Rhizopus oryzae产酸性蛋白酶条件及其酶学性质研究
大球盖菇腐败真菌的分离、鉴定及生长特性研究
刘鑫燕，李占峰，彭帮柱. 大球盖菇腐败真菌的分离、鉴定及生长特性研究[J]. 食品工业科技，2024，45（9）：131−139. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060278LIU Xinyan, LI Zhanfeng, PENG Bangzhu. Isolation, Identification and Growth Characteristics of Spoilage Fungi from Stropharia rugosoannulata [J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(9): 131−139. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060278· 生物工程 ·大球盖菇腐败真菌的分离、鉴定及生长特性研究刘鑫燕1，李占峰2，彭帮柱1,*（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430000；2.漯河微康生物科技有限公司，河南漯河 462300）摘 要：目的：为避免微生物生长引起的大球盖菇褐变和腐败，亟待开展大球盖菇腐败菌种类的相关研究，并为探究贮藏保鲜技术提供理论依据。
方法：对大球盖菇的腐败菌进行分离、纯化，通过致腐性分析筛选出优势腐败菌并对其进行形态学鉴定、分子生物学鉴定及生长特性研究。
结果：分离得到镰刀菌属16株、曲霉属14株，根霉属4株。
通过致腐性分析筛选出四种致腐性强的腐败菌，经形态学和分子生物学手段鉴定其分别为假嗜花镰刀菌（Fusarium pseudoanthophilum ）、黑曲霉（Aspergillus niger ）、单孢根霉菌（Rhizopus azygosporus ）和产紫蓝状菌（Talaromyces purpureogenus ）。
酸性蛋白酶高产菌株选育及酶学性质的研究
酸性蛋白酶高产菌株选育及酶学性质的研究张秀江;胡虹;范国歌;郜峰;谷立峰【摘要】The mutant strain Y06 capable of producing high-yield acid protease was obtained through ultraviolet light and nitrosoguanidine mutation of Aspergillus niger. The protease activity of strain Y06 was 36 134 U/g, which increased 46 times compared with wild-type strain of 768 U/g. The optimal pH value .temperature .water content , adding amount of nutrients and fermentation time of cultivation were detected for high yield of producing high-yield acid protease. The acid protease activity and stability in various conditions were also determined. This study provides important experiment basis of the production and use of acid protease.%采用紫外线和亚硝基胍联合诱变,得到酸性蛋白酶高产的黑曲霉菌株Y06,提高了其产酸性蛋白酶能力.结果表明,诱变后菌株的酶活由768 U/g提高到36 134 U/g,相对于出发菌株提高了46倍.为优化高产酸性蛋白酶的固体培养条件,检测了培养菌株最适pH值、温度、含水量、营养物质添加量及发酵时间等,并对所产酸性蛋白酶在各种条件下的酶活力和稳定性进行测定,为生产和利用酸性蛋白酶提供重要的实验基础.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2012(030)003【总页数】6页(P327-332)【关键词】酸性蛋白酶;黑曲霉;菌株选育;紫外线;亚硝基胍【作者】张秀江;胡虹;范国歌;郜峰;谷立峰【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州450008;河南心连心化肥有限公司,河南新乡453731;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008【正文语种】中文【中图分类】Q939.96酸性蛋白酶是一种能在酸性（pH值2～5）条件下将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类.它具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于酿造、食品、医药、皮革工艺以及胶原纤维工业中[1-4].酸性蛋白酶的来源主要通过微生物发酵，产酸性蛋白酶的微生物菌种有很多，如米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌等[5-7].在微生物发酵工业中，菌种性能对产量起决定作用.由于我国蛋白质饲料资源严重缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低.随着集约化畜禽生产的发展，提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，显得尤为重要.因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视[8-9].本实验以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）联合诱变，筛选出酸性蛋白酶高产菌株——黑曲霉（Aspergillus niger-Y06），该菌株产酶能力得到显著提高，进一步节约了成本，推进酸性蛋白酶工业的发展.另外，发酵生产酸性蛋白酶采用固体发酵法的浅盘式发酵和厚层通风式发酵相结合的生产工艺，通过对黑曲霉产酸性蛋白酶生产工艺生产条件的试验研究，确定了酸性蛋白酶发酵生产的技术工艺，并对相关的技术参数进行了优化.1.1 试验材料1.1.1 出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger）由中国工业微生物菌种保藏中心保藏的原始菌种，CICC编号：3.430 9.1.1.2 分离及斜面培养基斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，加热溶解，自然pH，分装后121℃灭菌20 min），分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白.2.1 菌种的分离和纯化采用常规稀释分离法.2.2 发酵培养方法按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1 L三角瓶中，在0.1 MPa压力条件下灭菌30 min后，冷却接种，接种量为0.3%，于不同条件下发酵84 h，干燥后，进行酶活力的测定.2.3 紫外线诱变处理取0.1 mL稀释的孢子悬液涂布初筛平板，30℃培养4 h，紫外灯预热30 min后，将平皿置于距15 W紫外灯 30 cm 处分别照射 0 s（对照）、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min，每个处理各做 2组.随后在暗光条件下，用5 mL无菌生理盐水对平皿上的菌进行洗脱，适当稀释后，涂布于分离培养基，以黑布包裹30℃下避光培养3～4 d，根据长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种，编号并保存，同时根据平皿菌落数计算致死率，从而求得成活率. 式中：A为对照组平皿上的菌落数；B为诱变处理后平皿上的菌落数.2.4 亚硝基胍诱变处理取3 mL稀释的孢子悬液，加入等体积的亚硝基胍溶液，充分混合，于30℃振荡处理1 h（做2组），取出稀释涂分离培养基，30℃培养5 d，挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验，并编号保存.挑取一接种环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50 g培养基的500 mL三角瓶中，培养温度为30℃，培养时间5 d，测定酶活.2.5 酶活测定1 g酶粉在40℃，pH值为3.0反应条件下，1 min内水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位（U/g）.3.1 菌株选育结果3.1.1 紫外线诱变紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是TT），影响DNA正常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量[10].为了改良生产菌，本试验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿.紫外照射孢子成活率结果如表1所示.为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株，经紫外线诱变处理后，得到100余株突变株.这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定，获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示.其中z－10的酶活最高为9284 U/g（干基），比出发菌株（CK）提高了11.1倍.3.1.2 亚硝基胍诱变选择经紫外线诱变产酶最高的z－10菌株用亚硝基胍进行进一步诱变处理，由酪蛋白平板初筛得到菌株36株，经摇瓶复筛得到菌株10株，此10株再经三角瓶固体发酵复筛.酶活力超过2.5万U/g（干基）的菌株有4株，基中Y06株产酶，其最高酶活力为36 134 U/g，相对于出发菌株（CK）提高了46倍.经亚硝基胍诱变，选择酶活最高的菌株进行酸性蛋白酶生产性试验，结果如表3所示.3.2 影响酸性蛋白酶菌株（Aspergillus niger－Y06）产酶因子的研究3.2.1 固体培养条件对酸性蛋白酶菌株产酶的影响1）温度温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行.为寻求合适的发酵温度，本研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为68%、pH值为6.5的条件下培养84 h，分别在27℃、30℃、33℃、36℃和39℃不同温度下进行发酵培养，并测定酶活力，图1证明了酸性蛋白酶菌株产酶最适温度发酵为33℃，结果见图1. 2）水分含量对于固态发酵来说，控制培养基的水分是固态发酵过程中的重要环节之一.适宜的含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖.过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使基质膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长.含水量过高过低都对黑曲霉生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活性.本研究将黑曲霉分别接种到初始pH值为6.5，含水量分别为60%、64%、68%、72%、76%和80%的固态发酵培养基上，在33℃下进行发酵培养试验，图2结果表明含水量68%时酸性蛋白酶高产菌株产酶达最高值.3）pH值为了研究发酵培养基的pH值对酸性蛋白酶菌株产酶活性的影响，根据固体培养基难以调节pH特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整.本研究在培养基初始含水量为68%，温度为33℃条件下发酵84 h，观察发酵培养基pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5，结果见图3.4）玉米粉添加量本研究按不同比例将玉米粉添加到基础培养基（由麸皮、豆粕和玉米淀粉组成）中，以补充碳源，于30℃、初始pH值为6.5和含水量为68%条件下发酵，观察添加玉米粉对酸性蛋白酶活性的影响，由图1可知，当添加玉米粉质量分数为2%时，酸性蛋白酶菌株产酶最大时，随着玉米淀粉添加量的增加，基质易结团而影响氧的传递，酸性蛋白酶活力急剧下降.5）豆粕添加量为了使菌株生长更好，并对菌株产酶进行诱导，本研究在培养基中添加豆粕粉作为补充氮源，于33℃、初始pH为6.5和含水量为68%条件下发酵，考察其对酶活产生的影响，从图2可以看出，在培养基中添加不同比例的豆粕粉，对酶活的产生都有促进作用，随着豆粕粉含量的增加，产品的酶活力有上升的趋势，在质量分数的9%时酶活力达到最高.6）不同浓度铵盐铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势，另外，氯化铵的浓度对产酶基本没影响，碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用.7）不同磷酸盐磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要，在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果.本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验.通过改变无机磷的种类和含量，在33℃、初始pH值为6.5和含水量为68%条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7.添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加质量分数的0.2%的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大.3.2.2 酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线固体发酵采用基础培养基、含水量68%、初始pH值为6.5、添加质量分数的0.2%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33℃进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8所示.由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，0～24 h发酵产酶速度较缓；24～60 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72 h后，进程曲线趋于平缓，84 h酶活力最高，其酸性蛋白酶活力（干基）达到36 500 U/g，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72 h.3.3 酸性蛋白酶酶活力稳定性研究黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH较低，与畜禽体内消化系统基本一致，用于饲料添加剂中，可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足，提高蛋白质消化率，降低畜禽代谢性腹泻的发生.酸性蛋白酶作为饲料添加剂，它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响，而且还受饲料中部分金属离子的影响，而这些过程中酶活极易受损，从而影响其作为饲料添加剂的效果.本项研究对黑曲霉菌株所产酸性蛋白酶在不同条件下的稳定性进行了研究.3.3.1 pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响酸性蛋白酶在一定pH范围内酶活力比较稳定（如图9）.当反应环境pH为3.5，酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%，在pH为4.0时，相对酶活力最高达90%，可以确定酸性蛋白酶最适反应pH值为4.0.pH值过高或过低明显影响酶活力，在pH为5.0时，相对酶活力只有65%，在pH为2.5时，相对酶活力也只有70%.3.3.2 温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）.一方面是当温度升高时，酸性蛋白酶反应速率加快，另一方面由于随着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性，引起酶反应速率下降.酸性蛋白酶适宜的反应温度为35～40℃，在40℃相对酶活力表现出最高，在低于30℃或者高于45℃时，相对酶活力明显下降.因此认为40℃是酸性蛋白酶最适宜的温度.酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质，一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活，随着温度的升高变性的时间越快，酶失活也就越迅速.如图11所示，酸性蛋白酶在70℃时，随着时间的延长酶活力开始下降.固体酶在烘箱中70℃保温至5 min保留有90%的相对酶活力，当时间延长至10 min时，剩余酶活有80%，30 min时，剩余酶活仍有19.8%.3.3.3 不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响金属离子对酸性蛋白酶活力影响较大，金属离子对酸性蛋白酶的调节作用是相对的，一种金属离子对其具有激活作用，而另一种则可能呈现抑制作用.离子浓度对酶活性也有着不同的影响，往往是低浓度起激活作用，而高浓度起抑制作用.图12表明，在5.0 mmol/L的浓度下，Mn2+和Cu2+对黑曲霉所产酸性蛋白酶有强烈的激活作用，分别达到对照酶活力的150%和120%，Fe3+对该酶表现出明显的抑制作用，处理后的酶活力为对照的58%，而Fe2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+和Mg2+对酸性蛋白酶有一定的抑制作用.采用紫外线和亚硝基胍联合诱变筛选得到一株稳定、高产酸性蛋白酶的变异菌株Y06，结果表明，诱变后菌株的酶活由768 U/g提高到了36 134 U/g，相对于出发菌株提高了46倍.在研究酶的粗酶酶学性质中发现，该酸性蛋白酶的最适作用pH值为6.5，最适作用温度为33℃，最适含水量为68%，玉米粉最适添加量为2%，豆粕粉最适添加量在9%，发酵最适时间为72 h.菌株产酶稳定性试验结果表明该菌株产酶能力较稳定.【相关文献】［1］刘鑫，李佳，刘克武，等.黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应［J］.化学研究与应用，2004，16（4）：482－484.［2］张学峰，刘达玉，夏兵兵，等.酒用酸性蛋白酶在甜酒酿生产中的应用［J］.中国酿造，2009（3）：122－124.［3］俞从正，董新宽，王全杰，等.酸性蛋白酶537处理绵羊蓝湿革对皮革延伸性能影响的研究［J］.中国皮革，2006，35（9）：16－20.［4］王祥观，张爱琴，于丽萍，等.酸性蛋白酶在酱油酿造中的应用研究［J］.生物技术，1993，3（4）：26－29.［5］卢燕云，林建国，李明，等.复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株［J］.中国酿造，2009（1）：49－51.［6］罗跃中，李忠英，温拥军.黑曲霉固体发酵产酸性蛋白酶条件优化［J］.湖北农业科学，2010，49（1）：59－62.［7］沈玉洁，张明春，向苇，等.高产酸性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究［J］.食品与发酵科技，2010，46（6）：32－35.［8］唐宝英，曹建民.酸性蛋白酶高产菌株的选育［J］.食品与发酵工业，1998，24（3）：16-19.［9］刘然，张淑芬.动物蛋白酶化技术［J］.饲料研究，1991（6）：7-9.［10］周德庆.微生物学教程［M］.北京：高等教育出版社，2002：212－217.。
泸型大曲黑曲霉产酸性蛋白酶条件的优化及其酶学性质的研究
ａ ｉ ｒ ｔａ ｅ ｒ ａ ｈ ｄ ｔ ４ ５ Ｕ ｇ ．ｗｈ ｃ ｓ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｂ ．％ ａ ｅ ｐ ｉ ｚ ｄ Ｔ ｅ ｅ ｚ ｍａ ｉ ｐ ｏ ｅ ｉ ｓ ｗａ ｌｏ ｃ ｄ ｐ ｏｅ ｓ ｅ ｃ ｅ ｏ ２ ３ ０ ／ ｉ ｈ ｗａ ｎ ｒ ａ ｅ ｙ ６ ６ ４ ｔ ｆ ｒｏ ｔ ｍｉｅ ． ｈ ｎ ｙ ｔ ｒｐ ｒ ｅ ｓ ａ ｓ ｃ ｔ ｓ ｄ ｅ ．ｈ ｎ ｙ ｃｅ ｐ ｉ ｌ ｔ ５ ， Ｈ３ ５， ｎ ｓｓａ ｌ ｅｏ ０ ． ， ， ａ Ｆ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｔ ｅ ａ ｔ ｉ ｏ ｔ ｉ ｄＴ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｔ ｄ ｏ ｔ ｕ ｍａｌ ａ ％ ｐ ． ａ ｄ ｗａ ｔ ｂ ｅ ｂ ｌｗ ５ ％ Ｃｕ Ｋ Ｃ ， ｅ ｎ ｒ ａ ｅ ｈ ｃ ｉ ｔ ｔ ｙ ５ ｖｙ ｓ ｍｅ ｅ ｔｎ ｈ ｎ ｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ ｉ ２ ｏ ｘｅ ｔｗ ｅ ｏ ｃ ｎ ｒ ｉ ｓ ｍｍｏ ／Ｌ， ｉ ｈ ｃ ｉｉ ｆ ａ ｉ ｒ ｔａ ｅ ｗａ ｅ ｒ ａ ｅ ｆ ｒ ａ ｄ ｎ ｅ ， ｅ ， ａｏ Ｌ ｗｈｌ ｔ ｅ ａ ｔ ｔ ｏ ｃｄ ｐ ｏｅ ｓ ｓ ｄ ｃ ｅ ｓ ｄ ａ ｔ ｄ ｉ ｇ Ｆ “ Ｆ “ ｅ ｖｙ ｅ
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黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育
１３ 培养条件 ．
将孢子菌悬液按体积分数 ０ １ ．０的接种量 ， 接种到发酵培养基中，Ｏ℃转速为 １０ｒｍｎ ３ ５ ｉ 的条件下 ／ 培养 ７ｄ 离心收集上清液 ， ， 既为粗酶液 。
基金项 目： 秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（ 项目编号： １０Ａ ７ ） ２ １１ １６ 。 ０
中图分类号 ： ９ ３ Ｑ ３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：６２７ ８ （ ０ ２ ０ －０２０ １７ － ３ ２ １ ） １ ７ － ９ ０ ５
黑曲霉产酶发酵的历史十分悠久 ， 可用于生产淀粉酶 、 眭蛋 白酶、 酸 纤维素酶、 果胶酶 、 柠檬酸、 没食 子酸等多种酶制剂和食用酸， 是公认的可用于食品生产的高安全 性真菌 【 。此外 ， 曲霉在生物工程 ｌ 】 黑
，
要作用 。目前 ， Ｊ 已采用基 因重组技术从 大肠杆菌 中提取该 酶 ， 由于大肠杆菌表达水平低、 但 提取 困 难， 使其实际应用受到限制 。而黑 曲霉 的 ｐ葡萄糖苷酶基 因表达水平较高 ， 一 利用黑 曲霉作为其生产
菌株有突出优势。研究表 明， 黑曲霉产生的胞外蛋白酶能降解外源基因所表 达的蛋 白， 使表达产物不能 积 累。为使黑曲霉表达异源 ｐ葡萄糖苷酶的效果更好 ， － 必须在不改变蛋 白质外泌能力 的前提下 ， 使其 胞外蛋 白酶活性缺失 【 。本实验 旨在通过紫外诱变方法筛选酸性蛋白酶缺失 ， Ｂ葡萄糖苷酶活性基 ８ Ｊ 而 －
收稿 日期 ： ０ ２Ｏ －９ ２ １－２０
１ 期
刘 畅等
黑 曲霉 的紫外诱 变及酸性蛋 白酶缺陷株 的选育
１ ４ 紫外 诱变 条 件 的筛 选 ．
黑 曲霉经固体斜面培养后 ， 用无菌水洗下新鲜孢子 ， 制成孢子悬浮液 ， 用灭菌吸管吸取 １ Ｌ 孢子 ０ｍ （ 数量为 １ １ｍ Ｌ 于培养皿中， １ 紫外灯下照射 ， Ｏ ～ Ｏ 个／ ） 于 ５ｗ 停止照射后涂布平板 ， 用锡箔纸包裹平板 ， 完全避光 ２ ， ４ｈ 后拆开锡箔纸再培养 ４ ， ８ｈ 计算致死率 。通过改变紫外照射时间、 Ｊ 照射距离和孢子悬 液的浓度 ， 选择最适 的诱变条件 。 １ ５ 酸 性 蛋 白酶缺 陷菌 株 的筛选 ． １５ １ 平板初筛 将诱变后 的黑 曲霉孢子涂布于酪蛋 白平板和 ｐ葡萄糖苷酶筛选平板 ， ．． － ３ Ｏ℃培养 ４ ８
酸性蛋白酶生产菌种的选育及培养基的优化
酿酒科技
2007 年第 10 期 ( 总第 160 期 ) LIQUOR- MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2007 No.10(Tol.160)
酸性蛋白酶生产菌种的选育及培养基的优化
吴重德 2 , 杨 珊 2, 刘孟华 2, 周荣清
1, 2
,石
碧
1, 2
(1. 四川 大学 皮革 化学 与工 程教 育部 重点实 验室 , 四 川 成都 610065; 2. 四川 大学 轻纺 与食 品学 院, 四 川 成都 610065 )
Sigma 公 司; 其 他试 剂为 国产 分析 纯。 1.5
主要 设备 及仪 器 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 : 美 国 Lambda 25; 电 热 恒 温 培 养箱 : 上 海一 恒 DHP- 9082 型 ; 全 温空 气振 荡 器: 福玛
2.2 2.2.1
发酵 培养 基成 分的 优化 碳源 对产 酶的 影响 表 2 是 在 1.2 所述 的发 酵培 养 基中 以 6 % 玉米 淀粉
吴重德 , 杨
珊 , 刘孟华 , 周荣清 , 石
碧 酸性蛋白酶生产菌种的选育及培养基的优化
23
氯 化钙 0.5 % 。
1.3
培养 条件 用 500 mL 三 角 瓶 装 50 mL 培养 基 , 于 121 ℃ 灭 菌
20 min , 冷 却 至 35 ℃ 左 右 , 从 培 养 6 d 的 斜 面种 子 接 种 2 环 , 置于 恒 温振 荡培 养 器中 在 30± 1 ℃、 180 r/min 的 条 件 下培养 72 h , 过 滤得 到粗 酶液 , 检测 其酶 活力 大小 。 1.4
株 经诱 变涂 平板 后 , 依照 其 菌落 形态 、 菌 落大 小 、 孢 子颜 色 和 孢 子 丰 满 程 度 从 400 多 株 突 变 株 中 挑 取 单 菌 落
酸性蛋白酶产生菌的筛选及其部分性质研究
种子 培 养 液 ： １ ９ ／ ５ 蛋 白胨 ， ０ ． ３ 牛 肉膏 ， ０ ． ５
Ｎａ Ｃ１ ．
及 水产 加工 等多个 行业 ， 对 国民经济 的发 展起着 重 要 的作用 ［ １ ］ ． 酸性 蛋 白酶 在 白酒 大 曲 中的含量 较 高 ， 一般 在
ｐ Ｈ值为 ２ ． ０ ～５ ． ０的 酸 性 条 件 下 活 力 最 强 ］ 萄糖 ， ０ ． ６
Ｎａ ２ ＨＰ Ｏ ・２ Ｈ２ Ｏ， ０ ． ２ 酵母提取物 ， ０ ． １ ＫＣ １ ，
０ ．０ １ Ｍ ｇＳ Ｏ４・７ Ｈ２ Ｏ．
酸性 蛋 白酶属 于水 解酶 类 ， 能够在 酸性 条件 下 将 蛋 白质 水解 成 多肽类 物质 和 游离 的氨基 酸． 酸 性 蛋 白酶是 最 重要 的工业 用酶 之一 ， 其应 用 已经深 入 到食 品 、 酿造、 医药 、 纺织、 皮革、 日用 化 工 、 饲 料 以
０ ． ０ ５ Ｋ２ ＨＰ Ｏ ， ０ ． ０ ５ ＫＨ２ Ｐ Ｏ ４ ， １ 酪蛋 白， ２
酸性蛋白酶与固体曲的制备窖泥培养及其白酒中散发的醇香味有着密切的联系在发酵白酒的过程中高级醇实际上主要是从酸性蛋白酶所分解产生的氨基酸得来的
第 ３ Ｏ卷 第 ２期
Ｖｏ １ ． ３ Ｏ Ｎ ｏ． ２
周 口师范 学院 学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
生化 性 质 进 行 了研 究． 结果表明 ： 筛选 得 到 的 菌株 Ｄ Ｂ Ｍ２初 步 鉴 定 为 芽孢 杆 菌 ， 其 最适 温度 为 ３ ０口 ｃ， 最适 ｐ Ｈ
值为５ ， 为 酸性 蛋 白 酶 产 生 菌 ． 关键词 ： 酸 性 蛋 白酶 ； 菌株 ； 性 质 中图 分 类 号 ：Ｔ Ｓ ２ ０ ２ ． ３ 文 献标 志 码 ：Ａ 文章编号 ： ｌ ６ ７ １ — ９ ４ ７ ６ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２— ０ ０ ７ ０ — ０ ３
黑曲霉酸性蛋白酶酶学性质的研究
关键 词：黑曲霉 ；酸性蛋 白酶 ；酶学性质 中图分类号 ：Ｑ ５ ＋：Ｑ ４ ． ７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０ — ０ ４ ２０ ） ３ ０ ０ — ４ ５６９ ９ ９ ２ ， ３ ０ １ ０ ８ （０ ６ ０ — ０ ５ ０
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相应 的酶液稀释适当的倍数。以每克鲜 曲所含的酶
活力表示酶活（ ｇ ） Ｉ 。 Ｕ・
１ ． 酸性蛋 白酶 酶 学性质 的研 究 ．４ ２
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酸性蛋白酶最适反应 ｐ 用 ０１ ｏ・ Ｈ： ．ｍ ｌ 『乳酸和 Ｌ ０ ｏ・ 乳酸钠缓 冲溶液配制 ｐ ． ｍ ｔＬ ２ Ｈ值分别为２ ， ． ０ ２ ，３ ，３ ，４ ，４ ． ． ． ． ． １ ％的酪蛋 白溶液，以 ５ ０ ５ ０ ５的 ． ０ 此为底物测定酶活力。 酸性蛋白酶最适反应温度 ：通过恒温水浴锅将 反应 温度分别调 到 ３ ，３ ，４ ，４ ，５ ，５ Ｉ ０ ５ ０ ５ ０ ５ｃ ， Ｃ 以ｐ ． 的 １ ％ Ｈ３ ０ ＋ 酪蛋白溶液为底物测定酶活力。 ０ 酸性蛋 白酶热稳定性 ：将抽提初 酶液在 ８ ０ｃ Ｉ Ｃ 的恒 温水浴 中保温 １ ，３ ，１ ｉ；固态 酶 ，２ ，５ ０ｍｎ 曲在８ 烘箱 中保温 ５ ０ ０ ０ ０ｓ ０ｃ Ｃ Ｉ ，１ ，２ ，３ ，６ ，迅速 取 出后立即放入冰水中 ， 再按常规方法适 当稀释测
１ ． 菌株 的分 离纯化 ．１ ２
采用常规稀释分离法 。
１ ． 酸性蛋 白酶酶 活测定 ．２ ２
质研究还比较少 ，作为饲料添加剂 ，它不仅要经受 饲料加工过程中的高温处理 、动物 胃肠道 胃酸的影
响，而且还要受饲料中的部分金属离子的影响，而 这些过程中酶活极易受损 ，从而影响其作为饲料添 加剂的效果 。鉴于此 ，本文对黑曲霉Ａ Ｓ 产酸性 Ｎ。
黑曲霉发酵产酸性蛋白酶
黑曲霉发酵产酸性蛋白酶江西科技师范学院生物工程专业《化工原理课程设计》说明书题目名称黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶专业班级 09级生物工程1班学号 20091466 20091479 20091470学生姓名钟鑫鑫张溧王涛指导教师常军博士2011 年10 月31 日前言蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。
在酸性环境下（pH 2.5-5.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。
该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒酱油造、饲料等。
其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以可澄清发酵醪液和成熟醪液。
酶作为一种新兴的物质以其高效，清洁的催化效果充斥着当今人类的思想，但是较高的技术要求和特殊菌株获得，使人们在酶这一产业发展中步履蹒跚，特别是发展中国家由于落后的科学技术，使他们在此项技术中发展更加困难，以中国为例在20世纪90年代就已经有酶企业投入生产，但是我的酶制剂销售额在世界市场只占4%，我国企业所用的酶制剂大多数是由丹麦的NOVO所提供的。
就目前情况看，世界各国都投入了大量资金用于酶事业的研究和生产。
相信在不久的将来酶一定会更加广泛的在生活中应用。
设计条件题目:1000L发酵罐，发酵生产酸性蛋白酶。
1发酵工艺1.1菌种的选择本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为3．350。
1.3菌种培养基的配制查氏培养基NaNO3 2gK2HPO41gK Cl 0.5gMgSO4 0.5gFeSO40.01g蔗糖30g琼脂15g水1000mLpH 自然121℃灭菌20min1.2发酵罐培养基的配制一般产酸性蛋白酶的微生物，它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源，按各种不同比例混合，添加无机盐配成各种培养基。
浅谈几种常见酶制剂的研究及其应用
浅谈几种常见酶制剂的研究及其应用酶是具有催化活性的蛋白质，它具有高效性、专一性、无毒副作用、不产生残留等特点。
酶广泛的存在于动物、植物以及微生物体内，是生物体维持正常的生理生化功能必不可少的成分。
家禽、家畜对饲料中营养物质的利用也是在消化道中各种酶的作用下将各种大分子的物质降解为易被吸收利用的小分子物质的。
酶制剂通常可粗略分成2大类：一类是内源性酶，与消化道分泌的消化酶相似，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，直接消化水解饲料中的营养成分；另一类是外源性酶，它是消化道不能分泌的酶，如纤维素酶、果胶酶、半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、戊聚糖酶（阿拉伯木聚糖酶）和植酸酶。
外源性酶不能直接消化水解大分子营养物质，而是水解饲料中的抗营养因子，间接促进营养物质的消化利用。
大量的试验研究表明，酶制剂主要参与机体内的以下活动：①参与细胞的降解，使酶与底物充分接触，促进营养成分的消化；②去除抗营养因子，改善消化机能；③补充(或激活)内源酶的不足，改进动物自身肠道酶的作用效果；④参与动物内分泌调节，影响血液中某些成分的变化；⑤水解非淀粉多糖（NSP），降解消化道内容物的黏度；⑥改变消化道内菌群的分布；⑦加强动物保健；⑧减少环境污染。
几种常见酶制剂的作用见表1。
1 蛋白酶蛋白酶是工业酶制剂中最重要的一类酶，约占全世界酶销售量的60％。
根据其作用机制和作用最适pH值，蛋白酶可分为酸性蛋白酶（pH值为2.5~3）、中性蛋白酶(pH值在7左右)、碱性蛋白酶(pH值在8左右)。
酸性蛋白酶用途十分广泛。
食品工业上用于啤酒、白葡萄酒的澄清和酱油的酿造；制革工业用于脱毛和皮革软化；医药工业用作消炎和助消化剂；饲料工业中多采用酸性和中性蛋白酶，以提高动物对蛋白质的水解效率，促进动物对饲料蛋白质的吸收效率。
1.1 酸性蛋白酶酸性蛋白酶分子量在35 000道尔顿左右。
酶分子活性中心有2个天冬酰氨残基，在已经进行过氨基酸序列分析的酸性蛋白酶分子中约有30％的区域是同系的。
产蛋白酶芽孢杆菌的筛选、耐酸性驯化及蛋白酶酶学性质分析
产蛋白酶芽孢杆菌的筛选、耐酸性驯化及蛋白酶酶学性质分析张璋;赵腾飞;李红霞;宋露露
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2024(43)1
【摘要】该研究利用透明圈法及蛋白酶活力测定从高温大曲中筛选高产蛋白酶的菌株,通过形态学观察和分子生物学技术对其进行菌种鉴定。
进一步对筛选菌株的耐酸性进行驯化,并对其耐受性及所产蛋白酶酶学性质进行研究。
结果表明,分离筛选到一株高产蛋白酶活力的菌株Cy3,经鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),其在最适生长pH 6条件下所产蛋白酶活性为505.0 U/m L。
通过对菌株Cy3进行耐酸性驯化后,得到菌株Cy3-驯,成功将其生长p H驯化至5,培养15 h时OD600 nm值提高2.54倍。
菌株Cy3-驯所产蛋白酶的最适反应温度从60℃提高至70℃,最适反应p H值为6,但活性及稳定性略有下降。
菌株Cy3-驯具有较好的NaCl和葡萄糖耐受性,最高耐受含量分别为15%和60%,同时在乙醇体积分数8%以及乳酸体积分数3%时仍能生长。
【总页数】7页(P84-90)
【作者】张璋;赵腾飞;李红霞;宋露露
【作者单位】茅台学院酿酒工程系
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.1
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摘要：本文以少孢根霉 （ ｈｚ ｕ ｏｉｏ ｏｕ ）为对照研究了豆豉 中的一个分 离菌株 米根霉 （ ｈ ｏｕ ｏｙａ ） Ｒ ｉｐ ｓ ｌ ｓ ｒｓ ｏ ｇｐ Ｒ ｉ ｐ ｓ ｒｚｅ 产生酸 ｝ 白酶 ｚ 生 蛋 的条件及所产蛋 白酶的性质 ， 结果表明这个茵株 的产酶条件和蛋 白酶的性质与少孢根霉相比有相似性但也存在一些差异：米根霉在水
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附近有最强的催化活性 ， ｐ ．－ ． 在 Ｈ３ ６０的范围内有较好的稳定性， ０ 催化反应 的最适作用温度为 ５ Ｏ℃，它的温度稳定性很差，在 ５ Ｏ℃
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保 温 １０ ｉ 几乎 完全 失 活 。 ２ ｒ ｎ酶 ａ
关键词 ：米根霉；少孢根霉；酸Ｊ 胜蛋白酶；酶学性质 文章编号：１７．０ ８２ １１－８６ ６ ３９７ （０ １ ． ｏ ２
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