SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
通过SDS（十二烷基硫酸钠，Sodium Dodecyl Sulfate）将蛋白质变性并赋予负电荷，在凝胶电泳中，根据蛋白质的分子量大小，使蛋白质在电场中向阳极方向运动，从而实现蛋白质的分离。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白质的分子量测定、复杂蛋白质混合物的分离、蛋白质组学研究等领域。
它具有简单易行、高分辨率、高灵敏度以及可以与其他技术（如质谱、Western blot 等）结合等优点。
本文将介绍SDS-PAGE的原理、实验步骤和关键注意事项，并提供相关的Markdown文本格式输出，以便读者在实验中参考。
2. 原理SDS-PAGE的原理基于SDS的作用。
SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，能够使蛋白质在水溶液中均匀地带上负电荷，同时使蛋白质变性并展开成线性构象。
在电泳过程中，SDS包裹在蛋白质中，使蛋白质的电荷密度保持均一，从而使蛋白质的迁移速率仅与蛋白质的分子量有关，而与蛋白质的电荷无关。
SDS-PAGE通常在聚丙烯酰胺凝胶上进行。
聚丙烯酰胺是一种化学稳定性强的凝胶材料，通过聚合物的交联形成网状结构。
在凝胶电泳过程中，根据蛋白质分子量的不同，蛋白质能够在凝胶孔隙中以不同程度的速率迁移。
3. 实验步骤3.1. 制备凝胶1.准备1.5 M的Tris缓冲液，pH 8.8。
2.准备汀凝胶的原液，将30%丙烯酰胺溶液、1.5 MTris缓冲液和10%过硫酸铵按照体积比例（29:1:10）混合均匀。
3.快速加入TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）溶液至原液中，并迅速倒入凝胶模具中。
4.在凝胶模具上方加入异丙醇以防止凝胶表面生成凝胶。
3.2. 样品处理1.取适量的蛋白质样品。
2.加入相应的样品加载缓冲液（含有SDS和还原剂，以及测量样品体积比例的溶液）。
3.在冰上煮沸5分钟，使蛋白质样品变性并带上负电荷。
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的。 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
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胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白
质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。
不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度.
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
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1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
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2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、具体实验操作
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻 璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要 充分.
四、实验结果分析
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
三、具体实验操作
3. 实验步骤
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形 瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米 左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性 完成,避免产生气泡.
三、具体实验操作
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置 40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µ l标准蛋白溶解液于EP管内， 再加入10µ 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 l
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移 率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即 可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块 凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
甘氨酸
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲 液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组 分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形 成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两 边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质 前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化， 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳 动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的 区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
Ø 加入加速剂TEMED后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。
保存条件： 4℃保存。
注意事项：
Ø 易燃，有腐蚀性，请注意防护。
Ø为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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过硫酸铵 分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20
性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发 剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外， 它还具有使用方便、安全等优点。 储存及使用注意事项：
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浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离 胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。 在上下电泳槽内充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔 径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只 有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左 右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞ H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。电 泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间 形成—个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好 介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成— 条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
sds-page
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。
作用原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰胺凝胶。
在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开；在DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，DNA呈双链状态泳动，其迁移率会受碱基组成和序列的影响。
在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于加入了变性剂——蛋白质变性剂常为SDS（SDS-PAGE），核酸变性剂常为尿素、甲酰胺等，故其分离仅依据于分子量大小。
蛋白质的SDS-PAGE技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
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一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
Rf= ————————— X ————————— 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
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2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
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3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
sds-page蛋白凝胶电泳原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离
和分析技术。
其原理基于蛋白质的电荷密度和分子质量。
1. SDS（十二烷基硫酸钠）：在SDS-PAGE中，SDS被用作
溶胀剂。
SDS能够与蛋白质中的氢键和疏水作用相互作用，
使蛋白质的二级、三级结构被破坏并线性展开。
SDS与蛋白
质发生作用后，每个蛋白质分子上的SDS数量差不多是相同的，即每个氨基酸上有约2.7个SDS分子。
2. 聚丙烯酰胺凝胶：SDS处理后的蛋白质在凝胶中呈均匀线
性状。
聚丙烯酰胺是一种电泳凝胶，可形成细小的孔隙结构。
这些孔隙可以分离不同分子质量的蛋白质。
3. 电泳过程：在凝胶上形成一个电场，蛋白质带有负电荷，向阳极迁移。
溶胶中的离子也会随之迁移，以维持电中性。
由于SDS已经使蛋白质的结构线性化，其迁移速度主要取决于分
子质量。
较大分子所需的孔隙更大，迁移速度更慢，较小分子则迁移更快。
4. 可视化和测量：分离结束后，可以通过染色剂（如Coomassie Brilliant Blue）将蛋白质染色。
染色剂与蛋白质结合，形成蓝色或紫色的带状条纹，使蛋白质带的位置可见。
在染色后，可以使用图像分析软件测量带的强度和相对迁移距离，从而推断蛋白质的分子质量。
通过SDS-PAGE，可以将不同分子质量的蛋白质分离开来，
并进行定量分析。
它是一种常用的蛋白质研究技术，在生物化学、生命科学和临床诊断等领域得到广泛应用。
SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有 较高的平衡浓度。
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 平板电泳
垂直电泳 水平电泳
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保
护SH基团，而得到窄的电泳带。
三、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
四、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
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• SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白 质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液 中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白 质 的 SDS 复 合 物 的 短 轴 长 度 都 一 样 （ 约 为 1 8 Å， 即 1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这 样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不 再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的 长度也就是蛋白质分子量的函数。
• 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰 胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝 胶的线性分离范围如下表：
丙烯酰胺浓度（%） 15 10 7.5 5.0 线性分离范围（kD） 12～43 16～68 36～94 57～212
双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
3.用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 • 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马 斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜。 4.换脱色液脱色，需3～10小时，其间更换多次脱色液至 背景清楚。
• 此方法检测灵敏度为0.2～1.0 mg。脱色后，可将凝胶
浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。 为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成 胶片。
实验步骤
1.配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试 2.SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 • 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注 浓缩胶所需空间(梳子的齿长再mm高），以阻止氧气进入凝 胶溶液； • 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再 用滤纸吸净残留水； • 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制 备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入 TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进 入下步操作。
实验材料和试剂
• 试剂 丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠（SDS） 用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液 TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 样品处理液（50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯 基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油） 染色液（0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇10% 冰醋酸） 脱色液（10% 甲醇，10% 冰醋酸）
• SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的 聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下 聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙 烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并 形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔 径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小， 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺 凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制， 试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
结果处理
• 测量并计算分子量 • 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测 定得到以下的关系式
Mw ＝ K(10－bm)
lgMw = lgK－bm = K1－bm 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数
(1)
(2)
b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。
mR=dpr/dBPB
• 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的 梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的 空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 • 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比 加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。 • 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电 泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出 凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 • 按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。 • 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进 入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分 离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。 • 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔 （第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
主要内容
• • • • • 实验目的 实验原理 实验材料和试剂 实验步骤 结果处理
实验目的
• 了解电泳实验原理
• 掌握电泳实验操作规程
• 用电泳方法测定蛋白分子量
实验原理
• 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设 计 的 , 样 品 和 浓 缩 胶 中 含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。 系 统 中 所 有 组 分 都 含 有 0 . 1 % 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界 面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的 两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样 品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋 白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱 后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过 分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。