第七章 代谢调节发酵的原理

生物素影响细胞膜渗透性的原因， 生物素影响细胞膜渗透性的原因，是由于它是 脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基 羧化酶的辅基， 脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，此 酶可催化乙酰CoA的羧化并生成丙二酸单酰辅 酶可催化乙酰CoA的羧化并生成丙二酸单酰辅 进而合成细胞膜磷脂的主要成分——脂 酶A，进而合成细胞膜磷脂的主要成分——脂 肪酸。因此， 肪酸。因此，控制生物素的含量就可以改变细 胞膜的成分， 胞膜的成分，进而改变膜的透性和影响谷氨酸 的分泌。 的分泌。 青霉素抑制肽聚糖中肽链交联； 青霉素抑制肽聚糖中肽链交联； 吐温80或阳离子表面活性剂使壁中脂类流出； 吐温80或阳离子表面活性剂使壁中脂类流出； 或阳离子表面活性剂使壁中脂类流出 产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn 产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+， Mn2+的作用与生物素相似。 的作用与生物素相似。
谢谢
Gene编码酶
酶活中心
过量A作用效应物位点，酶构型变化， 过量A作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中 心而失活
筛选突变株中常用的几种结构类似物
积累的物质 Arg Phe Try Val Ile Met 腺嘌呤 尿嘌呤 结构类似物 刀豆氨酸 对-氟苯丙氨酸、噻恩基丙氨酸 5-甲基色氨酸、6 5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸 αα-氨基丁酸盐 Val α-氨基α-氨基-4-乙硫基丁酸 2,6-乙氨基嘌呤 2,65-氟尿嘌呤
代谢控制发酵技术原理与应用
吕利华
微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调 节系统，以保证上千种酶能正确无误、 节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊 地进行极其复杂的新陈代谢反应。 地进行极其复杂的新陈代谢反应。从细胞水平上 来看， 来看，微生物的代谢调节能力要超过复杂的高等 动植物。这是因为，微生物细胞的体积极小， 动植物。这是因为，微生物细胞的体积极小，而 所处的环境条件却十分多变。 所处的环境条件却十分多变。 代谢调节的方式： 代谢调节的方式： 调节代谢流 调节细胞膜对营养物质的透性 调节酶的定位以限制它与相应底物的接触
1．通过生理学手段控制细胞膜的渗透性 原理： 原理：影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含 受损伤入手。 量。故常从控制磷脂的合成或使细胞膜 受损伤入手。膜 合成不完全或受损， 从而积累发酵产物。 合成不完全或受损，但菌体不死 亡，从而积累发酵产物。 Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量 发酵中把生物素浓度控制在亚适量， 如Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量，可改变细胞膜 透性，从而可大量分泌Glu。 透性，从而可大量分泌Glu。
反馈调节作用
1、终产物反馈阻遏和反馈抑制 野生型菌株“ 野生型菌株“A”氨基酸合成操纵子模型
AR P RNA聚合酶 活性 无活性 repressor A 超过生理需要量 O 反馈阻遏 A结构基因
A合成酶系（E1,E2…） 反馈抑制 A
野生型菌株酶合成水平的反馈阻遏
野生型菌株酶活性水平的反馈抑制
效应物位点 过量A
2．通过细胞膜缺损突变而控制其渗透性 谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中， （1）谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有 限制地添加油酸，合成有缺损的膜， 限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发 生渗漏而提高谷氨酸产量。 生渗漏而提高谷氨酸产量。 原理： 原理：油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸 十八碳烯酸）， ），它是细菌细胞膜磷脂中的重要 （十八碳烯酸），它是细菌细胞膜磷脂中的重要 脂肪酸。油酸缺陷型突变株因其不能合成油酸而 脂肪酸。 使细胞膜缺损。 使细胞膜缺损。 （2）利用石油发酵产生谷氨酸（解烃棒杆菌）的甘 利用石油发酵产生谷氨酸（解烃棒杆菌） 油缺陷型突变株
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ 中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ 中间产物Ⅱ
不能合成
甲硫氨酸 苏氨酸
可以大 量积累
赖氨酸
2．肌苷酸（IMP）的生产 肌苷酸（IMP）
（二）抗类似物突变株的选育 代谢拮抗物的作用机制：与代谢产物结构类似， 代谢拮抗物的作用机制：与代谢产物结构类似， 故能够与阻遏物及变构酶相结合， 故能够与阻遏物及变构酶相结合，且结合不可 逆， 导致有关酶不可逆地停止合成， 导致有关酶不可逆地停止合成，或酶活不可 逆地 被抑制。 被抑制。 方法：将诱变以后的菌悬液涂布在特定的培养基 方法： 加入过量的与代谢产物结构类似的物质、 上（加入过量的与代谢产物结构类似的物质、同 时培养基中没有代谢产物）， ），在此平板上长出的 时培养基中没有代谢产物），在此平板上长出的 菌落即为抗类似物突变菌株。 菌落即为抗类似物突变菌株。验证长出的突变株 是否真正解除的反馈调节。 是否真正解除的反馈调节。 几乎所有的氨基酸和核苷可通过抗类似物突变株 发酵生产。 发酵生产。
如：溶烷棒杆菌GL-21（甘油缺陷型）生产谷氨酸 溶烷棒杆菌GL-21（甘油缺陷型）
PGDH
磷酸二羟丙酮
α-磷酸甘油
磷脂
该菌株的α 磷酸甘油脱氢酶 该菌株的α-磷酸甘油脱氢酶（ PGDH ）缺失，因 脱氢酶（ 缺失， 此不能正常合成α 和磷脂。 此不能正常合成α-磷酸甘油 和磷脂。影响了细胞膜 结构的合成而使得细胞膜透性增大， 结构的合成而使得细胞膜透性增大，有利于谷氨酸 在菌体外积累。 在菌体外积累。
（一）营养缺陷突变株的应用 营养缺陷突变株：指原菌株发生基因突变， 营养缺陷突变株：指原菌株发生基因突变，致使 合成途径中某一步骤发生缺陷， 合成途径中某一步骤发生缺陷，丧失合成某些物 质的能力， 质的能力，必须在培养中外援补充该营养物质才 能生长的突变型菌株。 能生长的突变型菌株。 原理：由于合成途径中某一步骤缺陷， 原理：由于合成途径中某一步骤缺陷，致使终产 物不能积累， 物不能积累，故遗传性地解除了终产物的反馈抑 制，使得中间代谢物或另一分支途径的终产物可 以积累。 以积累。 反馈抑制—— ——主要表现在某代谢途径的末端产物 反馈抑制——主要表现在某代谢途径的末端产物 过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活 主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。 性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。
（四）控制细胞膜的渗透性 微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高 度选择性。 度选择性。细胞内的代谢产物常常以很高的浓度 累积着， 累积着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进 一步合成。采取生理学或遗传学方法， 一步合成。采取生理学或遗传学方法，可以改变 细胞膜的透性， 细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到 细胞外。这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株， 细胞外。这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株， 可以提高发酵产物的产量。 可以提高发酵产物的产量。
（三）营养缺陷型回复突变株的应用 当难以找到合适类似物或者反馈调节非常复杂的 时候， 时候，可采用营养缺陷型选育回复突变株的方法 育种。 育种。 原理： 原理：当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状 经回复突变可再回复到其原有的遗传性状。 后，经回复突变可再回复到其原有的遗传性状。 经过二次突变后，原发生突变的基因所编码的酶 经过二次突变后， 活性中心结构恢复，但调节中心常常会无法恢复。 活性中心结构恢复，但调节中心常常会无法恢复。 因此，酶既恢复了活性， 因此，酶既恢复了活性，且反馈抑制不再严重或 经解除。由此可以提高发酵产品的产量。 者已 经解除。由此可以提高发酵产品的产量。 如金霉素生产菌可使用其蛋氨酸缺陷型的回复突 变株，产量提高1.2~1.3倍 变株，产量提高1.2~1.3倍。
营养缺陷型突变株的工业应用
1．赖氨酸发酵 2．肌苷酸（IMP）的生产 肌苷酸（IMP）
1．赖氨酸发酵
天冬氨酸
抑制 天冬氨酸激酶 高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ 中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ 中间产物Ⅱ来自甲硫氨酸苏氨酸
赖氨酸
人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸
天冬氨酸
人工诱变的 菌种不能产生
天冬氨酸激酶