蛋白质电泳

学生毕业论文学院名称0000000 论文题目：蛋白质电泳实验探究学生姓名：000000专业： 0000000班级： 00000000 学号： 0000000学校指导教师： 00000职称：000000实习单位指导教师：陈金锋职称：讲师起止时间： 2012-32012年5 月 3 日目录目录 (2)内容摘要 (3)第一章前言 (4)（一）抗氧化酶概述 (4)（1）抗氧化酶在生活与生产中的应用 (4)（2）人体代谢中的抗氧化酶作用 (4)（二）过氧化氢酶概述 (5)（1）过氧化氢酶简介 (5)（2）过氧化氢酶历史 (5)（3）过氧化氢酶来源 (5)（4）过氧化氢酶结构 (5)（5）过氧化氢酶应用 (5)（三）本实验的目地和意义 (6)第二章实验部分 (7)（一）仪器与试剂 (7)（1）仪器 (7)（2）药品与试剂 (7)（二）实验原理 (7)（1）目地基因的载入与诱导表达 (7)（2）蛋白质电泳 (7)（三）实验方法 (8)（1）目的基因的载入与诱导表达 (8)（2）SDS-PAG电泳 (8)（四）结果与讨论 (10)参考文献 (12)致谢 (12)内容摘要过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH。

抗氧化酶可以以延缓人体衰老，减缓食品因氧化作用而腐败，对人们的生活和生产有很大的利用价值。

本实验以过氧化氢酶为例子，探究过氧化氢酶大量生产途径，降低生产成本，对于人们生活以及生产有重要意义。

关键词抗氧化酶过氧化氢酶大肠杆菌 SDS-PAGE 电泳吸光度蛋白质电泳实验探究000000000000000000000000000第一章前言一、抗氧化酶概述（1）抗氧化酶在生活与生产中的应用：有些东西暴露在空气中很容易和空气中的氧气发生作用，氧气的氧化作用很强，一旦发生氧化作用物质原本的作用就会流失衰老。

削好皮的苹果摆一会就会变黄就是和氧气发生了氧化作用，抗氧化就是隔绝掉物体与氧气接触，减缓氧化的速度，氧化是肌肤衰老的最大威胁，日晒、压力、环境污染等都能让肌肤自由基泛滥，从而产生面色黯淡、缺水等氧化现象。

都是身体产生氧化的“罪魁祸首”。

所以无论从健康层面还是从护肤层面，我们都需要在日常生活中注意抗氧化。

而酶是生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，所以抗氧化酶就是能够起到减缓氧化的速度的生物体内活细胞产生的一种生物催化剂（2）人体代谢中的抗氧化酶作用：人体代谢自身会生成抗氧化剂：谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、超氧化歧化酶(SOD)等内源性酶系或非酶系。

在成长期，这些抗氧化物质在体内合成旺盛，GSH-PX和SOD等抗氧化剂含量很高，能抑制氧自由基产生，平衡人体的代谢，预防眼疾病及各种慢性病。

人超过25岁之后，体自生的抗氧化物质——谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、超氧化歧化酶(SOD)等抗氧化物质合成的速度逐渐减缓。

其中GSH和SOD是人体内主要的抗氧化物，也是人体内增强免疫力、预防疾病的主要元素，而人类自然的老化会造成GSH和SOD 含量的降低，进而影响到体内器官的正常运作，例如老年人的眼睛水晶体组织内的GSH含量便较年轻人偏低许多。

现代科技社会中种植环境技术的改善和饮食习惯的改变，使人类从食物中摄入维生素等天然抗氧化剂数量明显减少，不能满足人体正常的需要，同时外界环境的污染和生活工作节奏的加快，都导致了自由基的成倍产生。

而体内的GSH、SOD受外界刺激或细胞老化影响其含量会大幅降低，进而导致器官功能衰退的现象，普遍发生在人体的所有器官中。

在自由基堆积的老化过程中，血液的GSH、SOD值也会一起下降，而且自由基对于人体的影响还包括：还原氧化的能力减少、蛋白质的合成能力衰退、免疫功能降低、脂质过氧化物的堆积及体内解毒能力也会减弱等等现象。

也就是说，当体内GSH、SOD含量下降时，体内受外界刺激或细胞老化产生的过量自由基的氧化损伤作用就不能被有效抑制，常见眼疾病及各种老化性疾病由此产生。

虽然自由基堆积造成的老化是一种正常的代谢现象，但若能充分的补充外源性抗氧化剂，就能提升体内谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、超氧化歧化酶(SOD)的含量，有效抑制自由基氧化损伤，进而实现预防因氧化伤害所造成的眼疾病及各种老化性疾病。

二、过氧化氢酶概述（1）过氧化氢酶简介：过氧化氢酶是抗氧化酶的一种，目前应用比较广泛，我们通过研究过氧化氢酶来初步了解抗氧化酶的实际应用。

过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH，过氧化氢酶的作用是使过氧化氢还原成水： 2H2O2 → O2 + 2H2O（2）过氧化氢酶历史：作为一种物质，过氧化氢酶是在1811年被过氧化氢（H2O2）的发现者泰纳尔（Louis Jacques Thénard）首次发现。

1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。

1937年，詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶，并在次年获得了该酶的分子量。

1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。

而后，1981年，其三维结构得以解析。

（3）过氧化氢酶来源：几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。

其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。

CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。

在不同的组织中其活性水平高低不同。

过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。

（4）过氧化氢酶结构：过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。

它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。

CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。

H2O2浓度越高，分解速度越快。

（5）过氧化氢酶应用：过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。

过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。

在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。

它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。

近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。

一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。

过氧化氢酶在实验室中还常常被用作了解酶对反应速率影响的工具。

过氧化氢酶能将过氧化氢分解成水和氧气，而对纤维和染料没有影响，因而漂白后染色前，通过H2O2 分解酶去除漂白织物上和染缸中残留的过氧化氢，以避免纤维的进一步氧化和染色时染料的氧化。

同时能缩短加工时间，减少水洗用水，降低废水量。

尤其对纱线、筒子纱和针织物更为适用。

同样，过氧化氢分解酶随pH 值和温度的改变，其活力随之变化，在pH7 左右和30～40 ℃活性最大。

过氧化氢浓度增大，会加快分解反应速度，但必须注意当浓度大于一定量时，酶的作用将减弱，这样过多的残留H2O2 对纤维和染料是不利的。

所以不能因为有了H2O2 分解酶，就能任意地加大H2O2 的用量。

使用时，通常要注意H2O2 分解酶对常用表面活性剂和H2O2 稳定剂的相容性，实际生产应用pH为6～8，温度20～55 ℃，酶用量5～10KCLU/ 升，时间10～20min。

此技术已慢慢地被国内所认识和接受，它对提高活性染料色泽鲜艳度很有利。

三、本实验的目的与意义过氧化氢酶是抗氧化酶的一种，且在生活和生产的各个方面被广泛应用，但是由于获取途径的复杂导致生产成本居高不下。

本实验利用基因重组技术将大豆的过氧化氢酶基因在大肠杆菌中实现了表达，为其开发利用奠定了基础。

第二章实验部分一、仪器与试剂（一）仪器全套电泳设备，离心机，超声波破碎仪，紫外分光光度计、干燥箱，电炉，移液枪、移液管、烧杯，玻璃棒，容量瓶，锥形瓶（二）药品与试剂丙烯酰胺 (Arc) 、N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis)、Tris、SDS、过硫酸铵、TEMED、Nacl、Kcl、溴酚兰、考马斯亮蓝R-250 （G-250）、甲醇、冰醋酸，琼脂粉、二、实验原理（一）目的基因的载入与诱导表达1、 E . coli 表达系统E . col是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

（二）蛋白质电泳SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；Tris-Bis中含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺，能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。

三、实验方法（一）导入目的基因并诱导表达1，诱导表达试剂( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母粉 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。