体
胚胎移植
重构胚体外培养
步骤一：从一只６岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为Ａ）的乳腺中取出乳腺细胞，将 其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤 二：从一头苏格兰黑面母绵羊（Ｂ）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除 去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；步骤三：利用电脉冲方法， 使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精 过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成 “胚胎细胞”；步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（Ｃ）的子宫内， 胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。
原病毒DNA转 染进包装细胞 中，包装原病 毒产生将病毒 RNA包装成感 染性病毒粒子 的所有蛋白质 ，但却不能包 装自身的RNA
逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因
第三节 转基因动物制备 转基因动物的制备程序 转基因鉴定 表达水平的检测 转基因动物传代与检测
一 转基因动物的制备程序
DNA显微注射法制备转基因小鼠 胚胎干细胞法制备转基因小鼠 转基因体细胞核移植法生产转基因牛
以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例
2. 病毒载体
作为基因转移的病毒载体须具备以下基 本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达 对机体不致病
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： 基因组的重排率低 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个周期 安全性好，不会整合到人的染色体上，不导 致肿瘤的发生 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要 求不高 外源基因在载体上容易高效表达
利用点穿孔法进行基因转移
（2）显微注射法 将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过 玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵 的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转 基因动物。 （3）基因枪法 基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金 属（钨或金等）颗粒上，在一种加速装置的作 用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达 到转基因目的
1、从简单的显微注射法向高效率的 转基因体细胞核移植方向发展
从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法
外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子 介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转 基因方法。
转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生
产的主流方法。
2、从外源基因随机插入(或整合)到定 点整合的转变
利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染
（2）脂质体法 （lipofection）
将待转染的DNA溶 液与磷脂混合，后者 在表面活性剂存在下 形成包埋水相DNA 的脂质体结构。当这 种脂质体悬液加入到 细胞培养液中，便会 与受体细胞膜发生融 合，DNA片段随即 进入细胞质或细胞核 内。
质脂体介导的基因转移
据路透社11月8日报道， 日本科学家已经培育 了一种新的基因改良 老鼠，它们不具备感 知危险气味的能力， 因此，对其死对手猫 一点都不觉得害怕， 相反还大胆地在猫身 上爬来爬去，甚至偎 依在猫身边。此研究 发表在7日出版的《自 然》杂志上。
文章的第一作者，东京大学 的Takashi Sakudoh说：“对 蚕的色素传输系统的了解， 使得我们有可能通过基因调 控来控制蚕丝的颜色和色素 比例。” 自然界中，蚕茧的颜色 有白色、黄色、稻草色、橙 红色、粉红色和绿色。丝绸 的颜色来自于桑蚕吃桑树叶 时对自然色素的吸收。
二 、基因转移技术
物理转染法 化学转染法 生物法
1. 物理转染法
（1）电击法（electroporation）其基 本原理是在外加电场的作用下，细胞膜 电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆 性的电穿孔，从而使一定数量的外源 DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内， 并进一步整合到宿主DNA上，达到转基 因目的。
转基因细菌可治癌症
英国医学专家日前将转基因大肠杆菌 与一种抗癌药相结合，成功杀死了实验鼠 体内的癌细胞。科学家将转基因大肠杆菌 注射到实验鼠的肿瘤内，再给实验鼠注射 一种名叫6－MPDR的抗癌药。这种药无 法单独发挥作用，但是一种由转基因大肠 杆菌分泌的酶能将此药物“激活”，形成 一种有效的毒素，将其周围的癌细胞杀死， 而不伤害其它组织器官。
（4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声 波的空化效应导致细胞的通透性增高， 而通过添加超生造影剂能降低空化域值， 增强空化效应，促进外源基因进入细胞， 提高基因的转染效果
2.化学转染法
（1）磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加 入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成 大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的 细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而 实现转基因。
（3）原生质体融合法
含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。 大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部 分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺 在单层培养的哺乳动物细胞上，在 融和剂 （如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转 如细胞内，实现转基因
3.病毒感染法
构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分 DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入 外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩 增鉴定；重组DNA分子通过物理或化学方法转入一 个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重 组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分 泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物 受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体 上，并表达外源基因。
第二节 转基因动物技术
一、动物基因工程载体 二、基因转移技术
一、动物基因工程载体
作为动物基因工程载体必须具备以下几个功能： 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力 为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力
载体可分为: 质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
1、DNA显微注射法制备转基因小鼠
超数排卵
基因技术
2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的 未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性 的细胞。
优点：
可以在体外进行人工培养、长期扩增、冷冻保 存
胚胎干细胞制备转基因动物过程
（1）基因敲除
敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记， 同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞 中进行复制与筛选的载体DNA序列。
（2）基因敲入
基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色 体的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似 于基因敲除结构，但区别在于：或用外源基因替换并 失活靶基因、或在不影响拔基因功能的前提下插入新 的基因、或在染色体上特定位点插入新的外源基因， 从而实现基因转移，并使得外源基因高效表达
世界第一只转基因动物
世界首只转基因灵长类动物 ——-安迪
荧光鱼
转基因兔
转基因兔鼠
据英国媒体4日报道， 英国第四频道电视台将 在一个新的电视节目秀 中披露一个转基因动物 农场中的众多惊人内幕： 在那个农场中，绵羊长 着人心脏、山羊会吐蜘 蛛丝、奶牛尺寸是普通 牛的3倍大，而猪则会 在黑暗中发光！据英国 第四频道电视主任凯 文· 利戈称，他们拍摄 下来的农场中的所有转 基因动物，全都真实存 在，而非科幻电影中的 虚构场景。
胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998)
判断是否是种系嵌合
首先用转基因嵌合体的小鼠与正常的小 鼠交配，对其后代进行检测，如果后代中 有转基因个体出现，证明为种系嵌合，然 后将转基因杂合子个体进行横交就会获得 转基因纯合子和杂合子个体。如果在后代 中没能发现转基因纯合子，应注意是否因 为转基因的纯合造成了胚胎的早期死亡， 无法得到成活个体所致。
转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整
合。
为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有
位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可 以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和 MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么 位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表 达。
AAV具有以下几个方面特点：
非致病性、无免疫原性和无炎症反应 能感染静止期的细胞，如神经元细胞 插入的外源基因表达时间长，可达到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化
（3）反转录病毒
反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主 细胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶， 以单链的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形 双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整 合到宿主的基因组内，此时整和的病毒序列被称为 前病毒。 反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其 DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5`-LTR中的 一个强启动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因 组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白 和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链 和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒 以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。
（3）基因下调（knock-down）
RNA干扰（RNAi）又被称为基因下调，通过 干扰RNA（siRNA）分子的作用达到转录后基 因沉默的效应。 siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和 siRNA表达载体两种。体外合成的siRNA易转 染细胞，进入细胞后，可直接发挥作用，一般 不存在siRNA 表达载体的转录效率低及细胞毒 性等问题。但是体外合成的siRNA 只能瞬间干 扰，不能达到长久抑制病毒的效果。
3、转基因体细胞核移植法生产转基因牛
基因的准备 供体细胞获取 卵母细胞的获得 体外成熟培养
传代培养、扩增
供体细胞的转基因
卵母细胞的去核
转基因供体细胞的筛选与扩增
核移植
获得转基因个体
胚胎移植
重构胚体外培养
步骤一：从一只６岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为Ａ）的乳腺中取出乳腺细胞，将 其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤 二：从一头苏格兰黑面母绵羊（Ｂ）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除 去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；步骤三：利用电脉冲方法， 使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精 过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成 “胚胎细胞”；步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（Ｃ）的子宫内， 胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。
原病毒DNA转 染进包装细胞 中，包装原病 毒产生将病毒 RNA包装成感 染性病毒粒子 的所有蛋白质 ，但却不能包 装自身的RNA
逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因
第三节 转基因动物制备 转基因动物的制备程序 转基因鉴定 表达水平的检测 转基因动物传代与检测
一 转基因动物的制备程序
DNA显微注射法制备转基因小鼠 胚胎干细胞法制备转基因小鼠 转基因体细胞核移植法生产转基因牛
以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例
2. 病毒载体
作为基因转移的病毒载体须具备以下基 本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达 对机体不致病
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： 基因组的重排率低 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个周期 安全性好，不会整合到人的染色体上，不导 致肿瘤的发生 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要 求不高 外源基因在载体上容易高效表达
利用点穿孔法进行基因转移
（2）显微注射法 将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过 玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵 的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转 基因动物。 （3）基因枪法 基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金 属（钨或金等）颗粒上，在一种加速装置的作 用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达 到转基因目的
1、从简单的显微注射法向高效率的 转基因体细胞核移植方向发展
从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法
外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子 介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转 基因方法。
转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生
产的主流方法。
2、从外源基因随机插入(或整合)到定 点整合的转变
利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染
（2）脂质体法 （lipofection）
将待转染的DNA溶 液与磷脂混合，后者 在表面活性剂存在下 形成包埋水相DNA 的脂质体结构。当这 种脂质体悬液加入到 细胞培养液中，便会 与受体细胞膜发生融 合，DNA片段随即 进入细胞质或细胞核 内。
质脂体介导的基因转移
据路透社11月8日报道， 日本科学家已经培育 了一种新的基因改良 老鼠，它们不具备感 知危险气味的能力， 因此，对其死对手猫 一点都不觉得害怕， 相反还大胆地在猫身 上爬来爬去，甚至偎 依在猫身边。此研究 发表在7日出版的《自 然》杂志上。
文章的第一作者，东京大学 的Takashi Sakudoh说：“对 蚕的色素传输系统的了解， 使得我们有可能通过基因调 控来控制蚕丝的颜色和色素 比例。” 自然界中，蚕茧的颜色 有白色、黄色、稻草色、橙 红色、粉红色和绿色。丝绸 的颜色来自于桑蚕吃桑树叶 时对自然色素的吸收。
二 、基因转移技术
物理转染法 化学转染法 生物法
1. 物理转染法
（1）电击法（electroporation）其基 本原理是在外加电场的作用下，细胞膜 电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆 性的电穿孔，从而使一定数量的外源 DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内， 并进一步整合到宿主DNA上，达到转基 因目的。
转基因细菌可治癌症
英国医学专家日前将转基因大肠杆菌 与一种抗癌药相结合，成功杀死了实验鼠 体内的癌细胞。科学家将转基因大肠杆菌 注射到实验鼠的肿瘤内，再给实验鼠注射 一种名叫6－MPDR的抗癌药。这种药无 法单独发挥作用，但是一种由转基因大肠 杆菌分泌的酶能将此药物“激活”，形成 一种有效的毒素，将其周围的癌细胞杀死， 而不伤害其它组织器官。
（4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声 波的空化效应导致细胞的通透性增高， 而通过添加超生造影剂能降低空化域值， 增强空化效应，促进外源基因进入细胞， 提高基因的转染效果
2.化学转染法
（1）磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加 入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成 大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的 细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而 实现转基因。
（3）原生质体融合法
含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。 大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部 分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺 在单层培养的哺乳动物细胞上，在 融和剂 （如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转 如细胞内，实现转基因
3.病毒感染法
构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分 DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入 外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩 增鉴定；重组DNA分子通过物理或化学方法转入一 个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重 组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分 泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物 受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体 上，并表达外源基因。
第二节 转基因动物技术
一、动物基因工程载体 二、基因转移技术
一、动物基因工程载体
作为动物基因工程载体必须具备以下几个功能： 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力 为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力
载体可分为: 质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
1、DNA显微注射法制备转基因小鼠
超数排卵
基因技术
2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的 未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性 的细胞。
优点：
可以在体外进行人工培养、长期扩增、冷冻保 存
胚胎干细胞制备转基因动物过程
（1）基因敲除
敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记， 同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞 中进行复制与筛选的载体DNA序列。
（2）基因敲入
基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色 体的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似 于基因敲除结构，但区别在于：或用外源基因替换并 失活靶基因、或在不影响拔基因功能的前提下插入新 的基因、或在染色体上特定位点插入新的外源基因， 从而实现基因转移，并使得外源基因高效表达
世界第一只转基因动物
世界首只转基因灵长类动物 ——-安迪
荧光鱼
转基因兔
转基因兔鼠
据英国媒体4日报道， 英国第四频道电视台将 在一个新的电视节目秀 中披露一个转基因动物 农场中的众多惊人内幕： 在那个农场中，绵羊长 着人心脏、山羊会吐蜘 蛛丝、奶牛尺寸是普通 牛的3倍大，而猪则会 在黑暗中发光！据英国 第四频道电视主任凯 文· 利戈称，他们拍摄 下来的农场中的所有转 基因动物，全都真实存 在，而非科幻电影中的 虚构场景。