快速试剂的原理及其方法

酶联免疫吸附试验
Enzyme linked immunosorbent assay • ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及 抗体或抗原的酶标记。结合在固相载体表 面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶 标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性 。在测定时，受检标本 （测定其中的抗体或抗原）与固相载体表 面的抗原或抗体起反应。
均阳性反应
一阴一阳
均阴性反应
送确认实验室 进行确认
阴性报告）明胶颗粒凝集试验（PA）：
• PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV 抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用， 混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV 抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读 结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致 敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经我国食品 药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可 初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。
金标法试剂
试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设 备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于 中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个 体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外 进口试剂和国内产品。一般可在10∼30min内判读 结果。
无反应
反应
无意义
无意义
无意义
金标法（胶体硒法）结果判定
• （4）艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包 被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时 检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为 酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与 IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免 静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。 以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹 法（WB）试剂已经美国FDA批准 。 • （5）其它快速筛查试验方法： 家庭HIV检测（Home Access System）等。
快速HIV检测与常规HIV检测 快速HIV检测与常规HIV检测
• 快速* • 常规 平均45分钟 （10分钟－2.5小时） 平均3.5小时 （94分钟－16小时） * 一般不要特殊设备，试剂可不用冰箱存放
快速试剂的局限性
• 一般不用于血液筛查（除5年行动计划） • 有一定的假阳性反应，如作为临床诊断， 要复检和确认 • 有一定的假阴性反应（尤其暴露时间<3个月） • 随访检测（解释检测前后咨询必要性）
ELISA的原理 ELISA的原理
用洗涤的方法使固相载体上形成的 抗原抗体复合物与液体中的其他物质 分开。再加入酶标记的抗原或抗体， 也通过反应而结合在固相载体上。此 时固相上的酶量与标本中受检物质的 量呈一定的比例。
ELISA的原理 ELISA的原理
加入酶反应的底物后，底物被酶催化 成为有色产物，产物的量与标本中受检物 质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进 行定性或定量分析。由于酶的催化效率很 高，间接地放大了免疫反应的结果，使测 定方法达到很高的敏感度。
（二）筛查方法
• 1. 常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA） 目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法） 试剂，少数使用第二代试剂。血源筛查仍以第 三代ELISA为主，国际上有些国家和地区已将 线性免疫酶测定（第四代ELISA试剂）用于血 源筛查。第四代ELISA试剂是最近发展起来的 HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗 原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂 相比，检出时间提前了4-9.1d。其优点在于能 同时检测抗原抗体，降低血源筛查的残余危险 度。
（3）斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速 试验
• 金标纸条采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择 经纯化的基因工程制备的gp36、gp41、p24抗原作 为包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成 肽作为胶体金结合抗原。当待检标本中含有HIV抗 体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用反应 复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原 时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上， 形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控 线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条 红线时，判为阴性。
检测要点
• 1、筛查试验阳性不能出阳性报告 • 2、严格按照试剂说明书操作，不得擅自更 改。 • 3、注意防止交叉污染。 • 4、严格遵守实验室标准操作规程（SOP）。
检测程序及流程图
• 1、筛查试验 • 标本验收合格后，用筛查试剂进行检测， 如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳 性反应的标本，须进行重复检测。
HIV抗体检测快速试剂的 HIV抗体检测快速试剂的 原理和方法
界首市CDC 界首市CDC
常用HIV抗体检测方法 常用HIV抗体检测方法: 抗体检测方法:
–
– – – ELISA 快速HIV检测 快速 检测 免疫印记法 （ Western Blot） ） 其他方法： 其他方法：免疫荧光法（IFA）、放射免疫沉
ELISA的类型 ELISA的类型
• • • • 双抗原夹心法测抗体 双抗体夹心法测抗原 间接法测抗体 竞争法、 竞争法、捕获包被法等
双抗原夹心法测抗体
– 将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。 将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。 – 加受检标本，保温反应。标本中的抗体与固相 加受检标本，保温反应。 抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。 抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除 去其他未结合物质。 去其他未结合物质。 – 加酶标抗原，保温反应。固相免疫复合物上的 加酶标抗原，保温反应。 抗体与酶标抗原结合， 抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标 抗原。 抗原。 – 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产 加底物显色。 通过比色，测知标本中抗体的量。 物。通过比色，测知标本中抗体的量。
• 2、重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和 另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复 检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则 报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一 阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。 应尽可能将重新采集的受检者血液标本和 原有标本一并送检。
筛查试验的流程图
样品 筛查试剂 筛查检测 阳性反应 原有试剂加另外一种筛查 试剂 重复检测 阴性反应
ELISA
酶联免疫吸附试验 + ve
HIV 检测的介绍
包被了HIV 包被了 抗原的检测 板
患者的抗体
酶 显色剂
- ve
快速检测（RT） 快速检测（RT）
• 随着对HIV感染者和AIDS病人抗逆转录病毒 治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自 愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快 速的HIV检测方法被广泛应用。常用的主要 有以下几种：
PA原理示意图 PA原理示意图
（PA）检测结果的判定 PA）检测结果的判定
（2）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）： ）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）
• 以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状， 即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时 间在10 min以内，使用抗原量少。
淀实验
HIV抗体检测 HIV抗体检测
• HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复 和确认试验（WB)。 检）
• （一）检测试剂
• 筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注 册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效 期内的试剂。目前常用的筛查试剂有酶联免疫、 颗粒凝集和其它快速诊断试剂。采供血机构进行 血液筛查应采用HIV-1/2混合型酶联免疫试剂。自 采自供血的单位必须进行HIV抗体检测。