BD多色流式全面解决方案课件
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BD流式细胞仪操作说明
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3. 仪器面板：
m 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 o 流速控制：
.c LO： 样品流速：12 μl /min
MED：样品流速：35 μl /min
雷射光源。） 7. 倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。 8. 将减压阀放在「VENT 漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。 9. 退出软件“File”Æ“Quit”(如有对话选项，选择“Don‘t save”)。确认退出
计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。 10. 关闭计算机。“Spheral Blood Mononuclear Cell Procedure
w • Leukemia and Lymphoma Procedure 1 w • Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay
秀 • 间接免疫荧光染色
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三、上机分析流程
建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。 （1）Negative Control（不加任何抗体）。 （2）CD3-FITC（FL1 单染）。 （3）CD19-PE（FL2 单染）。 （4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。
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1.2 Macintosh 计算机与打印机：
BD流式细胞仪技术参数
一、产品介绍
BDFACSCalibur流式细胞仪
ACSCalibur是世界上第一台双激光、四色台式流式细胞仪，可同时应用于细胞分析和分选。
从FACSCalibur诞生至今，经过多次改进和升级，已经广泛应用于各个临床和科研用户，由于其稳定全面的性能，FACSCalibur已经成为全球销售量最大的流式细胞仪。
二仪器配置
主机
进样器
工作站
1)性能指标：标准激光器：15mw,488nm,气冷氩离子激光。
用于3色荧光分析。
第二激光器：636nm,红色二极管激光，用于第四色色荧光分析。
2)测定参数：FSC,SSC,FL1,FL2,FL3,FL4
3)光电倍增管：光谱检测范围300nm-1100nm,电压150v-990v
4)最小检测颗粒大小：0.2um-50um
5)荧光检测灵敏度：<750MESF
6)检测分辨率：全峰高CV<2%
7)样品获取速度：10000个/秒。
四、相关二手产品图片
五、二手产品信息
商品名称：BDFACSCalibur流式细胞仪仪器种类：生化仪器价格：32万
年限：1年内
仪器状态：无故障正常运行
仪器发布：仪器无忧网&司马缸APP
仪器来源：企业。
BD流式细胞仪
BD流式细胞仪⽬录简介流式细胞仪 (3)流式细胞仪的临床检验项⽬淋巴细胞亚群分析 (4)肿瘤细胞DNA检测分析 (5)⽩⾎病及淋巴瘤免疫分型 (6)残余⽩⾎病检测 (6)⽹织红细胞计数 (7)造⾎⼲细胞计数 (7)⾎⼩板疾病及活化⾎⼩板检测 (8)HLA-B27检测 (8)器官移植的配型及免疫状态监控 (9)AIDS诊断及治疗监控 (9)流式细胞仪的临床/医学研究 (10)流式细胞技术的发展及国内现况 (10)建议流式细胞仪之机型----BD公司FACSCalibur仪器主要特点 (11)配套设施（计算机、软件、试剂、样本制备仪、售后服务） (12)仪器主要技术参数 (15)BD公司全球及中国业务介绍BD公司流式细胞仪培训计划BD公司推荐配置单BD公司仪器与其他⼚家仪器⽐较表⼀、简介流式细胞仪（⼀）流式细胞仪概念流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是⼀种对处在液流中的细胞或其它⽣物微粒（如细菌）逐个进⾏多参数的快速定量分析和分选的技术。
简⾔之，流式细胞仪是测量染⾊细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如⼤⼩、内部结构、DNA、RNA、蛋⽩质、抗原等进⾏快速测量并可分类收集的⾼技术，FCM以其快速、灵活、⼤量、灵敏和定量的特⾊，⼴泛应⽤于基础研究和临床实践各个⽅⾯，包括细胞⽣物学、肿瘤学、⾎液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作⽤。
（⼆）原理待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列⾼速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。
当液柱通过检测区，在⼊射的激光束照射下产⽣前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞⼤⼩和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。
经⼀种或⼏种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产⽣的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进⾏分析，得到细胞相应的各种特性。
多色流式细胞术-荧光素和脱机补偿(ppt课件)
PE-Cy5.5标记抗体
开创荧光标记的新纪元
发射波长范围广:由近紫外-可见-近红外 适于多色分析和制成Tandem荧光染料 毫无例外地得到最好, 最亮的标记物
Alexa Fluor标记抗体特性
多色流式细胞术的必要性
CD4/CD8绝对计数 白血病/淋巴瘤免疫分型 微小残留白血病 祖细胞分析 树突状细胞分析 Naive/Memory T细胞亚群 细胞凋亡分析 增殖/活化分析 细胞周期分析
其它临床/科研应用
多色流式细胞术的必要性
BLOOD, 2000; 96(8): 2691-6
亮度(Brightness)
Alexa Fluor标记物的荧光强度远高于其它标记物
光稳定性(Photostability)
Alexa Fluor标记物的光稳定性强于大多数其它荧光标记物
pH不敏感(pH insensitivity)
Alexa Fluor标记物在很宽的pH范围内均保持高荧光强度
水溶性(Water solubility)
由近紫外可见近红外毫无例外地得到最好最亮的标记物适于多色分析和制成tandem荧光染料wwwgotofcmcomalexafluor标记抗体特性亮度brghtnessalexafluor标记物的荧光强度远高于其它标记物光稳定性photostabialexafluor标记物的光稳定性强于大多数其它荧光标记物ph不敏感phalexafluor标记物在很宽的ph范围内均保持高荧光强度水溶性watersolubialexafluor染料水溶性好因此标记时无需有机溶剂wwwgotofcmcomalexafluor488fitc亮度光稳定性carboxyfluoresceinoregongreenalexafluor488ph敏感性wwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom亮度antb220alexaflur光稳定性极好wwwgotofcmcom标记抗体wwwcaltagcomwwwgotofcmcom脱机补偿necompensatwwwgotofcmcomwwwgotofcmcom多色分析的利器脱机补偿necompensat减少操作时间和样品用量纠正误操作wwwgotofcmcom多色分析的利器脱机补偿necompensatwwwgotofcmcom所有产品与软件信息请登陆wwwgotcmcom免费电话
BD流式细胞仪培训手册
一、BD FACSCalibur 基本结构
1.1 仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode SSC PMT FL1 PMT FL2 PMT FL3 PMT 只收488 nm波长散射光 只收488 nm波长散射光 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）
4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤 器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位 置。
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鞘液筒：位于抽屉左侧，容积 4 升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3 小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖 上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。
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三、上机分析流程 建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。 （1）Negative Control（不加任何抗体）。 （2）CD3-FITC（FL1 单染）。 （3）CD19-PE（FL2 单染）。 （4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。 3.1 Calibur 开机 1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技 1：如顺序相反，仪器和计算机之间无 法建立正常通讯，无法执行“connect to cytometer”。 解决之道，两者都关机、 然后以正确方式重开。 2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向 调在 VENT 位置（箭头方向）。 3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。 *秘技 2：将减压阀方向调 在加压（向前）位置。减压阀如在 VENT（箭头方向）位置，按 RUN 功能键时 将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。 3.2 开启 CellQuest 软件、编辑实验文件 4. 在苹果菜单下点击 CELLQuest 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可 点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。
BD流式细胞分选仪原理和应用
从分选后染色体在激光共聚焦显微镜下图片 可见分选得到的单条染色体，充分说明了 BD FACSAria Sorp分选纯度高，分选活性 好。
能够分选百万分之 一的细胞
3.肿瘤学
FACSAria分选出1000个 细胞后具有很强的致瘤 性，说明FACSAria分选 出的细胞活性很强。
4. 干细胞研究----分选出的细胞高纯度和高活性
染色体分析和分选图谱（人的23对染色体）
本实验在北京大学医学院 分析测试中心用BD FACSAria Sorp的445nm 及355nm两根激光器对协 和医院基础所的小鼠细胞 样本进行染色体分析分选。 用BD SORP FACSAria 成 功分析并分选到小鼠染色 体，CA3/Hoechst333258 流式图谱可见，很明显的 各号染色体，不同染色体 间的区分度很好，直接说 明了Sorp Aria的355nm及 445nm激光器可以充分激 发Hoechst 333258和 CA3，并且仪器的检测分 辨率高、灵敏度好。
• 胚胎干细胞 • 分化为任何细胞 • Very Small Embryonic-Like Stem Cell ( VSEL) • 分化为任何细胞 • 来源于骨髓或外周血 • 间充质干细胞 • 分化为造血系统外的其它任何细胞 • 来源于骨髓/脐带血/外周血 • 造血干细胞 • 分化为造血系统细胞 • 来源于骨髓/脐带血/外周血 • 成体干细胞 • 器官特异性分化潜能 •iPS •任何来源的细胞 •风险性尚在评估 人胚胎干细胞治疗： 从一个细胞开始的治疗
从一个细胞开始的治疗esc?胚胎干细胞?分化为任何细胞?verysmallembryoniclikestemcellvsel?分化为任何细胞?来源于骨髓或外周血?间充质干细胞?分化为造血系统外的其它任何细胞?来源于骨髓脐带血外周血?造血干细胞?分化为造血系统细胞?来源于骨髓脐带血外周血?成体干细胞?器官特异性分化潜能?ips?任何来源的细胞?风险性尚在评估2012年诺贝尔生理及医学奖
BD流式分选的原理和应用课件
符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴 将要从液流断开时，液流被充电。断开后的液滴仍然带 电，带电的液滴通过被充电的偏转板。受静电吸引或排 斥，带电液滴将向左或向右偏转。不带电的液滴不偏转 而流入废液槽。
21
部分应用实例
科学是复杂的，工具是简单的
22
转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选
用带GFP (绿色荧光蛋白 ) 标记的质粒转染细胞， 在488nm激光激发下， 表达GFP 的细胞发绿色荧光。本实验为U937 细胞转染GFP和目的基因， 用BD FACSAria III 分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BD FACSAria III 分选GFP阳性细胞， 该 样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1 .9%， 分选后回测， 目的细胞纯度高达99%。
细胞凋亡-Annexin Ⅴ/PI双标记法
FITC Annexin V/PI染色和流式细 胞仪分析。Jurkat细胞（人T细胞 白血病）用6µM的喜树碱或0.1% DMSO（阴性对照）4小时，引导凋 亡。细胞根据Annexin V-FITC凋亡 检测试剂盒的染色指南，用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色。 与DMSO对照组相比，喜树碱处理会 增加细胞的早期凋亡（PI阴性， Annexin V阳性），即图中绿色部 分。死细胞（PI阳性，红色部分） 和活细胞（Annexin V和PI阴性， 黑色部分）群体很容易辨别。图中 的数据来自BD Accuri C6流式细胞 的BD CFlow® Plus。
BD公司流式细胞仪
FACSJazz
FACSAriaII
Influx
FACSCantoII
LSRFortessa
Accuri C6
流式细胞仪特点及检测标本
21
部分应用实例
科学是复杂的，工具是简单的
22
转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选
用带GFP (绿色荧光蛋白 ) 标记的质粒转染细胞， 在488nm激光激发下， 表达GFP 的细胞发绿色荧光。本实验为U937 细胞转染GFP和目的基因， 用BD FACSAria III 分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BD FACSAria III 分选GFP阳性细胞， 该 样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1 .9%， 分选后回测， 目的细胞纯度高达99%。
细胞凋亡-Annexin Ⅴ/PI双标记法
FITC Annexin V/PI染色和流式细 胞仪分析。Jurkat细胞（人T细胞 白血病）用6µM的喜树碱或0.1% DMSO（阴性对照）4小时，引导凋 亡。细胞根据Annexin V-FITC凋亡 检测试剂盒的染色指南，用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色。 与DMSO对照组相比，喜树碱处理会 增加细胞的早期凋亡（PI阴性， Annexin V阳性），即图中绿色部 分。死细胞（PI阳性，红色部分） 和活细胞（Annexin V和PI阴性， 黑色部分）群体很容易辨别。图中 的数据来自BD Accuri C6流式细胞 的BD CFlow® Plus。
BD公司流式细胞仪
FACSJazz
FACSAriaII
Influx
FACSCantoII
LSRFortessa
Accuri C6
流式细胞仪特点及检测标本
BD多色流式全面解决方案PPT学习课件
SEB
CD4
IFN-g PE
IFN-g PE
CD8
紫激光配置
检测光学部件需匹配所用的 荧光素 • 许多仪器已经配置可以使
用纳米晶体染料 • 为最大限度地发挥BD
Horizon Brilliant Violet 的 组合优势，仪器可能需要 更新配置 • 更新配置可提高扩展仪器 的性能
BD Horizon Brilliant Ultraviolet (BUV)
302 43 81
7
4
Hu CD4
174 47 58 166
4
3
Hu CD19
85 16 15 40
5
6
Ms CD8a
86 24 50 151
4
2
Ms CD11b
68 15 26
5
3
Hu CD127
37
9
4
Ms CD11b
Hu CD19
Hu CD127
Better resolution of dim markers
CD25 FITC
CD25 BB515
CD25 FITC or CD25 BB515 and CD3 PerCP-Cy5.5, CD4 APC, CD127 PE
荧光素同抗原的搭 配
• 亮的染料 • 减少交叉激光激发 • 减少样品制备影响
BV421
BV711
BV650
PE
BV786
BV605
BV510
与B其V CD他4 试染剂与料PE的比较比较
Buffer Compatibility – Surface Stain
Transcription Factor Buffer
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BV650
BV711
BV711
BV786
BV786
PE
PE-CF594
PE-Cy5
PE-Cy7
BUV395
BUV395
BUV737
BUV737
2
2
3
45Leabharlann 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
BD Horizon Brilliant™ Violet
• 六种被紫激光激发的染料 – 基础多聚体: BV421 and BV510 – 串联体: BV605, BV650, BV711 and BV786
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荧光素分辨率等级
• 等级由细胞经不同克隆，不同规格的抗体在多种流式细胞仪上的实验所得的染色指数（分辨 率）的比较决定
• 激光器的能量，PMT电压，光学部件，抗体克隆和生物样品等多种因素均会影响荧光素/试 剂在某个特定仪器上的效果
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流式多色方案中荧光素选择的重要性
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荧光素的选择是关键
V450
BV510
BV605
BV421
CD 3
CD4
• 合适的荧光素选择帮助我们更好的理解实验 • 对于弱的抗原，亮的染料尤为重要
BD Horizon Brilliant Ultraviolet (BUV)
BUV395 中等亮度
Exmax/Emmax: 348 nm/395 nm 滤光片: 379/28BP
BUV737 明亮
Exmax/Emmax: 348 nm/737 nm 滤光片: 740/35BP; 690LP
两种被355nm紫外激光激发的新荧光素
Hu CD4 BV786
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Buffer compatibility : intracellular staining
Unstimulated
CMV pp65
SEB
CD4
IFN-g PE
IFN-g PE
CD8
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基于仪器配置选择荧光素
488 nm 640 nm
405 nm
561 nm 355 nm # Lasers
BD Accuri™ C6 BD FACSVerse™ BD FACSVerse™ BD LSR™ Fortessa BD LSR™ Fortessa BD FACSCanto™ II BD FACSCanto™ II BD LSR Fortessa X-20 BD LSR Fortessa X-20
APC APC-Cy7
APC Alexa Fluor 700 APC-H7/APC-Cy7
APC Alexa Fluor 700 APC-H7/APC-Cy7
BV421/V450
BV421/V450
BV510/V500
BV510/V500
BV421/V450
BV605
BV605
BV510/V500
BV650
FITC PE PerCP-Cy5.5
FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7
FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7
FITC （ BB515） PE PE-CF594 PerCP-Cy5.5 PE-Cy7
FITC （BB515） PerCP-Cy5.5
APC
APC APC-Cy7
Buffer Compatibility – Surface Stain
Transcription Factor Buffer
Stain – Fix/Perm
Perm III Solution
Stain - Fix/Perm
Fix/Perm - Stain
Hu CD4 BV510
Fix/Perm - Stain
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Identification of immune cell subsets by eight-color antibody staining Nat Rev Immunol,2012
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Eight-color antibody panels proposed by the Human Immunophenotyping Consortium
Nat Rev Immunol, 2012
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主要内容
❖ 多色方案中荧光素选择的重要性 ❖ 荧光素同抗原的搭配 ❖ 优化仪器配置，提高分辨率 ❖ 多色Panel设计实例分析
紫激光配置
检测光学部件需匹配所用 的荧光素
•许多仪器已经配置可以使 用纳米晶体染料
•为最大限度地发挥BD Horizon Brilliant Violet 的 组合优势，仪器可能需要 更新配置
•更新配置可提高扩展仪器 的性能
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荧光素的选择是关键
BV421
V450
CD197 (CCR7) FITC
PerCP-Cy5.5 PE
PE-CF594 Alexa Fluor Alexa Fluor
647
700
CD3
选择正确的荧光素组合是回答生物学问题的关键
• 亮的染料 • 减少交叉激光激发 • 减少样品制备影响
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与其他染料的比较
BV421
BV711
PE
BV786
BV605
BV CD4 试剂与PE比较
BV650 BV510
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• BUV395: 对其他检测其几乎无溢漏
• BUV737: 对Alexa Fluor 700中等溢漏
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