Protocol感受态制作与转化
感受态细胞制备与转化
6.6 实验步骤
菌株活化
1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH 5α， 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH 在 LB培养基平板表面划线，于 37℃培养16 LB培养基平板表面划线， 37℃培养 16 小时; 小时; 2．挑取一个单菌落，转到3－5 ml LB培养基 挑取一个单菌落，转到3 LB培养基 中，于37℃培养3－5小时; 37℃培养3 小时; 3．将培养液全部转到100 ml LB培养基中培养 将培养液全部转到100 LB培养基中培养 2－3小时，到OD600＝0.3－0.4; 小时，
实验七、连接产物的转化及蓝白斑 实验七、 筛选
7.1 实验目的
学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞 的方法； 的方法；
7.2 试验仪器
1. 无菌工作台 2. 9cm 玻璃平皿 3. 细菌涂布器等
7.3 细菌热激转化原理
1. 转化原理：感受态细菌与质粒冰浴后在较高温度下短时间 转化原理： 水浴（热激），之后再冰浴，由于细菌细胞经受温度骤变， ），之后再冰浴 水浴（热激），之后再冰浴，由于细菌细胞经受温度骤变， 磷脂双分子层状态发生改变，对外源DNA的通透性增加， 的通透性增加， 磷脂双分子层状态发生改变，对外源 的通透性增加 质粒可以高效地进入细菌细胞。 质粒可以高效地进入细菌细胞。 转化子筛选原理：因质粒携带有筛选标记（ 2. 转化子筛选原理：因质粒携带有筛选标记（如氨苄青霉素 抗性基因， ），因而使接受了该质粒的受体菌具有抗 抗性基因，Ampr），因而使接受了该质粒的受体菌具有抗 如果将转化菌液涂布于抗生素的平板上培养， 性。如果将转化菌液涂布于抗生素的平板上培养，只有转 化体才能存活。 化体才能存活。 重组子筛选原理：所用载体克隆位点位于LacZ基因（编码 基因（ 3. 重组子筛选原理：所用载体克隆位点位于 基因 半乳糖苷酶， 诱导表达， 成蓝色） β半乳糖苷酶，受IPTG诱导表达，能分解 诱导表达 能分解X-gal成蓝色） 成蓝色 编码区内，外源基因插入后（重组子）造成该基因失活， 编码区内，外源基因插入后（重组子）造成该基因失活， 因而菌落呈现白色。 因而菌落呈现白色。
感受态细胞的制备和质粒的转化
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打
孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
击；
• 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37ºC培养过夜，观察结果。
• 附注：
• 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）
后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜；
– 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
分子生物学实验-感受态的制备和转化(精)
实验三感受态的制备及转化一、实验目的1．了解质粒DNA转化原理2．熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1．感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109～1010转化子/ug闭环DNA。
感受态制备-protocol
宬槮感受态制备感受态制备实验操作1．电击感受态制备（1）实验准备①玻璃制品泡酸：合适且体积相对较大的锥形瓶、装吸水纸的培养皿、装去离子水和15%甘油的锥形瓶。
②塑料制品：200ul黄色枪尖剪去枪尖，1000ml蓝色枪尖，50mL离心管。
③溶液：LB培养基（活化和扩培），去离子水，15%甘油的水。
④以上物品都需要灭菌处理（121℃20-30min），离心管、枪头、ep管都需要烘干后低温放置。
（制备感受态的试剂都需要提前预冷）（2）实验操作①将存放在-80℃的菌种取出，在超净台内用枪尖沾取一下，分别加入相对应1mL LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中220rpm过夜培养（根据菌种特性设定）；②次日以1:100的比例将上一步培养的菌液添加入LB液体扩培培养基中，37℃220rpm摇晃培养至OD600为0.4左右；③将培养得到的菌液至于冰上静置20-30min,然后在超净台内分装到事先灭菌预冷的50mL的离心管中，4℃，4000rpm，离心10min；④在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的ddH2O 10mL 左右，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的ddH2O混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；（此步骤目的是洗去多余的杂质，此过程一定要轻柔，且保证离心管盖严，以免染菌。
）⑤从离心机里缓慢取出，防止震动使菌体悬起（菌体松散沉积）。
在超净台内去除上清，用吸水纸吸去多余的上清，加入事先预冷的15%甘油10mL，在冰上摩擦使菌体悬起，再加入适量的15%甘油混匀（根据实际情况）4℃，4000rpm，离心10min；1/ 3宬槮感受态制备⑥重复步骤（5）⑦从离心机里缓慢取出，在超净台内倒出上清，尽量避免倒出沉淀。
最后用1ml 左右15%甘油悬起，100uL每支分装到事先插冰上预冷的1.5mL EP管中。
（此过程一定要保证无菌和低温）⑧需要转化的感受态可以防冰上待用；多余的转移到液氮中快速冷冻，放入-80℃保存。
感受态细胞的制备和转化
四 实验结果
转化效率计算公式如下： 转化子总数 转化频率= DNA加入量 =转化子/µ g DNA 转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化 反应液体积
五 思考题
1 试总结出实验成功的关键步骤。 2 用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因 表达的诱导剂的作用机制是什么？ 3 在用氨苄青霉素作为抗菌素筛选转化子是， 一般37℃培养时间不超过20小时，为什么？ 4 氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺 点。
实验 三 感受态细胞的制备和转化
一 实验原理
转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA 分子（供体或称转化因子）转入到一定的细 菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变 的过程。 在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作 用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一 定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电 刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才 能转化进入受菌体内。因此，若想将外源 DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需 将受体菌先制备成易感受状态。
三 操作步骤
2 重组质粒pGEX-6p DNA的转化 取上述感受态细胞200µ 1，加重组质粒DNA2µ 1（约 10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到 42℃水浴 进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴， 预冷1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37℃培养45 分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感 受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板， 37℃恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的 平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所 得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
实验一 感受态制备及转化
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
超级感受态细胞(大肠杆菌)-原理和制备Protocol
大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。
一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。
转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。
Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。
cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
式”近代发展起来的西医，20世纪西 医又发 展到“ 社会-心 理-生 物医学 ”或综 合医学 模式， 后基因 组时代 系统生 物学的 兴起， 形成了 系统医 学在全 球的迅 速发展 ，成为 继传统 医学、 西医学 之后中 、西医 学汇通 的未来 医学。 当代中 国医学 类专业 比较优 秀的学 校有北 京大学 、华中 科技大 学、郑 州大学 等学校 。
中医即中国传统医药学，是形成于 数千年 前的中 国，是 建立在 人们与 疾病长 期斗争 的经验 总结。 习樟恕 ９食鱿 治饕蕉 灾瘟撇 涣说募 膊≈
至于循证医学、比较医学、后现代医 学、行 为医学 等所谓 “医学 ”，都 称不上 一门独 立的医 学科学 ，关于 这一点 在灵魂 医学有 关章节 中将有 相关点 评。
(一)CaCl2 转化法 核心:目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间, 转化效率 107-109 cell/ gD 。
NE.coli: DH5 , TG1, XL-1Blue, JM105
(1)冰上 30min (2)热激 42℃ 90“ (3)恢复 1～2min (4)复苏 37℃ 45-60 min (二)原生质体转化法(protoplast) 适用于 G+ 细菌,特别是芽胞杆菌、酶母。 过程: (1)等渗环境下,脱细胞壁(Lysozyme) (2)细胞壁再生 (三)电转化法(electroporation) 缓冲液:10﹪ 甘油或蔗糖,含(或不含) Mg2+ 离子。 转化条件:2.5 KV/0.2cm 25 F 200-400 。
感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
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感受态细胞的制备：
1.以1:100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）。
2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。
3.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。
5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。
6.于4℃，以4000rpm 离心10min，回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。
8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。
9.在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，防御-70℃冻存。
10.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。
制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。
感受态细胞制备流程图：
过夜菌250ul加入25ml LB液体培养基37℃，200r/min 振荡培养2-3h OD600测
达0.5左右转移至50ml聚丙烯离心管冰上放置30min 培养物到0℃
4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞弃培养液倒置放置1min 加入
5ml 0.1mol/LCaCl2悬浮细胞沉淀，冰上放30min 4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞
弃培养液倒置放置1min 加入1ml预冷0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）悬浮细
胞沉淀冰上分装，10ul/份70℃冻存（当天实验4℃放置4h，最多可放置48h）
转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。