酶工程-酶分子修饰-Enzyme Engineering
第一章酶学与酶工程1
第二节
酶的分类、组成、结构特点和作用机制
一、酶的分类 分类的依据：催化的反应
分类的层次：
大类，催化的反应类型（6大类）；
亚类，催化的底物中被作用的基团或键的特点；
亚亚类，亚类中的小类； 序号，表示酶在亚亚类中的排号。 编号方法：EC a.b.c.d（EC 3.4.21.4,胰蛋白酶） EC为国际酶学委员会缩写, a,b,c,d为在分类中各层次 的编号。
•转换数指的是当酶分子被底物完全饱 和时，每个酶分子在每秒钟将多少底 物分子转换成产物。其在数值上等与 k3（ k3也被称作kcat）。
第四节 蛋白质、酶和重组蛋白的分离纯化
一、蛋白质的大规模分离纯化
“大规模” ：作为商业出售的蛋白质制品， 至少要有数十克或数百克，乃至达公斤以上。 这里讨论的方法适于使用10～50kg的起始材料， 因为这个规模正好反映出实验室规模和工业规 模的主要差别。
酶 与 底 物 相 互 诱 导 ， 发 生 形 变 断 裂
底物与酶的邻近效应和定向效应
邻近效应：酶与底物结合形成中间复合物后，使 酶的催化基团邻近底物，使有效浓度极大提高， 从而反应速率大大提高。有人曾测过某底物在溶 液中的浓度为0.001moll-1而在活性中心的浓度 100moll-1，比溶液中的浓度高十万倍
活性中心为疏水区域
① 广义的酸碱催化
（狭义酸碱催化）
②共价催化 共价催化就是底物与酶以共价方式形成中间物。
亲核原子对底物的亲电子原子的攻击
所谓亲电试剂就是一种试剂具有强烈亲和电子的原子中心。带 正电离子如Mg２+与NH４+是亲电子的，含有－C＝O及一C＝N 一基团的化合物也是亲电子的
亲核试剂就是一种试剂具有强烈供给电子的原子中心。 酶的催化基团如丝氨酸的-0H基团，半胱氨酸的－SH基团 及组氨酸的一CH—N＝CH一基团。
酶工程名词解释
12、酶反应器（enzyme reactor）：用于酶催化反应的容器及其附属设备
8、固定化酶（immobilized enzyme）：固定在载体上并在一定的吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面，而使酶固定化的方法，称……
10、包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法
11、必需水：维持分子完整的空间构象所必须的最低水量称……
名词解释：
1。酶工程：酶的生产，改性，与应用的技术过程称为酶工程。主要内容包括：微生物发酵产酶、动植物细胞培养产酶、酶的提取与分离纯化、酶分子修饰、酶，细胞，原生质体固定化、酶非水相催化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。
主要任务是经过预先设计，通过人工操作活的人们所需要的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中去的过程称为酶的提取。
3、沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从沉淀中析出，与其他溶质分离的技术过程
4、凝胶层析/凝胶过滤/分子排阻层析/分子筛层析等：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
5、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称……
6、结晶：是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
7、固定华生物技术（immobilization biotechnoly）；通过物理或化学手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
酶工程-English
一、名词解释1、酶(Enzymes)：Enzyme are biological macromolecules that act as catalysts in biochemicalreactions.2、酶工程（Enzyme Engineering）：Enzyme engineering is the application of modifying an enzyme'sstructure or modifying the catalytic activity of isolated enzymes to produce new metabolites, to allow new pathways for reactions to occur,or to convert from some certain compounds into others . These products will be useful as chemicals, pharmaceuticals, fuel, food or agricultural additives.3、固定化酶（Immobilized Enzyme）：The restriction of enzyme mobility in a fixed space is knownas enzyme immobilization. In general, immobilized enzymes are enzymes that are attached to, or entrapped（包埋）within, a macroscopic(肉眼可见的）support matrix so that the resulting catalyst can be reused.4、酶分子的主链修饰：利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法二、填空或选择1、酶的结构分类（structure of molecule）（英文）Proteozyme（蛋白类酶）和Ribozyme（核酸类酶）2、蛋白酶的分类（中英文及顺序）1)氧化还原酶类(oxidoreductases)2)转移酶类(transferases)3)水解酶类(hydrolases)4)裂解酶类(lyases)5)异构酶类(isomerases)6)合成酶类(synthetases，连接酶类，ligases)3、酶的生产方法可以分为提取分离法、生物合成法和化学合成法等3种4、酶生物合成的调节类型分为诱导(induction)和阻遏（repression）（英文）5、Some important industrial enzymes and their sources（列举工业化生产酶）（列举五类）Fungal enzymes：α-Amylase、Catalase、Cellulase、Lactase、LipaseYeast enzymes：Invertase、Lactase、Lipase、RaffinaseBacterial enzymes：α-Amylase、β-Amylase、ProteasePlant enzymes：α-Amylase、β-Amylase、β-Glucanase、Ficin、PapainAnimal enzymes：Catalase、Chymotrypsin、Lipase、Rennet、Trypsin6、细胞破碎的三个机械方法（英文）1)Ultrasonic cell disruption（超声波振荡）2)High pressure homogenisers （高压匀浆器）3)Use of bead mills（珠磨机）7、酶的主要提取方法1）盐溶液提取2）酸溶液提取3）碱溶液提取4）有机溶剂提取8、保持酶活性的方法（maintaining enzyme activity three approaches are possible）（选择题）1)use of additives 2）the controlled use of covalent modification 3）enzyme immobilisation 9、三种修饰的修饰剂举例(列举两类)1)氨基修饰剂：乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等2)羧基修饰剂：碳化二亚胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL等3)巯基修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐等10、酶固定化的方法（Methods of Immobilization）（英文）1）Entrapment 2）Adsorption 3）Covalent Binding 4）Cross-Linking11、非水介质（non-aqueousphase)包括有机溶剂介质(organic solvents)、超临界流体介质(supercritical fluids)、气相介质(gases)、离子液介质(eutectic mixtures)等（英文）三、简答题1、酶工程的主要内容包括（英文）1)酶的生产（enzymeproduction)2)酶的提取与分离纯化(enzyme extraction, isolation,purification)3)酶分子的修饰(enzyme molecule modification)4)酶固定化(enzyme immobilization)5)酶的非水相催化(enzyme catalysis in non-aqueous phase)6)酶反应器(enzymereactor)7)酶的应用(enzyme application)等2、Microbes are preferred to plants and animals as sources of enzymes because（为什么选择微生物细胞作为酶的来源，因为：）1）they are generally cheaper to produce.2）their enzyme contents are more predictable and controllable,3）plant and animal tissues contain more potentially harmful materials than microbes, including phenolic compounds (from plants), endogenous enzyme inhibitors and proteases.3、固定化酶的优点（Advantages of Immobilized Enzymes）（英文）Immobilised enzymes are very important for commercial uses as they possess many benefits which include:1)Convenience: Minuscule amounts of protein dissolve in the reaction, so workup can be much easier.Upon completion, reaction mixtures typically contain only solvent and reaction products.2)Economical: The immobilized enzyme is easily removed from the reaction making it easy to recyclethe biocatalyst.Stability: Immobilized enzymes typically have greater thermal（热的）and operational stability than the soluble form of the enzyme.4、酶的生产的细胞选择条件(1)酶的产量高优良的产酶细胞要具有高产的特性，才有较好的开发应用价值。
酶工程名词解释
1、酶（enzyme）：是具有催化功能的生物大分子。
2、端粒（telomere）：真核生物染色体的末端结构。
3、端粒酶（telomerase）：是催化端粒合成和延长的酶。
4、基因扩增（gene amplification）：是通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式。
5、增强子（modulator）：是一段能够高效增强或促进基因转录的DNA序列。
6、抗体酶（abzyme）：是一类具有生物催化功能的抗体分子。
7、抗体（antibody）：是由抗原诱导物产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。
8、盐溶（solting in）：低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随着盐浓度的升高而增加的现象。
9、盐析（solting out）：当盐浓度达到一定界限后，酶的浓度随着盐溶液的升高而降低的现象。
10、结晶（crystallize）：溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。
11、酶分子修饰（enzyme molecular modification）：通过各种方法使酶分子的结构发生变化，从而改变酶的催化特性的技术过程。
12、金属离子置换修饰（metal ion substitute modification）：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。
13、大分子结合修饰（macro molecules combine modification）：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。
14、侧链基团修饰（side residues modification）：采用一定方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。
15、肽链有限水修饰（peptide chain limit hydrolysis modification）：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的催化特性的方法。
16、定点突变（site-specific mutagenesis）：指在DNA序列上的某一特定位点上进行碱基的改变，从而获得突变基因的操作技术。
酶工程
第一章绪论酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程。
酶的生产(enzyme production):通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。
酶的改性(enzyme improving ):通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。
酶的应用(enzyme application):通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。
酶工程的主要内容包括微生物细胞发酵产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化，酶的非水相催化，酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的酶；并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。
酶是一类具有催化功能的生物大分子，亦称生物催化剂。
酶的分类：1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）酶的催化特性：高效性、高度专一性、反应条件温和且活力可调节影响酶催化反应速率的因素：底物浓度的影响，酶浓度的影响，pH、温度的影响，抑制剂的影响，激活剂的影响米氏方程式：[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度V max：最大反应速度(maximum velocity)Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)米氏常数Km的意义：☐重要特征物理常数，与酶浓度无关。
不同的酶具有不同K m值☐物理意义：Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
☐Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
☐K m值近似等于[ES]的解离常数，可表示酶与底物之间的亲和力：K m值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; K m值小表示亲和程度大,酶的催化活性高☐从k m可判断酶的专一性和天然底物。
酶工程名词解释
酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。
锁钥学说（酶的专一性）：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的互补关系诱导契合学说：酶分子的构象与底物原来并非恰当吻合，只有当底物分子与酶分子相互碰撞时，可诱导底物的构象发生变化，使其与底物配合，然后才结合形成中间络合物，进而引起底物分子发生相应的化学变化。
酶：由生物体细胞合成的具有选择性催化功能的生物大分子( 包括蛋白质和核酸）单纯酶(simple enzyme)：仅由氨基酸残基构成的酶。
结合酶(全酶)(conjugated enzyme)：由蛋白部分(酶蛋白apoenzyme)和非蛋白部分(辅助因子cofactor)组成辅酶（coenzyme）：与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。
辅基（prosthetic group）：与酶结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。
酶的活性中心：酶蛋白上只有少数氨基酸残基参与酶对底物的结合和催化，这些相关氨基酸残基在空间上比较靠近，形成一个与酶显示活性直接有关的区域，称为酶的活性中心。
必需基团：酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必须，这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失，称为必需基团。
接触残基(contact residues)：和底物直接接触，参与底物的化学转变，是活性中心的重要组成部分。
辅助残基(auxiliary residues)：使酶与底物相互结合，辅助接触残基。
结构残基（structural residues）：维持蛋白酶形成一种有规则的空间构象非贡献残基（non-contributing residues）：不参与酶的催化功能，对酶活性的显示不起作用结合基团：与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化基团：促使底物发生化学变化的部位，决定反应的性质。
结构域：蛋白质肽链中一段较独立的具有完整、致密立体结构的区域。
酶工程-05-酶分子修饰
2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 含有活泼反应基团的底物类似物：
①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与 活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。
②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形 成稳定的共价键。
Enzyme Engineering
位点专一性修饰
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Enzyme Engineering
酶的结构
研究酶活性中心的方法
2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作
用。
Problem???
怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结 合？
How to determine ?
Enzyme Engineering
催化特性
研究角度 —— 酶学
环境适应性
研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探 索酶的结构与催化特性之间的关系
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程
Enzyme Engineering
Enzyme Engineering
酶分子修饰
大分子结合修饰
Macromolecules combine modification
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空
间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法 常用的大分子
Enzyme Engபைடு நூலகம்neering
酶分子修饰
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维 持酶活性功能的必需基团
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胰蛋白酶原（trபைடு நூலகம்ypsinogen）的水解激活
利用胰蛋白酶或肠激酶从 trypsinogen 的 N-端切除一段六肽序列： N-Val—(Asp)4—Lys
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核苷酸链剪切修饰Nucleotide chain cleavage modification 仅见于 R 酶的分子修饰，指在核苷酸链的限定位点 进行剪切，使 R 酶的结构发生改变，从而改变其催 化特性的方法
B. 主链连接修饰
将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一 个具有两种或多种催化活性的新的酶分子
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一、主链切断修饰
酶分子的主链包括肽链和核苷酸链。 主链的切断修饰一般使用专一性较高的酶作为修饰剂。
主链被切断后可能出现下列情况： （1）引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其催化功能。
作用：探究酶活性中心的位置。
该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域： N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶。
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FDH: An aldehyde dehydrogenase fusion enzyme in folate metabolism
叶酸代谢途径中的一种全脱氢酶 融合酶FDH
FDH subunit (a single polypeptide) consists of three domains: N-terminal (green), intermediate (red) and Cterminal (blue).
酶工程-酶分子修饰-Enzyme Engineering
第六章 酶分子修饰
组成
结构
功能
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酶分子修饰的方法
酶分子主链修饰 主链的切割修饰 主链的连接修饰
酶分子的侧链修饰 酶分子侧链基团的小分子化学修饰 分子内交联修饰 大分子结合修饰 亲和修饰
酶分子的组成单位置换修饰 酶分子的金属离子置换修饰 酶分子的物理修饰
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第二节 酶分子的侧链基团修饰
酶分子侧链基团修饰（side residues modification）就指是 通过采用一定的方法使酶分子的侧链基团发生改变，从而 改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
酶分子的侧链基团修饰的作用 ① 研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性
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如木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，能够除 去2/3的肽链，该酶的活力基本保持，但其抗原性大 大降低
酵母的烯醇化酶经肽链有限水解，除去由150个氨基 酸残基组成的肽段后，酶活力仍然可以保持，抗原性 却显著降低。
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（3）有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化 功能或使酶活力提高。 特别针对有些生物体生物合成得到的不显示酶催化活 性的酶原的修饰加工。 如：胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶的过程。
L-aspartate
fumarate + NH3
延胡索酸胺化酶；L-天冬氨酸氨裂解酶 Aspartate ammonia-lyase
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二、主链连接修饰
是指将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成 一个酶分子具有两种或者多种催化活性的酶分子修饰方法
在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶被称为多酶 融合体 多酶融合体可以是单体酶也可以是寡聚酶。
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（2）仍然可维持酶活性中心的空间构象，则酶的催化功能 可以保持不变，或损失不多，但是其抗原性等特性将发 生改变。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。
许多药用酶属外源物质，受机体排斥 大分子外源蛋白具有较强的抗原性 肽链的有限水解修饰：用适当的方法使酶分子的肽链在
特定位点断裂，使相对分子量减少，可以在基本保持酶 活力的同时使酶的抗原性降低或消失。
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(A) Ribbon diagram of the Ct-FDH tetramer. The four subunits are in different colors. (B) Ribbon representation of the Ct-FDH subunit: the NADP-binding domain (blue); the catalytic domain (red); the oligomerization domain (green); a hairpin representing a part of the Ct-FDH interface with the rest of FDH is shown in magenta.
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Overall structure of the N-terminal domain of FDH (Nt-FDH). Red, the folate-binding sub-domain; green, the sub-domain similar to tRNA binding domain of FMT; blue, the linker connecting two subdomains.
主链连接修饰的方法 基因工程技术与酶工程技术交叉融合 经过分子生物学操作，将两种或两种以上的酶的基因 融合在一些形成融合基因，再经过克隆和表达，就有 可能获得各种多酶融合体
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天冬氨酸激酶—高丝氨酸脱氢酶融合体 双头酶（double-headed enzyme）：一条主链具有两
种酶活性的酶。
L-19 IVS 的形成
四膜虫（Tetrahymena）26S rRNA
前体自我剪接形成成熟的 26S rRNA， 同时生成414 nt 的线性间隔序列 LIVS LIVS 经一系列剪接、环化、开环过 程最终得到多功能 R 酶 L-19 IVS
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天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰，从其羧基末端切除10个 氨基酸残基的肽段，酶活性提高5倍左右。
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第一节 酶分子的主链修饰
定义 酶分子的主链修饰（main chain modification）就是利用酶
分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及空间结构 发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的技术方法。 酶分子的主链修饰的技术方法
A. 主链切断修饰
采用人为的方法将酶分子的主链切断，使酶分子的化学 结构及空间结构发生改变，从而改变酶的特性和功能