第二十章 高效液相色谱法
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
第二十章 高效液相色谱(0512)课件
四、检测器
检测器是液相色谱仪的三大关键部 件之一。对检测器的要求是，灵敏度高 、重复性好、线性范围宽、死体积小以 及对温度和流量的变化不敏感等。
检测器的分类
在液相色谱中，有两种类型的检测器 ，一类是溶质性检测器，它仅对被分离 组分的物理或物理化学特性有响应。属 于这类的检测器有紫外、荧光、电化学 检测器等。另一类是总体检测器，它对 试样和洗脱液总的物理或化学性质有响 应。属于这类的检测器有示差折光检测 器等。
输液泵
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流 泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定 性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质 的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要 依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两 大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞 往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
直接紫外检测： 所使用的流动相为在检测 波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接 测定被测组分的紫外吸收强度。
间接紫外检测： 使用具有紫外吸收的溶液 作流动相，间接检测无紫外吸收的组分 。
柱后衍生化光度检测： 对于那些可以与显 色剂反应生成有色配合物的组分，可以 在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适 的显色剂反应，在可见光区检测生成的 有色配合物。
紫外-可见光检测器
原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分 对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组 分浓度成正比。
UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有 很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度 、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所 以还能用于梯度淋洗。
用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度 ，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检 测波长。
高效液相色谱 PPT
制备反应如下
+ Si OH
SO Cl 2
HgBr
Si
Si Cl
NH 2 CH 2 NCH 2 H2
Si NH
CH 2 CHNH 2
共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸 酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须 限制PH在4～8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相 制备反应如下:
第3节 高效液相色谱得固定相和流动相
(－)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类, 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅 为基质,可承受高压,可制成直径、形状、孔隙度不同 得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就 是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使 用得一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻 色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定 相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固 定相两类。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
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3 分离系统——色谱柱
色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管 与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑得聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限, 故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为 4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备往内径较大,可 达25mm 以上。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定 相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们 得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物 质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。
1、分离原理
当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中 心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带 入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目 相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面 发生竞争吸附:
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
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选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
高效液相色谱技术
高效液相色谱技术
高效液相色谱(HPLC)技术是一种用于分离、纯化、定性和定量分析溶液中化合物的技术。
它是在液相色谱技术基础上发展起来的，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、分析速度快等优点。
HPLC技术的核心是色谱柱和溶液泵。
色谱柱是分离样品的重要部分，根据不同的分离目标可以选择不同类型的柱子，例如反相柱、离子交换柱、大小分子排阻柱等。
溶液泵用于将样品溶液以一定的流速推动通过色谱柱，保持流动相的恒定。
高效液相色谱技术主要包括以下几个步骤：
1. 样品预处理：将待分析样品进行处理，如提取、浓缩、溶解等，以便于后续的分析。
2. 进样：将样品注入到进样装置中，通过自动或手动控制，精确地给定进样体积。
3. 分离：在色谱柱中根据样品分离目标的性质和柱上固定相的特性，通过流动相的带动将样品分离。
4. 检测：利用检测器检测样品的浓度或质量，并将信号转化为电信号输出。
5. 数据处理：通过对检测器输出信号的处理和计算，得到对样品的定性和定量分析结果。
高效液相色谱技术在许多领域得到广泛应用，如药学、环境监测、食品安全等。
它能够对样品中的化合物进行高效、灵敏、准确的分离和分析，为科研和工业生产提供了强有力的工具。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和检测化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药学等领域。
它的高效性和精密度使其成为许多实验室中不可或缺的工具。
下面将介绍高效液相色谱的使用方法，希望能为您的实验工作提供帮助。
首先，准备好实验所需的仪器和试剂。
检查色谱柱、流动相、样品溶液等是否符合要求，确保实验的顺利进行。
接下来，进行仪器的预处理和平衡。
打开色谱仪，设置好检测波长和流速等参数，进行系统的平衡和稳定。
然后，进行样品的处理和制备。
将待测样品溶解于适当的溶剂中，过滤去除杂质，使其达到适合进样的状态。
注意样品处理的过程中要保持样品的纯度和稳定性，避免对实验结果产生影响。
接着，进行进样和分离。
将处理好的样品通过自动进样器引入色谱柱中，流动相将样品分离并通过检测器进行检测。
在此过程中，需要注意流速、温度、压力等参数的控制，以保证色谱分离的准确性和重复性。
最后，进行数据的处理和分析。
根据检测器输出的信号，得到样品的色谱图谱，通过峰面积、保留时间等参数进行定量和定性分析。
同时，对实验结果进行统计学处理，评估实验的准确性和可靠性。
在实验操作的过程中，需要注意以下几点，一是要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性；二是要及时记录实验过程中的关键步骤和参数，以备后续分析和总结；三是要及时清洗和维护色谱仪器，延长仪器的使用寿命和保证实验结果的准确性。
总之，高效液相色谱是一种重要的分析技术，掌握其使用方法对于化学、生物、药学等领域的科研工作者来说至关重要。
希望以上介绍的使用方法能够为您的实验工作提供一些帮助，祝您实验顺利取得理想的结果！。
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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和 乙睛的比例，即增加有机相的比例，能 使出峰面积加快，但同时减少分离度。
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二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供 试品，由流动相带入柱内，在柱内各 成分被分离后，依次进入检测器，色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
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三 1.对仪器的一般要求
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（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法
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（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大， 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量，除另有规定外，一 般不宜用于微量杂质的检查，方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
（11）紧固件或连接件泄漏-------------（11） 拧紧或更换紧固件
（12）进样装置部分堵塞----------------（12） 检修进样器并清洗
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现象5：峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
（1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 ------（1）选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的 理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方 面进行比较：
高效液相色谱法(HPLC) ppt课件
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流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
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色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
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四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
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第十八章 高效液相色谱法
思考题和习题
1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？
6．亲合色谱的分离机制是什么？有何特点？
7．速率理论方程式在HPLC 中与在GC 中有何异同？如何指导HPLC 实验条件的选择？
8．试讨论影响HPLC 分离度的各种因素，如何提高分离度？
9．试讨论反相HPLC 的分离条件的选择。
10．在正、反相HPLC 中流动相的强度是否相同？
11．什么叫梯度洗脱？它与GC 的程序升温有何异同？
12．蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？
13．常用的HPLC 定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面积？哪些方法可以不用校正因子？
14．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。
15．宜用何种HPLC 方法分离下列物质？
（1）乙醇和丁醇；（2）Ba 2+和Sr 2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）高摩尔质量的葡糖苷。
16．欲测定二甲苯的混合试样中的对－二甲苯的含量。
称取该试样110.0 mg ，加入对－二甲苯的对照品30.0 mg ，用反相色谱法测定。
加入对照品前后的色谱
峰面积(mm 2)值为，对－二甲苯：对A 40.0，'对A 104.2；间－二甲苯：间A 141.8，
'间
A 156.2。
试计算对－二甲苯的百分含量。
（20.0%） 17．计算例2中炔雌醇的校正因子及含量。
（3.02, 0.0369mg/片）
18．测定黄芩颗粒中的黄芩素的含量，实验方法同例1。
测得对照品溶液（5.98µg/ml ）和供试品溶液的峰面积分别为：706436和458932，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。
（1.55%）
19．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。
测得峰面积分别为3.60, 3.43和4.04cm 2。
称取0.2400g 内标物和试样0.8560g 同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为4.16, 3.71和4.54cm 2。
计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。
（黄连碱26.2%，小檗碱27.3%）
20．计算在反相色谱中甲醇－乙腈－水（60:10:30）的强度因子。
如果改用四氢呋喃－甲醇－水，水的含量不变，为了保持相同的洗脱强度，甲醇的比例是多少? (2.12，68.7%)
21．用15cm 长的ODS 柱分离两个组分。
柱效n =2.84×104m –1；测得t 0=1.31min ；组分的10.41R t min ；2R t =4.45min 。
(1)求k 1、k 2、α、R 值。
(2)若增
加柱长至30cm ，分离度R 可否达1.5?
((1)k 1=2.13、k 2=2.40、α=1.13、R =1.33，(2)R =1.88，能)。