脯氨酸检测方法
乳制品中L-羟脯氨酸的测定
乳制品中L-羟脯氨酸的测定1 引言皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。
对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。
L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即为“皮革奶”。
本实验提供两种L-羟脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测，可根据实际情况进行选择。
2 仪器与试剂2.1 仪器、器皿2.1.1 HPLC+紫外检测器2.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱（CAT#: 99751）。
2.1.3 11 mL水解瓶（CAT#: 55354）2.1.4 1.5 mL塑料离心管。
2.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.7 0.22 μm针式过滤器（CAT#:37177）。
2.1.8 2 mL样品瓶（瓶：CAT#:5323，盖CAT#:5325）2.2 试剂2.2.1 甲醇（CAT#:50102）。
2.2.2 乙腈（CAT#:50101）2.2.3 正己烷（CAT#:50115）2.2.3 三乙胺（CAT#:50131）2.2.4 冰醋酸（CAT#:50132）2.2.5 三乙胺（CAT#:50131）2.2.6 磷酸氢二钠（CAT#:50158）2.2.7 磷酸二氢钠（CAT#:50157）2.2.8 L-羟脯氨酸（CAT#:46587）2.2.9 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L），然后加水定容至100 mL。
2.2.10 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL。
2.2.11 衍生剂PITC溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。
2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。
本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。
3. 试剂及仪器3.1脯氨酸3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）3.3 2-甲氧基乙醇3.4 蚁酸(96%)，即甲酸3.5 异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇=1：13.6 15ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm下3.8 1cm 玻璃比色皿4. 样品准备4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。
其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。
浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。
蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。
将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。
4.2原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yesLemon 柠檬21:1 noLime 酸橙21:1 noMandarin 中国柑桔21:1 noMango 芒果1:1 yesNectarine 油桃21:1 noOrange 柑桔21:1 noPapaya 番木瓜1:1 yesPassion Fruit 西番莲1:1 yesPeach 桃6:1 yesPineapple 菠萝1:1 yesPlum 李子7:1 yesPrune 西梅16:1 yesRaspberry 悬钩子（树梅）5:1 yesStrawberry 草莓1:1 yesTangerine 橘子21:1 noTomato 番茄1:1 yes5. 标准溶液的制备5.1脯氨酸贮备液（500mg/L）：0.0500g脯氨酸加水定容至100ml。
脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)
加入物(ml)
1
2
3
4
5
6ห้องสมุดไป่ตู้
脯氨酸标准(100μg/ml)
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
蒸馏水
0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04
脯氨酸含量(μg)
1
2
3
4
5
6
4、 PRO 加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注 意避免产生气泡。如果样品中的脯氨酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进 行测定，样品的检测最好能设置平行管。
积。 4、 所测样本的浓度过高，应用 PRO Lysis buffer 稀释样品后重新测定。
有效期：6 个月有效。
相关：
编号 DF0135 NR0001 PS0013 TO1013
名称 多聚甲醛溶液(4% PFA) DEPC 处理水(0.1%) RIPA 裂解液(强) 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)
加入物(ml)
空白管 标准管
蒸馏水
0.1
—
系列脯氨酸标准(1-6 号管)
—
0.1
脯氨酸提取液
—
—
PRO Assay buffer
1.5
1.5
茚三酮显色液
1.5
1.5
混匀，沸水浴，溶液呈红色。
测定管 — — 0.1 1.5 1.5
5、PRO 测定：迅速冷却加入 PRO 萃取液，振摇 30s，静置片刻，取上清液转移至新的离 心管或试管，离心，取上清液备用。以空白调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)检测标准 管 520nm 处吸光度；以 PRO 萃取液调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)检测测定管 520nm 处吸光度。
l-脯氨酸的企业标准
l-脯氨酸的企业标准以下是一份L-脯氨酸的企业标准，供您参考：1.范围本标准规定了L-脯氨酸的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。
本标准适用于L-脯氨酸的生产、检验和销售。
2.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
3.要求3.1 外观：白色结晶或结晶性粉末，无异味。
3.2 化学名称：L-脯氨酸3.3 分子式：C5H9NO23.4 分子量：115.143.5 含量：≥98.5%（干基计）3.6 熔点：≥195℃3.7 比旋光度：[α]D≥+115°（c=1，水）3.8 水份：≤0.5%3.9 溶解度：易溶于水，微溶于乙醇、甲醇。
3.10 游离酸：≤0.2%3.11 含氮量：≥15.8%3.12 氯化物：≤0.02%3.13 重金属：≤0.002%3.14 砷盐：≤0.0003%4.试验方法4.1 外观取适量样品置于干燥的表面皿上，观察其外观和色泽，嗅其气味。
4.2 分子量测定采用高效液相色谱法测定样品的分子量。
色谱条件如下：柱子为C18柱，流动相为甲醇-水（50:50），流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL。
根据色谱图中的峰大小和出峰时间可计算出样品的分子量。
4.3 含量测定采用高效液相色谱法测定样品的含量。
色谱条件如下：柱子为C18柱，流动相为甲醇-水（50:50），流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL。
根据色谱图中的峰大小和出峰时间可计算出样品的含量。
4.4 熔点测定采用毛细管法测定样品的熔点。
将样品放入毛细管中，加热并记录熔点。
每个样品至少测定两次。
4.5 比旋光度测定采用旋光仪测定样品的比旋光度。
将样品放入旋光仪中，设定波长为589nm，观察旋光方向并记录比旋光度值。
每个样品至少测定两次。
脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定脯氨酸是一种重要的氨基酸，由于其参与了生物体内多种代谢反应，因此在生物学、医学、食品科学等领域都具有重要的应用价值。
对于脯氨酸含量的测定，常用的方法主要有生物化学法、色谱法、质谱法等。
下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。
一、生物化学法生物化学法是一种常用的脯氨酸含量测定方法，其原理是利用苯酰亚胺与脯氨酸在强酸条件下的酰化反应，生成具有紫色色素的N-苯酰脯氨酸，可通过分光光度计测定其吸收光谱来确定含量。
1. 操作步骤：（1）样品制备将待测样品粉碎并过筛，加入盐酸或硫酸等强酸，混合均匀，常温下反应数小时，将反应溶液转移至滤袋中过滤，然后将滤液经旋转浓缩至干燥，加入适量的甲醇或氯仿等溶剂，振荡溶解，即可制备待测样品。
（2）标准曲线制备取不同浓度的脯氨酸标准溶液，分别进行相同的处理方法，制备不同浓度的标准溶液。
然后以标准溶液的吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（3）分光光度计测定将待测样品和标准溶液分别置于分光光度计中，以标准曲线为参照，通过测定吸收光谱来确定样品中脯氨酸的含量。
二、色谱法色谱法多用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用离子交换色谱分离脯氨酸，在检测器中进行检测并计算。
将待测样品加入甲醇或氯仿等溶剂中，过滤经过滤纸，然后加入0.5N NaOH(或1N NaOH) 溶剂，混合并振荡，使脯氨酸完全转化为盐基态的氨基酸。
（2）色谱条件设置利用离子交换色谱柱，设置流速，根据需求设置检测器(如紫外检测器)，调整溶液的pH值、离子强度等，使得脯氨酸能够被完全分离。
（3）色谱分离及检测按照设定条件进行色谱分离，并在检测器中检测脯氨酸的吸收光谱，通过计算峰面积或峰高，来确定样品中脯氨酸的含量。
三、质谱法质谱法通常用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用高分辨率质谱仪对样品进行荷质比分析，获得脯氨酸分子的荷质比和相应的亚分子和碎片离子，进而计算出样品中脯氨酸的含量。
将待测样品中的脯氨酸沉淀或提取出来，常用的提取方法包括利用乙酸酐等试剂进行衍生化处理。
脯氨酸的代谢
脯氨酸的代谢
1. 脯氨酸的定义及其结构：
脯氨酸是一种异构氨基酸，其分子中有两个羟基，是一种含不对称的异构体。
它的分子式为C5H9NO2，分子量为115.12，在水溶液中它的pKa为9.13。
它有很好的水溶解性和营养抗性能，也是肌肉中最重要的氨基酸之一。
2. 脯氨酸的营养价值：
脯氨酸是重要的氨基酸，它是蛋白质的必需成分，对人体健康有着非常重要的作用。
脯氨酸能为蛋白质提供硫醇所需的原料物质，能够防止肉类中脂肪囤积，调节肝脏胆固醇合成，促进免疫功能，增强新陈代谢，增加消化酶活性，增加消化酶吸收营养，并可以调节血液中的氨基酸含量，促进细胞再生成活力。
3. 脯氨酸的储存及检测：
脯氨酸由于其稳定性，在常温下储存，不易变质。
在冷藏，干燥，避光的条件下，可保持较长的有效期，但氨基酸会发生氧化变质，因此在储存过程中应避免曝光在光线的作用。
脯氨酸的检测有多种方法，最常用的检测方法是通过液相色谱仪(HPLC)、分子筛、比色法和光源荧光技术等来实现，其结果可以为实验和工业生产提供重要参考。
4. 脯氨酸的代谢：
脯氨酸代谢在人体中发挥着重要作用。
它被消化酶分解成谷氨酸、胱氨酸和末端丙酮酸，这些物质最终被肝脏分解成尿酸。
高尿酸血症是一种与脯氨酸代谢异常有关的疾病，过多的尿酸可引发肾结石和关节炎。
对脯氨酸代谢异常及其引起的疾病，应采取适当的措施积极治疗，以预防后续并发症的发生。
纯牛奶中动物水解蛋白L-羟脯氨酸含量测定
国
结 晶 乙 酸 钠 溶 于 水 ，稀释 至 １ Ｌ ，此 溶 液 与 ２ ０ ０ ｍＬ 水 和 光度 ； Ｐ为标准 曲线查得试样 吸光度对应浓度 （ｕ ｇ ／ ３ ０ ０ ｍＬ 正 丙醇 混 合 。
ｍＬ）；Ｍ为标准曲线斜率 ；Ｘ 为样品中Ｌ 一 羟脯氨酸的百
氯胺Ｔ 溶 液 ：将 １ ． ４ １ ｇ 氯胺Ｔ ，溶于 １ ０ ｍＬ 水 中 ，依 分含 量 （ ｍｇ ／ ｋ ｇ） ；Ｖ 为 水解 后定 容体 积 （ ｍＬ）；Ｖ ２ 为
含量是衡量动物胶原水解蛋白含量 的一个重要指标 】 。 本试验之所 以设计 为检测纯牛奶 中是否含有Ｌ 一 羟脯氨
１ ． ２ 试 剂 结 晶 乙酸 钠 、苯 酚 、柠 檬酸 、对 二 甲基苯 甲醛 、氯
国药 集 团化 学 试 剂 有 限公 司 ）；正 丙 醇 （ 永 大 化 酸 ，是 因其 为动 物胶 原 蛋 白中特 有成 分 ，而不 存在 于 乳 胺 Ｔ （ 金 鹿 化 工 有限 公 司 ）；盐 酪 蛋 白中 ，所 以一 旦 检 出 ，则可 认 为纯 牛奶 中含 有皮 革 学试 剂 有 限公 司 ）；高氯 酸 （
摘
要 ：为 建立一种 测定 纯牛奶 中Ｌ 一 羟脯氨 酸 的紫外分 光光度 法 ，本研 究首先优化 前 处理条件 ，然后 通过
紫外 分光光度 计选 出Ｌ 一 羟脯氨 酸 的最佳吸 收波 长 ，测 定其含 量 ，并进 行精 密度和加 标 回收率试 验 。结果显 示 ，待测组分线性 关 系良好 ，最低检 出限为０ ． ２ ｍｇ ／ ｋ ｇ 。相对标 准４ ＆￣ＲＳ Ｄ． ｇ Ｊ ０ ． ４ ８ ％￣ ０ ． ７ ７ ％，加标 回收率基本在 ９ ３ ． １ ３ ￣ ／ ｏ ＂ １ ０ ０ ． ５ ７ ％。本 方法灵敏 、准确 ，重复性好 ，样 品处理 简便 易行 ，Ｔｉ ｆ于纯牛奶 ｅ ｅ Ｌ 一 羟脯氨酸含 量测定。
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法Coca-cola standardization office【ZZ5AB-ZZSYT-ZZ2C-ZZ682T-ZZT18】脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。
2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。
本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。
3. 试剂及仪器脯氨酸3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）2-甲氧基乙醇蚁酸(96%)，即甲酸异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇= 1：115ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）分光光度计，检测吸光度设定在520nm下1cm 玻璃比色皿4. 样品准备苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。
其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。
浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。
蜂蜜的稀释，采用蜂蜜加50ml水。
将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。
原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1yes Apricot 杏21:1yes Aronia 野樱莓1:1yes Banana 香蕉1:1yes Blackberry 黑莓1:1yes Cherry 樱桃1:1yes Cranberry 蔓越莓1:1yes Grape 葡萄16:1yes Grapefruit 柚子21:1no Guava 番石榴3:1yesKiwi 泥猴桃1:1yesLemon 柠檬21:1noLime 酸橙21:1noMandarin 中国柑桔21:1noMango 芒果1:1yesNectarine 油桃21:1noOrange 柑桔21:1noPapaya 番木瓜1:1yesPassion Fruit 西番莲1:1yesPeach 桃6:1yesPineapple 菠萝1:1yesPlum 李子7:1yesPrune 西梅16:1yes5:1yesRaspberry 悬钩子（树梅）Strawberry 草莓1:1yesTangerine 橘子21:1noTomato 番茄1:1yes5. 标准溶液的制备脯氨酸贮备液（500mg/L）：脯氨酸加水定容至100ml。
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试验目的：在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。
植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，
抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，
色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色，从标准曲线上查
出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；
5. 大试管；
6. 普通试管；
7. 移液管；
8. 注射器；
9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制
（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。
（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 样品的测定
（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性
茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。
（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，
在3000rpm下离心5min。
（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，
在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸
的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。
计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。
脯氨酸测定
方法名称：脯氨酸的测定—电位滴定法
应用范围：该方法采用滴定法测定脯氨酸的含量。
该方法适用于脯氨酸。
方法原理：供试品加冰醋酸溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，记录高氯酸滴定液的使用量，计算，即得。
试剂：
⒈水（新沸放置至室温）
⒉高氯酸滴定液（0.1mol/L）
⒊冰醋酸
⒋基准邻苯二甲酸氢钾
⒌结晶紫指示液
⒍醋酐
⒎醋酸汞试液
试样制备：
①高氯酸滴定液（0.1mol/L）
配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐5.22mL)750mL，加入高氯酸（70%-72%）8.5mL，摇匀，在室温下缓缓滴加醋酐23mL，边加边摇，加完后再振摇均匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。
若所测供试品易乙酰化，则须用水份测定法测定本页的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%-0.2%。
标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。
每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg 的邻苯二甲酸氢钾。
根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度，即可。
贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。
②结晶紫指示液
取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。
操作步骤：精密称取供试品0.1g，加冰醋酸50mL溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正，记录消耗高氯酸滴定液的体积数（mL），每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于11.51mg 的脯氨酸（C5H9NO2)，即得。
注1：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一，“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。
参考文献：中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，二部，p.657。