纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。

1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。

研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。

进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。

为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。

1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。

纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。

血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。

主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。

1.2.2 纤溶活性测定按Astrup等[6]方法并改进制备血纤维蛋白平板。

10m L 1%的琼脂糖溶液于50℃时加入10mL 0.3%的纤维蛋白原溶液及100µL凝血酶，快速混合并倒入9cm平板中，静置冷却凝固为乳白色半透明的纤维蛋白平板。

尿激酶标准品配成25.875，51.75，103.5，207.415U•mL-1 5个浓度，各取5µL加在制备好的纤维蛋白平板上，37℃孵育18h，计算水解圈面积，以酶活力的尿激酶单位数的对数为横坐标，水解圈面积的对数为纵坐标做标准曲线。

取样品5µL 3份加在纤维蛋白平板上，37℃孵育18h，求得样品水解圈面积的平均值，从标准曲线上求出样品的酶活力。

1.2.3 酶的纯度鉴定采用不连续蛋白质SDS-PAGE凝胶垂直板电泳法。

浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度12%，考马斯亮蓝R-250染色，7%醋酸脱色。

1.2.4 NKc体外对血凝块的溶解作用家兔心脏采血，体外自然凝固成血凝块，称取质量后放入不同试管中，分别加入NKc、蚓激酶、生理盐水溶液，置3 7℃120 r•min-1振摇孵育，于不同时间测定凝血块质量，计算其溶解率。

1.2.5 NKc体外对血凝的影响家兔心脏采血，取不同剂量的NKc(1414 U•mL-1)，分别加入1mL血液中，轻轻混匀后放置37℃温箱孵育，于不同时间取出观察血液的凝固状态。

1.2.6 溶血作用参照中国药典2000年版[7]进行。

取兔血10mL，放入盛有玻璃珠的锥型瓶中，振摇10min，脱去纤维蛋白原，2500 r•min-1离心10min，得脱纤红细胞沉淀，用生理盐水溶液洗涤3次，至上清不显红色为止。

将所得红细胞沉淀用生理盐水配成2%混悬液。

取试管6支，按规定配比量，见表1，依次加入2%红细胞悬液和生理盐水，混匀后，于37℃恒温箱中放置30min，然后分别加不同量的药液，摇匀后置37℃恒温箱，不同时间观察结果。

2 实验结果2.1 NKc的分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分级盐析、透析获得NKc；粗酶经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱进一步纯化，由洗脱曲线见图1.经葡聚糖凝胶柱层析纯化后，出现Ⅰ、Ⅱ二个蛋白吸收峰，纤溶活性物质主要分布在蛋白峰Ⅱ。

为了获得较纯的NK，层析液分管收集，经纤维蛋白平板法检测，收集纤溶活性较高部分，冷冻干燥，经SDS-PAGE凝胶电泳检，除了较粗的一条带外，还有一些小分子的浅带，见图2，3.表明纳豆提取液经盐析、透析，Sephadex G-10 0柱层析分管测活收集高活性部位后，只获得层析纯的NK，要获得单一组分的NK，还需进一步纯化。

2.2 NKc体外对血凝块的溶解作用血块溶解结果表明，不同剂量的NKc(1，0.5，0.3，0.2mL)作用血块6h时，溶解率分别为88%，74%，33%，32%，对照组蚓激酶为87%，表明NKc有显著的体外溶栓作用，见表2.2.3 对血液凝固的影响1mL血液加入不同体积的NKc后观察血液凝固状态，结果见表3，加入N Kc0.15，0.35，0.5和0.75mL的血液最终凝固；而加入1和2 mL NKc的血液不凝固，并逐渐转变为暗黑色，最终红细胞全部裂解，加入2mL PBS的对照组1mL血液正常凝固。

说明低剂量NKc不影响血液正常凝固，而高剂量的NKc不仅影响血液正常凝固，并且使红细胞溶解。

凝固后的血液（3～7）继续放置37℃恒温培养箱孵育，至2h时，第3，4试管（即1mL血液；加0.75和0.5mL NKc）中的凝血块开始部分溶解，并于4 h后全部溶解，而其他试管的凝血块进一步收缩、固化并析出血清。

表明NK具有强烈的水解纤维蛋白作用，但只有在一定的剂量范围内，既不影响血液的正常凝固，血细胞不被裂解；又能把新形成的凝血块即人工血栓溶解。

2.4 溶血实验溶血实验结果见表4，在2h内，高浓度的NKc对红细胞有溶血作用，低浓度的NKc没有。

取Sephadex G-100色谱图峰Ⅰ和Ⅱ样品各10和5µL，分别滴加在兔血平板上，置37℃孵育24h。

结果见图4，当滴加10µL时，层析峰Ⅰ和Ⅱ都有溶血现象，滴加5µL时，层析峰Ⅰ有溶血，而Ⅱ无溶血现象。

表明NKc有溶血作用，其中层析峰Ⅰ的溶血作用比Ⅱ强。

NK是否具有溶血作用，有待进一步实验。

3 讨论血栓栓塞性病人体内的纤维蛋白原在凝血酶作用下生成纤维蛋白多肽A和纤维蛋白多肽B，两种纤维蛋白多肽转化成纤维蛋白单体（α，ß，γ）2后自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体，不稳定的纤维蛋白多聚体在Ca2+，Ⅶ因子的作用下交联成不稳定的纤维蛋白多聚体，这就是血栓的主要基质。

溶栓疗法通过直接降解或通过激活纤维蛋白溶酶原(plasminogen)转化为纤维蛋白溶解酶(plas min)来降解血栓的主要成分纤维蛋白而达到血栓效果。

血纤维蛋白溶解酶是一类能直接降解血纤维蛋白的酶，体外主要来源于微生物、蚯蚓、蛇毒、某些海洋无脊椎动物和海藻等。

使用外源的、能直接降解纤维蛋白的酶类可加强血浆纤溶活性。

本实验结果表明，NKc体外有很强的溶栓作用，为了排除粗酶中的溶血成分可能来自大豆，笔者利用纳豆杆菌进行了液体发酵，获得了纳豆激酶的液体发酵粗酶，溶血实验表明该粗酶同样具有溶血作用，因此可以判定溶血作用物质不是来自大豆，而是纳豆芽孢杆菌的代谢产物，这一结果与Kunst等[8]的报道相一致。

故纳豆杆菌代谢产物除含有溶栓成分外，还含有溶血作用物质，其性质正在进一步研究之中。

为了进一步明确溶血作用物质，将粗酶经葡聚糖凝胶色谱后，进行血平板溶血实验，结果表明，葡聚糖凝胶色谱蛋白峰Ⅰ和Ⅱ高剂量时不产生溶血作用，蛋白峰Ⅱ低剂量时不产生溶血作用。

由于所纯化的NK还含有少量的其他组分，因此只能判断粗酶具有溶血作用，而NK是否有溶血作用无法断言。

为了获得单一组分的NKc，笔者克隆了NKc的基因并在原核系统中成功表达（文章另发），可以证明NKc有溶血作用，而NK本身无溶血作用。

参考文献[1] Sumi H.A noval fibrinolytic enzyme in the vegetable cheese natto:a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia,19 87,43(20):1110.[2] Fujita M,Hong K,Ito Y,et al.Thrombolytic effect of nattokinase ona chemically induced thrombosis model in rat[J].Biol Pharm Bull,1995,189 100:1387.[3] 段智变，江汉糊，张书霞，等.纳豆激酶粗制液对家兔溶血栓作用及其机制研究[J].营养学报，2003，25(1):46.[4] Fujita M,Hong K,Yae Ito,et al.Transport of nattokinase across the rat intestinal tract[J].Niol Pharm Bull,1995,18(9):1194.[5] 王萍，陈钧，纳豆激酶纤溶酶活性研究[J].江西农业大学学报，2004，2 6(3):431.[6] Astrup T,Mullertz ST.The fibrin plate methob for estimating fibrinol ytic activity[J].Arch Biochem Biophys,1952,40:346.[7] 中国药典2000年版.Ⅰ部[S].2000:P504.[8] Kunst F,Ogasawara N,Moszer I,et al.The complete genome seque nce of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis[J].Nature,1997,390:34 9.。