ELISA法检测HBsAg影响因素分析

[检验医学] y ELISA法检测HBsAg影响因素分析Analysis of factors influencing the results of ELISA.ZHOU Hong-mei,H UANG Xiao-hu.(Haikou Mu-nicipal Institute of Occupational Diseases,Haikou570102,Hainan,P.R.China)周红妹,黄小虎中图分类号:R512 62 文献标识码:B 文章编号:1009-9727(2006)10-1867-01HBsAg是病毒在肝细胞表达的产物,也是机体感染HBV 后最先出现的血清学指标物。

HBsAg阳性可见于急性乙型肝炎患者的潜伏期、急性期、慢性乙型肝炎患者、无症状HBsAg携带者,所以HBsAg是HBV的感染指标之一。

ELISA法检测HB-sAg具有灵敏度高,特异性强等优点而被广泛应用。

现就实际操作中的影响因素分析如下。

1 试剂的选择随着科技在各领域的发展,肝炎病毒标志物的检验方法也在不断更新,酶联免疫吸附法作为检验肝炎病毒标准的重要诊断方法,目前在我国已被广泛应用。

近年来,各生产厂商纷纷生产出相应的试剂盒。

大大方便了基层单位开展日常工作。

不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别,资料显示[1],不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89 4%~ 99 3%,78%~89%存在较大差异。

有的厂家酶标板孔间A值差大于15%;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。

使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。

因此,选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

我们在实际工作中发觉上海荣盛生物技术有限公司生产的试剂盒在检测HBsAg时灵敏度和特异性都比较好。

所以我们选择了此试剂盒。

2 标本的处理和保存2 1 标本的质量 血清样本最好在新鲜时检测,放置久会有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。

一般说来,在5d内测定的血清标本可放置于4 ,超过1wk测定的需低温冰存,防止污染。

2 2 溶血 标本溶血对乙型肝炎表面抗原检测也有影响,因为红细胞溶解时会释放出具有类过氧化物酶活性的物质,其作用与辣根过氧化物酶类似,如果反应孔非特异吸附了类过氧化物酶活性的物质,则可催化底物显色加深,使本底A值升高甚至造成假阳性。

如果洗涤质量好,则可能大大减少或排除非特异性吸附的干扰。

刘玉振等[2]研究发现,溶血对HBsAg的检测有影响,当红细胞浓度>25%造成的溶血可导致假阳性。

龙宪和等[3]研究发现,无论在健康人还是乙型肝炎病毒感染者中,溶血均导致了ELISA一步法检测HBsAg假阳性结果的出现,而采用二步法则可以保证结果判读无误。

总之,溶血对ELIS A检测HBsAg有一定的影响,影响的性质及其大小因所使用的试剂、测定方法、标本HBsAg的有无及浓度高低、洗板的质量好坏而异。

2 3 离心 标本应离心至血清澄清,避免血清中混有血细胞,对结果产生影响,在日常大批检验过程中,存在血清离心不当的现象,这可能是造成此次非溶血标本出现假阳性的原因。

血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心,此时分离的血清中仍残留部分纤维蛋白原,进行ELISA测定时,也容易造成假阳性结果。

3 加样加样时使用一次性吸嘴,以免交叉污染,加样品,加酶结合物,加底物时均应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。

否则也容易影响结果的准确性。

4 温育酶(此试验标记的酶是辣根过氧化物酶)对温度是很敏感的,鉴于此,对HBV标志物检测时的温度控制就显得特别重要,也是保证检测质量的关键。

众所周知在E LISA中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。

在一定的温度及时间内使包被物与相应的抗原或抗体及酶标记物结合,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。

这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。

在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。

这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

加完标本后加如酶结合物应在37 水浴保温30min,但是,如果采用的温度不稳定,结合反应不在37 之间,则会影响显色反应,甚至出现阴、阳性结果的判断错误。

这种情况我们也见过,患者本来是阴性,可由于我们工作的疏忽,结果做出来的结果是阳性,给我们造成很不好的影响。

我们总结一定要稳定温育温度、时间,这样能保证结果的准确判断。

5 洗涤洗涤在酶联免疫吸附法中虽不是一个反应步骤,但却是成功的关键。

其目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质及反应过程中非特异性吸附于固体载体的干扰物,有条件的单位应该使用洗板机洗板,再人工洗,洗板时所用吸水纸请勿反复使用,以免交叉污染。

将残留在孔内的酶标记物,血清成分等彻底洗干净,免除因洗脱不彻底而造成的 花板 现象。

6 显色和结果判断按顺序加入 A 液和 B 液充分混匀后,应放置37 温育15min,加终止液观察结果。

同时注意不同批号(下转第1833页)y作者单位:海口市职业病防治所,海南海口 570102为8 4%和6 0%,明显高于非超排卵组(2 6%和1 8%,P<0 05),可能正是这一原因所致。

这一结果与有关报道一致[5~6]。

但是,Clayton的报道同时发现[5],产生输卵管粘连的因素如盆腔粘连、子宫内膜异位症等,TPR增加(OR1 3,95%CI 1 0~1 2)。

尽管我们发现机械因素IVF-E T妊娠后的TPR和EIR较非机械因数高(分别为9 1%,6 5%和5 1%,3 6%),但Log i stic多元回归分析没有发现相关性,需要今后增加病例量进一步研究。

COH导致输卵管妊娠的风险增高(OR=3 462)是否与卵巢的反应强度有关,以及是否与子宫内膜的状态有关,我们分析了IVF-ET妊娠病例中经COH后获卵的数量、注射hCG前子宫内膜的厚度与输卵管妊娠的关系。

结果显示,输卵管妊娠的风险与获卵数量之间没有关联,而子宫内膜的增厚有利于胚胎在正常位置的种植(OR=0 879,95%可信范围0 787~0 982)。

结果提示两个问题,一是COH产生输卵管妊娠高风险在IVF-ET所需要的强度下与卵巢反应的程度无关系。

二是在满足IVF-E T所需要的超排卵情况下,子宫内膜增厚,有利于胚胎在正常位置种植。

有关这个问题的研究极少,没有发现可供参考的类似资料。

是否IVF-ET中胚胎输卵管种植的高风险来自于子宫内膜种植条件的不适宜,还是卵巢激素的不平衡所致,或许两者都有,目前还没有相关证据。

但考虑到COH下卵巢激素低下的可能性小,而子宫内膜增生程度又对胚胎正常种植有保护作用看,卵巢激素的不平衡导致生殖道的蠕动和纤毛摆动紊乱可能是主要原因。

由于C OH是IVF-E T中常规应用的方案,因此,研究恰当的用药方案,有利于卵巢激素的平衡,有利于子宫内膜发育,降低输卵管妊娠的发生,应当引起研究人员的高度重视。

4 结论在IVF-E T中,COH可以明显增加输卵管妊娠的风险。

但增长较厚的子宫内膜对胚胎正常位置种植具有保护作用。

参考文献:[1]Cohen J,Mayaux MJ,Guihard,et al In-vitro fertilization and embryotrans fer:a collaborative study of1163pregnancies on the incidence and risk factors of ec topic pre gnancies[J] Hum Reprod,1986,1(4):255~258 [2]Maia HS,Coutinho EM Peris talsi s and anti peris talsi s of the human fallop-ian tube duri ng the menstrual cycle[J] Biol Reprod,1970,2(2):305~ 314[3]Blai r WD,Beck LR Demonstrati on of postovulatory s phincter action by thei sthmus of the rabbi t oviduct[J] Fertil Steril,1976,27(4):431~441[4]Andersen CY,Ziebe S Serum levels of free andros tenedione,testosteroneand oes tradiol are lower in the follicular phas e of concepti onal than of non-concepti onal cycles after ovari an stimulation wi th a gonadotrophi n-releas-ing hormone agonist protocol[J] Hum Reprod,1992,7(10):1365~1370 [5]Clayton HB,Schieve LA,Peterson HB,et al Ectopic Pregnancy Ris k WithAssis ted Reproduc tive Technology Procedures[J] Obs te t Gynecol,2006, 107(3):595~604[6]Fernandez H,Coste J,Job-Spira N Controlled ovarian hypers ti mulationas a ris k factor for ectopic pregnancy[J] Obstet Gynecol,1991,78(4): 656~659收稿日期:2006-09-10(上接第1867页)的试剂不能通用,结果判断必须在10min内完成。

肉眼可观察阳性结果呈兰色,但弱阳性结果就不容易觉察,应配备多功能酶标仪检测,以保证结果判断的正确性。

7 其他干扰物质的影响7 1 药物的影响 高效价的乙型肝炎免疫球蛋白会与HBsAg 形成复合物,影响HBsAg的检出,所以一些HBs Ag阳性患者注射乙型肝炎免疫球蛋白后,HBsAg检测会呈阴性反应,导致乙型肝炎两对半少见模式的出现。

乙型肝炎大三阳的孕妇,为阻断乙型肝炎母婴垂直传播时,在孕第8、9、10月常规注射200mg 乙型肝炎免疫球蛋白,不仅影响孕妇HBsAg的检出,而且其所生产的新生儿也常出现HBsAg阴性,HBeAg阳性和HBcAb阳性等少见模式,可能是乙型肝炎免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HB sAg结合形成复合物,则新生儿HBs Ag检测呈阴性;用0 5m的盐酸处理标本1h可提高检出率[4]。