实验五 DNS法分析蛋白质N-末端
聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法 实验报告
生物化学实验报告
题目：聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法
姓名：余振洋学号：200900140156系年级：09级生科3班
查阅资料得到以下几条结论：
1. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
2.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。
2. 展层速度要快，单析（ 7×7cm ）一般只需 15 -20min。
3. 不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响其实验结果。
4．被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有差异。
5．展层剂的组成应该是固定的，因此配制时各组分比例要正确。
6．展层剂的纯度要注意，一般溶剂采用分析纯试剂即可，必要时可精制后使用。
同组者：张刚刚时间：2011/4/16
一．【实验目的】
1.了解并掌握DNS-氨基酸制备和鉴定的原理及方法。
2.掌握聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸的操作和方法。
二．【实验原理】
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（5-dimethylamino-1-naphthylene sulfonyl chloride，Dansyl ch1oride，简称DNS-Cl）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄色荧光的 DNS- 氨基酸。
实验五蛋白质序列分析
<40 stable >40 unstable
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（二）蛋白质疏水性分析
• 疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力 • 分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的
第一步 • 氨基酸疏水分析为蛋白质二级结构预测提供佐证 • 是分析蛋白质跨膜区重要一步
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蛋白质亲疏水性分析
• ProtScale工具 /tools/protscale.html
直接填写swissprottremblac号accessionnumber直接在搜索框中粘贴氨基酸序列输入swissprottremblac号打开proteintxt将蛋白质序列粘贴在搜索框中输入swissprottremblac号分不同的功能域肽段以p02699为例输出结果功能域用户自定义区段点击不同功能域得到以下结果氨基酸数目相对分子质量理论pi氨基酸组成正负电荷残基数消光系数半衰期原子组成分子式总原子数不稳定系数脂肪系数总平均亲水性40stable40unstable10二蛋白质疏水性分析分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的第一步是分析蛋白质跨膜区重要一步11protscale工具http
②将目的序列粘贴到序列输入框中，选择BLOSUM62 记分矩阵运行BlastP程序。NCBI的BlastP程序要求输 入格式为FASTA格式；
③如果BlastP检测到了高度同源的序列，将有可能提 示目的序列的生物学功能
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基于序列同源的蛋白质功能预测
序列相似性比较作为一个非常有效的工具用于同源 基因的发现
• 典型的有亮氨酸拉链，存在7残基 重复结构（heptad repeat)，以a，
b， c，d，e，f，g位置表示，其中a 和d位置为疏水性氨基酸，而其他位 置 残 基为亲水性
01 实验一 蛋白质N末端氨基酸的鉴定(二甲氨基萘磺酰氯,DNS-Cl,胰岛素)
试剂配制
▪ 0.20 mol/NaHCO3溶液：（84.01 g/mol） 16.8 g，加1000 mL水。
▪ 1.0 mol/L HCl溶液：50 mL浓HCl，加550 mL水
▪ 展层剂：甲酸（88%）:水 = 1.5:100（V/V）
1.取1支小试管（清洗干净） 0.20 mL Phe ＋ 0.20 mL DNS-Cl；
2.薄膜封口，40ºC水浴反应20 min； 3.在酒精灯上将液体蒸干。
DNS-胰岛素的水解
1.加0.50 mL 6.0 mol/L HCl，封口； 2.110ºC水解12-18小时； 3.在电炉上蒸发干液体； 4.加入0.10 mL 1.0 mol/L HCl。
实验一
蛋白质N末端氨基酸的鉴定
（DNS-CL法测定胰岛素的N末端）
DNS-Cl标记氨基酸N末端
二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）与氨基酸 (多肽、蛋白质）N末端的氨基反应，分别生 成有荧光标记的DNS-氨基酸（多肽、蛋白 质），在紫外光照射时发出黄绿色荧光。
灵敏度10-10摩尔。
DNS化反应
胰岛素
1.0 cm
展层
展层及结果观察
展层剂：甲酸（88%）：水 = 1.5 ：100（V/V） 1.将点样后的薄膜弯曲成筒状，用胶带固定； 2.展层5-6 min，溶剂前沿到达距薄膜顶端1.0 cm
时，停止展层； 3.标记溶剂前沿； 4.吹干薄膜，在紫外分析仪中观察结果。
展 层 方 向 展层起点
预期结果
1
2
3
溶剂前沿 1.0 cm
DNS-氨基酸双向展层
试剂配制
▪ DNS-Cl溶液：2.5 mg/mL，用丙酮配制， 在棕色试剂瓶中保存。
“蛋白质N末端氨基酸测定——DNS-Cl法”生化实验报告
蛋白质N末端氨基酸测定——DNS-Cl法操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：16℃实验目的：1.了解蛋白质N末端氨基酸的测定方法。
2.了解DNS-Cl法测定N末端氨基酸的原理。
3.学会使用层析法测定物质组成。
实验原理：（1）DNS-Cl为一种荧光化学剂，pH10左右，DNS-Cl可以与蛋白质N末端α-氨基酸发生反应，生成DNS-蛋白质。
DNS-Cl与末端氨基酸形成的化学键非常稳定，经6M的HCl水解后，蛋白质的肽键被破坏，DNS-N末端氨基酸被水解游离。
（2）在酸性条件下，利用乙酸乙酯可萃取提纯水解游离的DNS-N末端氨基酸，且因DNS-N末端氨基酸在紫外灯照射下，可发出荧光，故便用于后续检测。
（3）层析法基本原理是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
试验方法与过程：1.制备DNS-标准氨基酸：分别吸取0.3ml标准氨基酸（缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸）于各小试管中，加入0.2mlDNS-Cl丙酮溶液，摇匀，封口，于40℃水浴锅中保温20min；取出后用吹风机加热，除去丙酮，剩余溶液用0.1MHCl酸化至PH值为2-2.5；加入乙酸乙酯300μL。
摇匀。
待分层。
2.聚酰胺薄膜层析：取聚酰胺薄膜一张，在距边线1cm处用铅笔做四个记号，分别用毛细管取分层后的乙酸乙酯层点于薄膜上，将下端浸入展层剂（甲酸：水=1.5：100），待展层剂到达距薄膜上部1cm 左右终止层析，取出吹干，在紫外灯下观察荧光点，拍照。
3.计算Rf 值：把在紫外灯下观察到的荧光点标于薄膜上，测量距离。
蛋白质N末端测序
百泰派克生物科技
蛋白质N末端测序
蛋白质N末端即氨基（-NH2）端，是蛋白质合成的起始端。
蛋白质N末端测序就是对N-末端的氨基酸种类和排列顺序进行准确分析。
随着生命科学研究和测序技术
的发展，蛋白质末端序列分析的方法也在不断更新、进步。
目前，测定蛋白质或多肽N末端的方法主要有Sanger法、酶降解法、Edman法、二硝基氟苯法（FDNB法）、丹磺酰氯法（DNS法）和基于质谱的方法，其中Edman法和质谱法在N末端序列分
析中应用最广。
百泰派克生物科技提供基于质谱法和Edman法的蛋白质N末端测序一站式科研技术服务，用于蛋白或活性多肽N端序列分析，还可用于确认重组蛋白表达情况，如是否完整表达、表达过程是否发生断裂以及N端序列是否发生修饰等。
百泰派克生物科技还可根据需求提供定制化技术服务，欢迎免费咨询。
实验五DNS法分析蛋白质N末端
实验方法
聚酰胺薄膜层析
点样
层析
本卷须知
1、点样斑点不宜太大，用毛细管可分2-3次点，点 一次吹干一次。
2、层析时层析液不能没过斑点，要在斑点以下。 3、观察时，用铅笔圈好黄色亮点。
思考
• 网上查询蛋白质构造分析最新动态． • 薄膜层析与其它层析法比较有那些优点？ • 选用展层剂的依据是什么？
DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸
• 标准氨基酸和所分析蛋白质的DNS化 • DNS蛋白质的酸水解〔水解管封管、温度等〕 • 聚酰胺薄膜层析〔展层剂的选择和配制、毛
细管点样、展层装置〕 • 紫外灯下的观察
蛋白质构造分析有关方法
• 蛋白质要求很纯 • 一级构造分析〔氨基酸序列分析〕：N、C-
末端的测定判断肽链数；拆分肽链；各肽 链氨基酸序列分析；二硫键位置确实定。 • 立体构造分析：各种光谱分析；X-光衍射 分析；质谱及核磁共振等分析。
2、 DNS-蛋白质的酸水解
1、DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除 DNS—色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)， 甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)局部被破坏外，其余DNS—氨基酸 很少破坏。
2、DNS—C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基 反响，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏； DNS-ε-赖氨酸和DNS-O酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨 酸和DNS-双-酪氨酸生成，层析后在层析图谱的位点上，都与 DNS-α-氨基酸有区别。
有关资料
序列测定〔sequencing〕已有50多年的历史，但开场时进 展
十分缓慢。最初，人们致力于建立蛋白质和多肽的别离技 术，并确定其氨基酸种类及含量。1945以前，没有任何蛋白 质序列定量测定的方法。以后十年中，由于色谱技术和标记 方法的快速进展，第一个多肽激素〔胰岛素〕的全序列测定 于1955年完成〔Ryle等，1955〕。五年后，第一个酶〔核 糖核酸酶〕序列测定完成〔Hirs等，1960年〕。1965年，
《生物化学》实验指导(8个实验)
《生物化学》实验指导(8个实验)生物化学实验指导吕杰编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。
该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目目录实验一氨基酸纸层析4实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸5实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度7实验四酪蛋白的制备8实验五葡萄糖标准曲线的绘制10实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定12实验七酵母RNA的分离及组分鉴定14实验八维生素C的定量测定16 实验一一氨基酸纸层析一、实验目的1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。
二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。
由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。
缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。
三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：标准氨基酸溶液2、仪器:层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。
3、、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。
（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0.1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮15克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析(1)取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个+作为点样位置，共5个点。
实验七 丹磺酰化法分析蛋白质 N—末端氨基酸
点样
层析
紫外
观察
点 样 模 式 图
标 准 氨 基 酸 1
标 准 氨 基 酸 2
标 准 氨 基 酸 3
标 准 氨 基 酸 4
蛋 白 质 样 品 1
蛋 白 质 样 品 2
返 回
四、记录实验结果
根据展层结果，绘制层析结果图，并标明 未知蛋白的N-末端的氨基酸种类 预 备 实 验 层 析 图
加入0.1ml丙酮定容，作为点样样品
3. DNS-氨基酸的层析与检测
取7 ╳ 7cm薄膜一块，距底1 cm 处用铅笔轻画 一直线，依次轻画间距为1cm的六个点样点
用毛细管取样，在点样位置上点样2~3次，每点一次 ，吹干一次，点样直径应小于2mm，做好点样记录 将膜展成筒形，样品在筒内，箍以橡皮筋固定。向 60mm培养皿中倒入展层液10ml左右，将膜垂直放入 ，外罩一烧杯，进行层析 展层液上升至顶端约0.5cm时，取出，稍干后放入紫 外灯（360nm或280nm)下观察
实验七
丹磺酰化法分析蛋白质 N—末端氨基酸
刘德立
2010. 3
一、实验原理
蛋白质N-末端分析的方法主要有二硝基氟苯（DNFB） 法、丹 磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法和氨肽酶法等。
DNFB法：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的 游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下 水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。 不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
N(CH3)2 R + SO2Cl 丹磺酰氯 水解 + R SO2 丹磺酰氨基酸 O HN CH C OH 氨基酸 O R 丹磺酰N- 端氨基酸 O H2N CH C 多肽N- 端 N(CH3)2 SO2 HN CH C N(CH3)2
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• 标准氨基酸和所分析蛋白质的DNS化 • DNS蛋白质的酸水解（水解管封管、温度等） • 聚酰胺薄膜层析（展层剂的选择和配制、毛 细管点样、展层装置） • 紫外灯下的观察
蛋白质结构分析有关方法
• 蛋白质要求很纯 • 一级结构分析（氨基酸序列分析）：N、C末端的测定判断肽链数；拆分肽链；各肽 链氨基酸序列分析；二硫键位置的确定。 • 立体结构分析：各种光谱分析；X-光衍射 分析；质谱及核磁共振等分析。
最初，蛋白质序列测定主要采用手工的埃德曼降解和环甲基 埃德曼降解和环甲基 化（Edman deglation - dansylation）方法（Edman，1950 年）。蛋白质序列测定的快速进展，应该归功于自动测序仪 的研制成功。与埃德曼和贝格于1967年发明的测序法相比， 1980年开始使用的自动测序仪的灵敏度提高了近1万倍。 质谱技术的发展为蛋白质序列测定开辟了新的途径。第一次 用这种方法测定完整的蛋白质分子是在1997年。质谱法测序 的突出优点是可以识别翻译后修饰 翻译后修饰而得到的特殊氨基酸。用 翻译后修饰 其它方法进行蛋白质序列测定时，这种修饰信息无法获得。 正是利用了质谱技术，人们得出了r-氨基丁酸处于凝血素N末端的重要结论。
4、聚酰胺薄膜层析
1、DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄 膜上检测灵敏度为0．01µg(相当于10—10mol)。聚酰胺薄 膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具 有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛 应用于各种化合物的分析。 2、聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)，对极性物 质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢 键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大 小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢 键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、 解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能达到分离物分 离的目的。 3、聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶薄膜制成的。
1、α-氨基与丹磺酰氯的反应
反应条件：pH9.0-9.5，室温2-4小时或40℃中反应2小时。
2、 DNS-蛋白质的酸水解
1、DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除 DNS—色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)， 甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS—氨基酸 很少破坏。 2、DNS—C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基 反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏； DNS-ε-赖氨酸和DNS-O酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨 酸和DNS-双-酪氨酸生成，层析后在层析图谱的位点上，都与 DNS-α-氨基酸有区别。 3、DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，在DNS-C1 过量时，会产生DNS—NH2，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现 黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分 开。
有关资料
序列测定（sequencing）已有50多年的历史，但开始时进展 序列测定 十分缓慢。最初，人们致力于建立蛋白质 多肽的 蛋白质和多肽的 蛋白质 多肽的分离技 术，并确定其氨基酸种 氨基酸种类及含量。1945以前，没有任何蛋白 氨基酸种 质序列定量测定的方法。以后十年中，由于色谱技术和标记 方法的快速进展，第一个多肽激素（胰岛素）的全序列测定 于1955年完成（Ryle等，1955）。五年后，第一个酶（核 1955 Ryle 1955 糖核酸酶）序列测定完成（Hirs等，1960年）。1965年，约 有20个含100多个残基的蛋白质序列被确定。截止1980年， 这一数字已达1500个。而今天，已测定的蛋白质序列已达30 万个，这在50年前是难以想象的。
DNS法分析蛋白质 末端氨基酸的原理 法分析蛋白质N-末端氨基酸的原理 法分析蛋白质
蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl是一 种荧光物质）在碱性条件下反应，生成DNS-蛋 白质，经酸水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰 胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质的 N-末端氨基酸。此法灵敏度高，也可用于蛋白 质的氨基酸组成的测定。
3、乙酸乙酯抽提
DNS-氨基酸在酸性条件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯 抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-C1的 反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层 析图谱清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸， DNS-谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们大部分 或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。这时 可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述 DNS-氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的下侧，影响不 大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。
实验方法
聚酰胺薄膜层析
点样 层析
注意事项
1、点样斑点不宜太大，用毛细管可分2-3次点，点 一次吹干一次。 2、层析时层析液不能没过斑点，要在斑点以下。 3、观察时，用铅笔圈好黄色亮点。
思
考
• 网上查询蛋白质结构分析最新动态． • 薄膜层析与其它