厌氧培养
厌氧培养方法
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。
厌氧培养的原理
一、厌氧培养的原理
厌氧培养的原理有两方面：一是除去与培养基接触的空气中的氧气；二是增强培养基的还原能力，达到吸收容量中的氧气的目的，是微生物处于无氧的环境中。
二、实验器材
菌种：魏氏梭菌
培养基：卵黄琼脂培养基、疱肉培养基
仪器：恒温水是培养箱、干燥器、真空泵、玻璃平皿、无菌脱脂棉、透明胶三、实验内容及方法
取疱肉培养基试剂管煮沸10——15分钟，感触其溶解的氧气，取出，并迅速冷却，切勿摇动，并按下列步骤操作：
1、接种样品均质液1——2ml或10ml，置于恒温30.C的培养箱内培养五天。
若无异常现象可再培养十天。
若产生混浊并散发奇臭怪味或发酵形成消化肉渣（底部出现黑色沉淀）的即为疱肉培养基试管呈阳性，咋可待用。
2、从阳性疱肉培养基试管中挑出菌种（菌株），划线于卵黄琼脂平板待用。
3、将上述处理后的平板至于干燥器内，在干燥器上涂一层凡士林使其密封，用真空泵抽成真空，立刻关闭干燥器活塞
4、在干燥器底部预先装2.0克焦性没食子酸粉末，并斜置一烧杯，其中装有200ml20%KOH溶液，当抽气完毕关闭干燥器的活塞后，轻轻摇动干燥器，使烧杯倾斜使焦性没食子酸粉末与KOH溶液互相混合，此时容器中的氧便被吸收
5、在干净的玻璃平皿底面上预先称取1g焦性没食子酸，盖上一块无菌脱脂棉，加入10%NAOH1ml，使其缓慢均匀地流入脱脂棉的四周及中心，待脱脂棉呈棕色时，迅速将待用划线卵黄琼脂培养基扣紧，接口处用宽透明胶带贴数圈（不得有气泡，保证平整）
6、将干燥皿、干燥器放入恒温37.C的培养箱培养24小时即可。
四、实验结果
观察菌是否生长。
常见的厌氧培养方法及其原理
常见的厌氧培养方法及其原理Anaerobic culture refers to the process of growing microorganisms in the absence of oxygen. 厌氧培养指的是在无氧条件下培养微生物的过程。
This method is crucial for studying and identifying anaerobic bacteria, which play an important role in various diseases and environmental processes. 这种方法对研究和鉴定厌氧细菌至关重要，而这些细菌在多种疾病和环境过程中扮演着重要角色。
There are several common anaerobic culture methods, each with its own principles and applications. 有几种常见的厌氧培养方法，每种方法都有其自身的原理和应用。
One of the most common methods is anaerobic jar cultivation, which uses a sealed container to create an oxygen-free environment. 最常见的方法之一是厌氧罐培养，它使用密封容器来创建无氧环境。
This technique involves placing the culture medium and the sample in the anaerobic jar, along with a chemical mixture that generates anaerobic conditions. 这种技术涉及将培养基和样品放入厌氧罐中，同时加入一种化学混合物，产生厌氧条件。
The jar is then sealed and placed in an incubator to allow the growth of anaerobic bacteria. 然后密封罐子，并放入培养箱中，以促进厌氧细菌的生长。
厌氧菌检验 微生物学实验
实验六、厌氧菌检验一、厌氧培养1、刨肉基法方法：将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在庖肉培养基中，35℃48h，观察结果。
2、厌氧罐法方法：将破伤风梭菌接种在高渗芽孢培养基中并放置于厌氧罐中；将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在血平板中并置于厌氧罐中，放厌氧袋，密闭，置35℃48h观察结果。
二、观察厌氧菌培养结果：1、庖肉基1）破伤风梭菌：肉汤混浊，部分消化，微变黑，有少量气体，有腐败性恶臭味。
2）产气荚膜梭菌：产生气体，肉渣呈粉红色，不被消化。
2、血平板1）破伤风梭菌：呈薄膜状生长，菌落半透明、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴β溶血。
2）产气荚膜梭菌：多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。
3、梭菌平板破伤风梭菌：形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状。
三、涂片、革兰染色镜检：破伤风梭菌产气荚膜梭菌G-，细长，芽胞圆形，比菌体大，G+，粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列。
位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体四、芽孢染色：制片①5%孔雀绿加热3~5min，水洗甩干；②0.5%沙黄水溶液染色0.5~1.0min，水洗甩干干后镜检，如图所示：菌体呈红色，芽孢呈淡绿色。
破伤风梭菌产气荚膜梭菌五、汹涌发酵试验（试教）产气荚膜梭菌：分解乳糖产酸，使酪蛋白变性，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面上的凡土林层向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，为“汹涌发酵”。
六、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。
2、所有接种的菌株暴露于有氧环境中不得超过20min3、厌氧菌检验：可据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。
最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。
4、破伤风梭菌微生物检验：根据破伤风的典型临床表现即可作出诊断，故一般不作细菌学检查。
厌氧菌的培养方法
1 液体培养基的厌氧培养法
培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却 添加还原剂：
0.03～0.05％L-盐酸半胱氨酸 0.01～0.02％硫乙醇钠 0.5～1％葡萄糖 0.1％抗坏血酸 其它还原剂 添加琼脂
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2 固体培养基的厌氧培养法
厌氧罐法 简易厌氧罐和厌氧袋法 钢丝绒法 焦性没食子酸法 抽气换气厌氧培养法 生物好氧厌氧培养法 转管技术和气体喷射培养法 厌氧手套箱法 （又称厌氧室法）
2.6 生物好氧厌氧培养法
疱肉培养基:
牛肉渣
0.5g
牛肉浸液 7ml
液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。
生物好氧厌氧培养方法
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2.7 转管技术和气体喷射培养法
钢瓶进气 除氧气体
微量O2 H2源
铜柱
360℃ （亮黄色）
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CuO （黑色）
2.8厌氧手套箱法
又称厌氧室法
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干燥器容内径（厘米） 容器3
容积（毫升）
容器1
0.2克
柠檬酸0.6克
15cm（约2150毫升）
和
1.5克
碳酸氢钠0.7克
容器2
硼氢钠
氯化钴
或
0.6克
钯粒
18cm（约3500毫升） 1克
硼氢钠
氯化钴0.33克
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柠檬酸
2.2.2 厌氧袋法
聚碳酸酯（复合塑料膜）制厌氧袋 产气袋 厌氧指示剂 触媒
融化的白蜡封边
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2.5 抽气换气厌氧培养法
玻璃干燥罐 混合气钢瓶:
10％二氧化碳、10％的氢气、80％的氮气
三通阀 触媒:钯粒 / 浸泡钢丝绒 / 氯化钴 厌氧指示剂
厌氧培养方法
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长（例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11V 时才开始生长），在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1 ．生物学方法培养基中含有植物组织（如马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等），由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气（如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理），组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌（如枯草杆菌），另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37 恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2 ．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
（1）李伏夫（B • M Jibbob）法此法系用连二亚硫酸纳（Sodium hydrosulphite）和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204 十Na2C03十02—Na2SO4十Na2SO3十C02 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如系液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1~2 个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭（如图1-5 ）。
厌氧培养的规范化操作
泰兴市人民医院检验科微生物室 刘鸿丽
概述: 厌氧菌感染通常是内源性的， 存在于人体的各个部位，病种遍及 临床各科。各种器官和组织都可以 发生厌氧菌感染，大部分是与需养 菌混合感染。常规细菌培养阴性， 很有可能是厌氧菌感染。因此，进 一步分离鉴定病原菌对感染的诊断、 治疗有重要意义。
厌氧菌鉴定流程 转种需氧培养 ↓ 35℃18-24h
转种厌氧培养 ↓ 35℃48~72h
↓ ↓ ↓ 阳性 阴性 阳性 ↓ ↓ ↓ 做需氧菌鉴定 考 虑 厌 氧 菌 ↓ 菌落革兰色染色、触酶试验、API20A鉴定 报告 报告菌种名或厌氧菌未生长
2.具体采样要求
1）从正常无菌部位或通过严格无菌操作采取，如血 液、胸腔液、腹腔液、心包积液、CSF、关节液以及 通过外科无菌手术或穿刺抽得脓液，或通过特殊技 术如纤维支气管镜取得下呼吸道标本及由阴道后窟 窿穿刺抽得盆腔脓液等。采集和运输过程中应避免 接触空气，及时送检。 2）经口吐出的痰不能避免咽喉部正常菌群感染，不 适宜做厌氧菌培养。可用纤维支气管镜采集。人工 气道如气管切开或气管插管患者，可用吸痰管理经 人工气道口插收标准
1）使用不合格的容器：有渗漏、污染或非无菌 的容器。
2）申请单不符合要求：无姓名、住院/门诊号，
无检验目的，检验目的与标本不符合。
3）标本不符合要求：未与空气隔绝，要求做厌
氧菌培养，经口吐出的痰要求做厌氧菌培养。采
样至送检超过2小时而未用运用培养基等。
4.样品的处理
厌氧菌在适当的培养基上，经35℃、厌氧环境 （80%N2、10%H2、10%CO2）下孵育48~72小时,经涂 片染色、菌落特征、耐氧试验、生化反应等作出 鉴定。
检验流程
1.流程图
厌氧培养的方法
厌氧培养的方法嘿，咱今儿就来说说这厌氧培养的方法！你可别小瞧它，这可是个大学问呢！咱先说说为啥要搞厌氧培养呀。
就好像有些小生物，它们就喜欢在没氧气的地方待着，要是给它们弄个有氧的环境，它们可就不乐意啦，就没法好好生长繁殖咯。
那怎么搞厌氧培养呢？首先得有个专门的容器吧，就像给这些小宝贝们准备个舒适的家。
这个容器得能把氧气隔绝得死死的，不能让一丝氧气溜进去。
你想想，要是有个缝儿，氧气钻进去了，那不就前功尽弃啦？然后呢，还得有一些特别的手段来创造无氧环境。
比如说，可以用一些化学试剂，让它们把氧气给“吃”掉，或者用一些物理方法，把氧气给挤出去。
这就好比是给这些小生物打造一个专属的无氧乐园。
再说说培养的条件吧。
温度呀，湿度呀，这些都得控制好。
温度高了低了都不行，就跟咱人一样，太冷太热都不舒服。
湿度也得恰到好处，太干了太湿了都不利于它们生长。
这就像是给它们准备的饭菜，得合口味才行。
还有啊，得注意无菌操作。
可不能让其他杂七杂八的细菌混进去，不然这厌氧培养不就乱套啦？这就好比是一场精心准备的宴会，可不能让不速之客来捣乱。
你说这厌氧培养是不是挺有意思的？就像是在给这些小生物当保姆，得方方面面都照顾到。
要是有一点疏忽，它们可能就不乐意啦，就长不好啦。
想象一下，要是没有厌氧培养，我们怎么能研究那些只能在无氧环境里生活的小生物呢？怎么能发现它们的奥秘呢？这厌氧培养就像是一把钥匙，能打开那神秘的无氧世界的大门。
所以啊，可别小看这厌氧培养的方法，这里面的学问大着呢！咱得认真对待，仔细研究，才能让这些小生物在无氧的世界里茁壮成长，为我们带来更多的惊喜和发现。
怎么样，是不是对厌氧培养有了更深的认识啦？。
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厌氧培养
1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
焦性末食子酸与碱反应后耗氧。
该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。
如有梭状芽孢杆菌。
7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。
疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。