酶联免疫吸附测定法elisa法
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体或抗原。
ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。
下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入特异性抗体，这些抗体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
2.间接ELISA间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。
待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，形成复合物。
然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。
酶联免疫吸附测定法(elisa法)
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法 间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
例如乙肝病毒中的 表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗 体（HBcAg），虽来源于 同一病毒，但仅与其相 应的抗体结合，而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某 一特定的物质，而不需 先分离待检物。
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖 苷酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理
SOP_13-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理与注意事项一、基本原理1、包被1.1、固相载体的要求（1）、结合抗体或抗原的容量大（2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面（3）、不影响免疫反应性（4）、利于反应充分进行（5）、固相方法简便易行，快速经济1.2、固相载体的材料：聚笨乙烯1.3、包被coating将抗原或抗体结合于固相载体。
1.4、封闭blocking用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。
2、反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。
标记酶的要求：(1)、活性高(2)、性质稳定(3)、专一性强(4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5)、方法敏感，重复性好，简单易行(6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉常用酶辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶）3、洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。
4、底物显色HRPDH2+H2O2—————→D+2H2OH2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。
供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。
常用底物：四甲基联苯胺TMB四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。
TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。
二、常用方法与原理1、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似双抗体夹心法应用：乙型肝炎表面抗体3、竞争法（测抗原）方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。
加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）4、竞争法（测抗体）原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测5、间接法方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附法elisa
酶联免疫吸附法elisa
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测生物样本中特定分子（例如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。
ELISA技术基于免疫学原理，结合酶与底物的相互作用，通过测量酶的活性来间接或直接检测目标分子。
ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA 等不同类型。
直接ELISA是将待测样本直接加入包含特异性抗体的微孔板孔中，使目标分子与固相抗体形成复合物，然后添加特异性酶标记的二抗，使其与复合物结合。
最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。
间接ELISA首先将待测样本加入包含特异性抗原的微孔板孔中，使目标分子与固相抗原形成复合物，然后添加特异性酶标记的二抗，使其与复合物结合。
最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。
竞争ELISA是将已知浓度的抗原与待测样本中的抗原竞争结合到固相抗体上，然后添加酶标记的二抗，通过测量酶活性来判断待测样本中的抗原浓度。
夹心ELISA先将特异性抗体固定在微孔板孔上，待测样本中的抗原结合到固相抗体上，然后再加入酶标记的二抗，使其与抗原形成复合物，最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。
ELISA技术广泛应用于医学、生物学、疫苗研发、食品安全等领
域，可以快速、准确地检测目标分子的存在和浓度，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
酶联免疫吸附测定法ELISA在抗生素残留检测中的应用
加强国际合作与交流
加强与其他国家和地区的合作与交流，共同推进ELISA技术在抗生素 残留检测领域的发展和应用。
07 参考文献
参考文献
1 2
参考文献1
介绍了ELISA的基本原理和在抗生素残留检测中 的应用，强调了其高灵敏度和特异性。
抗生素残留的来源
畜牧业和农业中广泛使用抗生素，导致动物产品如肉类、蛋类和奶制品中存在 抗生素残留。
ELISA技术简介
01
酶联免疫吸附测定法（ELISA）
是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过酶标记技术将免疫反应与
化学信号放大相结合，实现对目标物质的灵敏检测。
02
ELISA技术的优点
高灵敏度、特异性、操作简便、适合批量检测等。
03 ELISA在抗生素残留检测 中的应用
抗生素残留检测的重要性
保障食品安全
抗生素残留超标可能对人体健康造成危害， 如产生过敏反应、耐药性等，因此对抗生素 残留进行检测是保障食品安全的重要环节。
国际贸易标准
随着国际贸易的发展，各国对抗生素残留 的检测标准日益严格，符合国际标准的检 测方法对于出口农产品的企业至关重要。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）在 抗生素残留检测中的应用
目录
• 引言 • ELISA技术原理 • ELISA在抗生素残留检测中的应用 • ELISA技术的实验流程 • 实验结果和数据分析 • 结论 • 参考文献
01 引言
抗生素残留问题
抗生素残留对人类健康的潜在威胁
长期摄入含有抗生素残留的食物可能增加人体内耐药菌株的形成，降低抗生素 在治疗疾病时的有效性。
03
ELISA技术的基本原理
细胞外基质降解的检测实验方法和marker
细胞外基质降解的检测实验方法和marker细胞外基质是由多种蛋白质、多糖和其他分子组成的复杂网络结构，对细胞的生存、生长和功能起着重要作用。
细胞外基质的降解与多种疾病的发生发展密切相关，因此对细胞外基质降解的检测具有重要的研究意义。
本文将介绍细胞外基质降解的检测实验方法和marker。
一、细胞外基质的降解实验方法1.酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA是一种常用的检测细胞外基质降解的方法，通过检测特定蛋白质在细胞外基质中的含量来评估基质的降解情况。
ELISA方法需先将不同时间、不同处理条件下的细胞外基质样品加入到特定的酶联试剂盒孔板中，加入特异性的抗体和酶标记抗体进行共同反应，测定细胞外基质中特定蛋白质的含量。
2.凝胶阻抗法（Gelatin zymography）凝胶阻抗法是一种检测细胞外基质降解的电泳技术，它能够通过酶降解凝胶中的凝胶蛋白胶原或明胶，从而分析细胞外基质中降解酶的活性。
实验时，样品混合物中含有细胞外基质降解酶以及其相应的底物，通过电泳使样品中的底物被降解酶水解，然后用染色荧光素化作为检测底物降解的效果。
3.荧光探针法荧光探针法是一种通过荧光信号来检测细胞外基质降解的方法。
通过在细胞外基质样品中加入特定的荧光标记的底物，当底物被降解酶降解时会释放出荧光信号，通过检测样品中的荧光强度来评估细胞外基质的降解情况。
以上三种方法是目前常用的细胞外基质降解的检测实验方法，它们分别采用酶联免疫吸附测定法、凝胶阻抗法和荧光探针法，具有高灵敏度、高特异性和较好的实验操作性。
二、细胞外基质降解的marker1.粘附蛋白（Adhesion molecules）粘附蛋白在细胞外基质中起着细胞粘附和迁移的重要作用，是细胞外基质降解的重要marker。
其在ELISA、凝胶阻抗和荧光探针实验中的变化可以反映细胞外基质的降解情况。
2.胶原（Collagen）胶原是细胞外基质中的重要成分，其降解与多种疾病如风湿性关节炎、肿瘤侵袭和转移等密切相关。
免疫因子检测方法
免疫因子检测方法免疫因子检测方法是一种用于检测免疫因子（如抗体、细胞因子、细胞表面标记物等）存在和活性的方法。
这些免疫因子在机体中起着重要的免疫监测和调节作用，因此其检测对于研究和诊断免疫相关疾病具有重要意义。
以下将介绍几种常见的免疫因子检测方法。
一、酶联免疫吸附测定法（ELISA）酶联免疫吸附测定法是一种常用的免疫因子检测方法，可用于检测抗体、细胞因子等免疫因子的含量和活性。
它基于免疫反应原理，利用固相底物上的抗原或抗体与待测物特异性结合，并通过化学反应使结合物表现出可测量的信号。
ELISA方法操作简便，灵敏度高，可以同时检测多个样本，并可定量测定免疫因子的浓度。
二、流式细胞术流式细胞术是一种用于检测细胞表面标记物和细胞因子的免疫因子检测方法。
它基于细胞免疫荧光染色原理，通过给细胞标记上特定的荧光抗体，再通过流式细胞仪进行检测和定量分析。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，可以同时检测多个标记物，并通过细胞表面标记物的多参数分析来分辨不同细胞亚群。
三、免疫组化法（IHC）免疫组化法是一种常用的组织免疫因子检测方法，可用于检测组织内抗体、细胞因子等的存在和表达情况。
免疫组化法通过将待测物与特异性抗体结合，再通过染色反应可使抗体反应物表现出可见的颜色或荧光信号。
免疫组化法可以定位和定量分析免疫因子在组织中的分布、表达和定位，对于研究免疫相关疾病的病理机制具有重要意义。
四、免疫电泳法免疫电泳法是一种常用的免疫因子检测方法，可用于检测抗体、抗原等的存在和相互作用。
它利用电泳原理，将待测物分离并定位在凝胶上；再通过将特异性抗体与待测物结合，并通过化学反应可呈现出可测量的信号。
免疫电泳法可以用于检测免疫复合物的形成以及免疫因子间相互作用的强弱关系。
总结起来，免疫因子检测方法包括酶联免疫吸附测定法、流式细胞术、免疫组化法和免疫电泳法等。
这些方法根据免疫原理和检测目标的不同，具有不同的优点和适用范围。
elisa法检测步骤
elisa法检测步骤ELISA法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用于检测特定抗原或抗体的方法。
它基于免疫学原理，通过特异性抗体与抗原结合并利用酶的催化作用产生可测定的信号，从而实现对目标物质的定量检测。
下面将介绍ELISA法的基本步骤以及注意事项。
1. 抗原或抗体的固定需要将待测抗原或抗体固定在固相载体上，常用的载体有微孔板等。
固定的目的是为了使待测物能够与特异性抗体或抗原结合，并保持其稳定性。
2. 阻断非特异性结合位点在固定的抗原或抗体上，加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶蛋白（Gelatin），以防止非特异性结合。
3. 特异性抗体的结合将待测样品加入到固定的抗原上，使其中的抗原与特异性抗体发生结合反应。
特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据具体实验需求。
4. 酶标记二抗的结合经过特异性抗体的结合后，再加入酶标记的二抗。
酶标记的二抗与特异性抗体的结合形成免疫复合物。
5. 酶底物的加入在免疫复合物形成后，加入酶底物。
酶底物与酶标记的二抗结合后，酶会催化底物的反应，产生可测定的信号。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
6. 反应停止根据酶底物的选择，选择合适的反应停止液，使酶催化反应停止。
常用的反应停止液有硫酸或碳酸氢钠。
7. 信号检测将停止反应后的溶液转移到酶标仪或光度计中，测定产生的信号强度。
ELISA法可以通过颜色反应或发光反应来进行信号检测。
ELISA法作为一种常用的检测方法，在临床诊断、生物医学研究和生物工业等领域都有广泛应用。
但在进行ELISA实验时，还需要注意以下几点：1. 严格控制实验条件，包括温度、时间和pH值等，以确保实验结果的准确性。
2. 选择合适的阳性和阴性对照，以验证实验的可靠性和敏感性。
3. 遵循操作规范，注意实验操作的无菌和无污染。
4. 合理选择稀释倍数，以保证实验结果在检测范围内。
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一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂），抗原（抗体）先结合在固相载体上， 但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原） 与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保 留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体 上的抗原（抗体）反应结合后，
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
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酶
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
底物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色
反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
黄色 深蓝色
测定波长
492 460 449 425 642
400 500 405 420
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
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（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
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用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
于是，一系列针对生物体系中化学成分的测 量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它 将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体 系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。
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什么是 酶联免疫分析技术 ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
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分别洗涤 除去未结合
的成分
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对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
再加上酶 的相应底 物，即起 催化水解 或氧化还 原反应而 呈颜色。
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其所生成的颜色深浅与 欲测的抗原（抗体）含量成 正比。
这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜、电子显微镜观 察，也可以用分光光度计 （酶标仪）加以测定。
其方法简单，方便讯速， 特异性强。
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二、酶及其底物
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
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（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
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包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
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1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷 兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免 疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法
(enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领 域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析 方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新 型的免疫测定技术 。
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特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的 酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少 量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供 观察的显色反应现象。因此该体系常被称为 酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水 平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、 甚至纳克水平上对其进行定量。
例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测 定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
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特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
生物体系中的化学测量
酶联免疫吸附测定法
裴丹青03081152
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复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示 生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和 预防的过程中也日益凸现其重要作用。
经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、 简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测 对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂 且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。
荧光 黄色
360,450 420
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ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
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（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
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获得待分析物的未标定抗体