1,25(OH)2D3对人树突状细胞增殖作用及其介导免疫耐受的实验研究80

1，25（OH）2D3对人树突状细胞增殖作用及其介导免疫耐受的实验研究摘要：目的探讨1，25（OH）2D3对人树突状细胞（dendritic cells，DCs）分化、成熟的影响及其介导免疫耐受的机制，为临床预防及治疗异基因造血干细胞移植后GVHD寻找新的方法。

方法在体外将人外周血单核细胞诱导分化成树突状细胞，实验组加入不同浓度1，25（OH）2D3（10-10mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L）对照组加入等量无水乙醇，流式细胞仪分析DCs表面共刺激因子（CD80、CD83、CD86、CD1a）表达水平。

混合淋巴细胞培养后，MTT法评估DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力。

结果（1）与对照组相比，不同浓度1，25（OH）2D3实验组DCs表面标志CD80、CD83、CD86表达率低于对照组（p <0．05），CD1a高于对照组（p <0．05）。

10-10mol/L 1，25（OH）2D3组CD80、CD83、CD86、CD1a表达率分别为（35．91±10.19）%、（27.15±11.64）%、（61.49±8.41）%、（40.43±9.83）%；10-9 mol/L1，25（OH）2D3组分别为（32.04±8.3）%、（23.65±10.13）%、（54.45±9.29）%、（43.81±11.53）%；10-8mol/L1，25（OH）2D3组分别为（19.44±5.36）%、（12.64±4.65）%、（37.13±5.92）%、（46.57±10.91）%；对照组CD80、CD83、CD86、CD1a表达率分别为（45.49±6.59）%、（36.77±7.42）%、（73.20±11.86）%、（29.36±13.34）%。

（2）10-10、10-9、10-8mol/L不同浓度1，25（OH）2D3实验组DCs在刺激T淋巴细胞增殖方面的能力均较对照组降低，且细胞增殖能力随着1，25（OH）2D3浓度增高而降低。

结论 1，25（OH）2D3抑制DCs的成熟，抑制DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖及介导免疫耐受，为诱导器官移植的免疫耐受提供新的思路。

关键词：1，25（OH）2D3；DCs；细胞增殖引言异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，alloHSCT）是目前治疗多种恶性血液病及一些非恶性病的有效方法，但也会出现一些严重的并发症而导致病人死亡，其中主要的是移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）。

因此，如何减少GVHD成为异基因造血干细胞移植迫切需解决的关键问题。

1，25（OH）2D3是维生素D3的活性形式，研究发现1，25（OH）2D3能够有效地预防骨髓移植后aGVHD的发生，并和环孢素具有协同作用[1]。

树突状细胞（DCs）是专职的抗原提呈细胞，参与抗原提呈及为T细胞活化提供第二信号，在GVHD的发生及免疫耐受的形成中起重要作用。

本实验通过对DCs的体外培养探讨1，25（OH）2D3对DCs功能的影响及其介导免疫耐受的机制，为1，25（OH）2D3在预防及治疗GVHD的临床应用提供理论依据。

材料与方法主要试剂1，25（OH）2D3购自美国Sigma公司，用无水乙醇配制储存液浓度为10-4mol/l，-20℃避光保存，乙醇体积分数低于0.1％。

IDO抗体购自millipore公司DC体外培养扩增：取中心血站白膜层细胞Ficoll分离后获得单个核细胞，以DMEM悬浮细胞，调整细胞浓度为2×107／ml，加入6孔培养板中，每孔5ml，37℃，5％CO2孵箱培养4h，使其中的单核细胞贴壁，用37℃预热DMEM轻轻洗培养板以去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞。

在培养板中加入终浓度rh GM-CSF 50ng／ml、rh-IL-4 40 ng／ml的10%胎牛血清DMEM培养液继续培养，然后实验组培养液加入终浓度10-10、10-9、10-8 mol/l的1，25（OH）2D3；对照组加等量无水乙醇，终浓度的体积分数<0.1%，每孔终体积2ml，置于37℃，5％C O2孵箱中，于培养第3，5，7天半量更换培养液，第8天加入TNF，终浓度20ng/ml，加入TNF24小时后收集细胞DCs表面标志的测定：收集培养9天的实验组及对照组细胞，PBS洗涤2次，以PBS调整细胞密度为1×106 /ml，将100ul上述悬液加入流式分析管，再分别加人F1TC-或PE-标记的小鼠抗人CDla、CD80、CD86、CD83免疫单抗各10ul，4℃避光孵育30分钟后PBS洗涤1次，加鞘液500ul上机检测，用FACSCalibur流式细胞仪检测细胞表型.同种异体混合淋巴细胞反应（allo-MLR）：取Ficoll分离外周血单个核细胞的非贴壁细胞作为反应细胞，调整细胞密度至1×106 /ml，取培养第9天的实验组及对照组DCs加入25ug /m l丝裂霉素，37℃灭活1 h，PBS 液洗涤后作为刺激细胞，分别按刺激细胞：反应细胞为1：10、1：20、1：50 的比例加入96孔培养板中（200 ul/孔），每组设3个复孔，另反应细胞对照孔（100ul上述反应细胞+100ulDMEM）空白对照孔（200ulDMEM）。

在37℃饱和湿度、5% CO2孵箱中培养96h.终止反应前4h，加入MTT液（5mg /m l）15ul /孔继续培养，4 h后每孔加入酸化异丙醇100 ul，待结晶的MTT充分溶解后，用酶标仪测波长570 nm 时各孔光密度值（A570值），计算刺激指数（SI），SI=（实验孔A值-空白对照孔A 值）/（反应细胞对照孔A值-空白对照孔A值）。

统计学方法：应用统计学软件SPSS16．0，所得结果用均数±平均标准差（±s）表示。

计量资料由t检验，方差分析用于组间比较，P<0．05为差异有统计学意义。

结果1、3种浓度Vitamin D组及对照组DCs表面分子（CD80、CD83、CD86、CD1a）表达水平见（表1）。

图2 对照组及不同浓度实验组培养9天的DCs的allo-MLRFigure 2 DCs cultured in the presence of vitaminD or not can stimulate T cellsproliferation .The date is presented as mean±SD（p <0.05）2、DCs同种异体混合淋巴细胞反应的结果10-10～10-8mol/L不同浓度Vit.D实验组及对照组 DCs以不同比例与同种异体T淋巴细胞混合，均可产生增殖反应．但随着淋巴细胞比例的增多，其增殖能力下降。

DCs与淋巴细胞的比例为1：20、l：50时，细胞增殖能力较1：10时降低（p <0.05）。

在DCs与淋巴细胞的比例相同条件下，10-10～10-8mol/L不同浓度Vit.D实验组的DCs在刺激T淋巴细胞增殖方面的能力均较对照组降低（p <0.05），且DCs与淋巴细胞的比例为1：10、l：50时，细胞增殖能力随着Vit.D浓度增高而降低，（p <0.05），见图2。

讨论树突状细胞（dendritic cells，DCs）是专职的抗原呈递细胞，参与抗原的识别、加工处理与提呈，是启动T细胞介导免疫反应的首要环节，在免疫应答以及免疫耐受中起关键性作用。

成熟DCs表达高水平MHC-Ⅱ分子和共刺激分子（如CD40、CD80、CD86），能活化初始型T淋巴细胞，参与免疫应答。

未成熟DCs缺乏共刺激分子，不能提供T淋巴细胞活化必需的第二信号，往往导致T淋巴细胞无能或凋亡，诱导免疫耐受[2]。

DCs细胞核内表达维生素D受体（Vitamin D receptor，VDR）。

文献报道1，25（OH）2D3通过VDR介导，可以明显下调MHCⅡ类分子和共刺激信号分子在DCs上的表达，抑制其呈递抗原、激活T细胞免疫应答的能力，从而诱导免耐受。

有学者研究表明1，25（OH）2D3对DCs作用的有效浓度为5×10-11～10-7 mol/L，且10-10～10-8mol/L浓度时与受体亲和力最高。

因此，本研究实验组采用加入10-10～10-8mol/L浓度范围的1，25（OH）2D3，探讨此浓度下作用下1，25（OH）2D3对DCs分化成熟及介导免疫耐受的影响。

我们采用传统的DCs培养方案，在体外获得具有典型形态的DCs，并发现不同浓度1，25（OH）2D3组CD80、CD86、CD83的表达显著低于对照组（p<0．05），CD1a显著高于对照组（p <0．05），且随着1，25（OH）2D3的增加，其表现越明显。

CD83是DCs成熟的重要标志，在DCs抗原递呈作用中具有重要作用。

CD80、CD86为CD28/CTLA-4的配体，是DCs表面的免疫共刺激分子，为T细胞抗原特异性活化提供第二信号，其表达的降低可影响T细胞活化及增殖。

CD1a是非成熟DCs表面重要标志。

由此表明：实验组在10-10～10-8mol/L1，25（OH）2D3的作用下DCs成熟及功能与对照组相比有所下降。

混合淋巴细胞反应的结果表明1，25（OH）2D3能够抑制DCs细胞成熟，使DCs处于非成熟状态，不能激活T淋巴细胞，产生免疫应答，导致对同种异体T淋巴细胞的低反应性，在10-10～10-8mol/L浓度范围内，其浓度越高，其抑制作用越明显。

T细胞分裂、增殖是产生免疫应答的标志，因此混合淋巴细胞反应的结果可以预测器官移植术后免疫反应的水平，从而提示1，25（OH）2D3可以有效地预防及治疗移植后GVHD。

1，25（OH）2D3在GVHD的预防及治疗上的应用尚需进一步的临床及实验室资料证实。

参考文献：[1]Pakkala I，Taskinen E，Pakkala S，Raisanen-Sokolowski A. MC1288，a vitamin D analog，prevents acute graft-versus-host disease in rat bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 2001. 27（8）：863-7.[2]Rossi M，Young JW. Human dendritic cells：potent antigen-presenting cells at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Immunol. 2005. 175（3）：1373-81.。