检测蛋白磷酸化的六种方法及其优缺点实验
原核表达验证磷酸化位点的方法
原核表达验证磷酸化位点的方法在生物学研究中，磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，它可以影响蛋白质结构和功能。
因此，验证磷酸化位点的方法非常重要。
下面，我们将介绍一种原核表达验证磷酸化位点的方法。
步骤一：克隆目标蛋白质基因首先，需要从目标生物体中提取RNA，并通过逆转录过程生产cDNA。
然后，将cDNA插入到原核表达载体（如pET系列）中，构建出一个表达目标蛋白质的重组质粒。
步骤二：进行点突变实验为验证磷酸化位点，通常使用点突变实验来更改目标蛋白质的氨基酸序列。
点突变可以通过PCR扩增目标cDNA，并使用QuikChange方法来替换所需氨基酸。
步骤三：表达蛋白质将构建出的重组质粒转化到宿主菌中，进行蛋白质表达。
这通常通过诱导表达质粒中包含的启动子来实现。
此时，我们可以添加磷酸化剂，如ATP和磷酸酰胺，来模拟磷酸化条件。
步骤四：进行质谱分析在蛋白质表达和磷酸化模拟后，我们需要进行质谱分析。
在这个过程中，我们可以使用质谱来检测磷酸化位点，以确定目标氨基酸是否被有效磷酸化。
质谱分析需要专业的设备和技术，因此需要进行实验室合作或委托专业公司进行。
通过上述的几个步骤，我们可以成功验证磷酸化位点。
这种方法可以用于各种类型的蛋白质研究，包括原核和真核生物。
同时，该方法还可以扩展到其他修饰方式的验证，为蛋白质研究提供更好的工具。
总之，围绕原核表达验证磷酸化位点的方法，需要实验者掌握相关实验技巧和设备，同时还需要进行严格、精确的实验操作。
希望在今后的蛋白质研究中，这种方法能够被更广泛地应用。
全新方法：用于磷酸化蛋白的分离和检测
全新方法：用于磷酸化蛋白的分离和检测蛋白磷酸化是一种重要的翻译后修饰方式，调控广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯等。
此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。
传统的检测蛋白磷酸化的方法：• 放射性同位素标记• Western Blot• 酶联免疫吸附分析（ELISA）• 流式细胞仪和免疫细胞化学/免疫组织化学（ICC/IHC）• 质谱——由于磷酸化蛋白的信号较弱，目前还具有一定的难度。
需要特异性的磷酸化抗体！！！可是，没有磷酸化抗体怎么办呢？Phos-tag是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子，可取代传统的酶免疫法和放射性同位素法，用来分离和检测磷酸化蛋白。
有两类：Phos-tag Acrylamide和Phos-tag Biotin。
Phos-tag AcrylamidePhos-tag Acrylamide分离：SDS-PAGE分离不同磷酸化水平的蛋白该方法可以在同一个电泳条带里面同时观察靶蛋白的不同磷酸化状态，以及外因引起的磷酸化状态的改变。
有老师可能会问，这么好用的产品，怎么操作呢？只要在配置SDS-PAGE胶的时候，将phos-tag配成的溶液加入分离胶里面，就配置成Phos-tag聚丙烯酰胺凝胶了，后续用跟常规SDS-PAGE一样的步骤进行操作就可以，用起来简单的呢。
如果想进一步确认一下分开的这些条带是不是你要的蛋白，可以用常规的抗体来确认（常规抗体就可以代替多个磷酸化抗体哦，省时省钱又省力）。
详细的protocol可见APExBIO官网哦！特点• 非放射性元素，非荧光物质• 磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带• 操作简便，与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似• Phos-tag 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关• Phos-tag SDS-PAGE实验后，可进行常规的免疫组化、质谱等• 性质稳定，溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月• 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测• 不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来应用举例Phos-tag BiotinPhos-tag Biotin检测：代替western blot检测中的磷酸化抗体原理如上图所示：先使用常规的方法，将SDS-PAGE胶上的蛋白转移到PVDF 膜上，然后Phos-tag Biotin就可以跟膜上磷酸化蛋白的磷酸根结合，接着加入HRP耦联的链霉素，再加入底物进行显色，就可以检测我们的磷酸化蛋白了！如果你研究的蛋白没有相应的磷酸化抗体可以使用，就可以尝试用这个方法啦！应用举例如图所示：图A：加入磷酸酶，磷酸化蛋白水平下降，而没有加磷酸酶的磷酸化蛋白水平较高。
植物蛋白磷酸化的检测方法
植物蛋白磷酸化的检测方法植物蛋白磷酸化的检测方法一、植物蛋白磷酸化的概念植物蛋白磷酸化是植物蛋白结构和功能发生变化的一种重要机制，即植物蛋白质中的某些氨基酸附近的磷酸基团会结合到该氨基酸上，从而产生植物蛋白磷酸化。
从调节活性的角度来看，构成植物蛋白磷酸化的磷酸基团可能会改变蛋白质的物理化学性质，从而激活或抑制植物蛋白质的活性。
因此，植物蛋白磷酸化的检测和分析对于研究蛋白质功能和作用，特别是植物对环境和营养的调节反应具有重要意义。
二、植物蛋白磷酸化的检测方法1、免疫结合法免疫结合法是一种用于检测植物蛋白磷酸化的特异性方法，它采用特定的抗体来识别植物蛋白磷酸化的氨基酸残基，以获得有关植物蛋白磷酸化的结果。
根据免疫结合技术的要求，在检测植物蛋白磷酸化时，研究者需要用特定的抗体来检测某一个特定的氨基酸残基，以及特定的磷酸基团是否结合到该残基上，从而判断植物蛋白是否发生磷酸化反应。
2、质谱法质谱法指植物样品分离的离子，采用质谱仪的扫描模式，扫描样品中的植物蛋白，通过获得离子的m/z值，将其与标准值进行比较，从而确定植物蛋白磷酸化情况。
由于质谱仪的灵敏度极高，可以精确地检测和定位植物蛋白中的磷酸基团，因此质谱法在植物蛋白磷酸化的研究领域有着广泛的应用。
3、生物膜片法生物膜片法是另一种检测植物蛋白磷酸化的有效方法，它基于生物膜片（即医学上常用的膜片上的电泳结构），用于检测植物蛋白中的磷酸化情况，特别是它可以在生物膜片上检测植物蛋白各种磷酸化状态。
4、酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(ELISA)是一种用于检测植物蛋白磷酸化情况的实验方法，这种实验在细胞生物学和免疫学领域有着广泛应用。
在本实验中，根据特定的抗体和抗原检测植物放射蛋白的特定位点是否发生磷酸化，从而得出关于植物蛋白磷酸化的结果。
三、结论植物蛋白磷酸化是实现植物对环境和营养的适应反应的重要机制，因此对植物蛋白磷酸化的检测具有重要的意义。
近年来，人们提出了许多植物蛋白磷酸化的检测方法，包括免疫结合法、质谱法、生物膜片法和酶联免疫吸附实验等。
蛋白质磷酸化检测方法
蛋白质磷酸化检测方法蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号转导过程，对于细胞的生命周期、增殖、分化和凋亡等过程起着关键的调控作用。
因此，研究蛋白质磷酸化具有重要的生物学意义。
本文将介绍蛋白质磷酸化的检测方法。
蛋白质磷酸化是通过将磷酸基团与蛋白质分子中的特定氨基酸残基（通常是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）发生酯化反应而实现的。
磷酸化事件的发生可以改变蛋白质的构象、电荷和亲和性，从而调控蛋白质的功能。
因此，准确、高效地检测蛋白质磷酸化状态对于揭示细胞信号转导网络的正常功能和疾病机制具有重要意义。
常用的蛋白质磷酸化检测方法主要包括免疫印迹、质谱分析和磷酸化特异性抗体法。
免疫印迹是一种常用的蛋白质磷酸化检测方法，它利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过二抗与特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色方法来检测特定蛋白质的磷酸化状态。
这种方法操作简便、成本低廉，可以检测多个磷酸化位点。
然而，免疫印迹方法受到抗体的特异性和灵敏度的限制，且无法确定磷酸化的具体位点。
质谱分析是一种高度灵敏的蛋白质磷酸化检测方法，它基于质谱仪对蛋白质及其修饰产物的质量和电荷进行精确测量。
质谱分析可以通过直接检测磷酸化肽段的质量来确定蛋白质的磷酸化位点。
这种方法可以同时检测多个磷酸化位点，并且能够鉴定未知的磷酸化位点。
但是，质谱分析方法需要复杂的样品前处理和数据分析，操作技术要求较高，对设备和实验条件也有一定要求。
磷酸化特异性抗体法是一种基于特异性抗体识别磷酸化氨基酸残基的蛋白质磷酸化检测方法。
该方法利用磷酸化特异性抗体与磷酸化蛋白质结合，然后通过二抗与特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色方法来检测特定蛋白质的磷酸化状态。
与免疫印迹相比，磷酸化特异性抗体法可以准确地确定磷酸化的位点。
但是，该方法也受到抗体的特异性和灵敏度的限制。
除了上述常用的蛋白质磷酸化检测方法之外，还有一些新兴的技术在蛋白质磷酸化研究中得到了广泛应用。
例如，蛋白质芯片技术可以同时检测上千个蛋白质的磷酸化状态，从而在大规模的磷酸化研究中发挥了重要作用。
磷酸化蛋白质分析方法：解读蛋白质磷酸化的奥秘
磷酸化蛋白质分析方法：解读蛋白质磷酸化的奥秘磷酸化是一种常见的蛋白质修饰形式，通过添加磷酸基团调控蛋白质的功能和活性。
磷酸化蛋白质的分析对于了解细胞信号转导和蛋白质功能调控机制至关重要。
本文将深入探索磷酸化蛋白质分析方法的原理和应用，介绍一种利用新技术进行磷酸化蛋白质分析的方法，揭示磷酸化对蛋白质功能调控的重要性。
【磷酸化蛋白质分析方法】。
磷酸化蛋白质分析方法包括多种技术，以下将介绍其中几种常用的方法。
1.免疫印迹：免疫印迹是一种常见的磷酸化蛋白质分析方法。
该方法利用特异性抗体与磷酸化蛋白质结合，通过可视化方法检测磷酸化修饰的存在和程度。
免疫印迹需要将蛋白样品进行电泳分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体来探测磷酸化修饰。
通过比较磷酸化和非磷酸化蛋白质的信号强度，可以评估磷酸化的程度。
2.质谱分析：质谱分析是一种高分辨率的磷酸化蛋白质分析方法。
该方法通过质谱仪对蛋白样品进行离子化和分析，鉴定和定量磷酸化修饰的存在。
常用的质谱方法包括质谱图谱和定量质谱。
质谱图谱通过比对已知标准或数据库来鉴定修饰的位置和类型。
定量质谱通过比较磷酸化和非磷酸化蛋白质的峰强度，定量测定修饰的相对丰度。
3.磷酸化特异性酶切：磷酸化特异性酶切是通过使用具有磷酸化修饰位点的酶来切割磷酸化蛋白质，从而确定磷酸化修饰的位置和程度。
该方法使用磷酸化特异性的酶将磷酸化蛋白质切割成特定的片段，然后可以通过质谱分析等方法对这些片段进行进一步分析。
图1。
【利用新技术实现磷酸化蛋白质分析】。
最近，一种利用新技术进行磷酸化蛋白质分析的方法被开发出来，具有更高的灵敏度和分辨率。
这种方法基于磷酸化修饰对蛋白质的电荷和结构的影响，利用电化学和质谱等技术来实现磷酸化蛋白质的检测和鉴定。
该方法可以通过分析蛋白质样品中的电流信号或质谱图谱，确定磷酸化修饰的位置和程度。
磷酸化蛋白质分析方法是揭示蛋白质功能调控机制的重要工具。
通过免疫印迹、质谱分析、磷酸化特异性酶切和利用新技术实现的方法，可以准确测定和解读蛋白质中磷酸化修饰的存在和程度。
磷酸化蛋白检测5种方法大PK，究竟谁是第一名？
磷酸化蛋白检测5种方法大PK，究竟谁是第一名？追溯蛋白磷酸化的发现历程，必须提到的是1930 年科里夫妇在糖代谢的研究中首次发现两种不同形式的磷酸化蛋白。
然而，这个发现沉寂多年，直到1954 年，好基友Fischer 和Krebs 再次开展深入研究，才发现蛋白的磷酸化和去磷酸化，并凭此获得 1992 年的诺贝尔奖。
磷酸化蛋白对细胞通路的重要性毋庸赘述，这种关键的翻译后修饰参与广泛的细胞活动调节，包括细胞周期、细胞分化、代谢和神经元通讯等。
蛋白磷酸化的异常也与众多疾病相关，是疾病机理研究的重要研究方向。
而在检测蛋白磷酸化时，有众多方法可供选择，本文就来帮大家盘一盘各种方法的特色。
激酶活性测定蛋白激酶将磷酸基团从ATP 转移到底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，即发生蛋白的磷酸化，直接影响靶标的活性和功能。
因此，评估单个特异性激酶的活性可为通路解析提供有价值的信息。
要测量生物样品中的激酶活性，常规方法是添加ATP，并将免疫沉淀的激酶与外源底物在体外共同孵育，最后通过比色、放射标记、荧光检测等报告系统测量磷酸化底物。
R&D Systems®能提供非放射性通用激酶活性试剂盒，用于定量分析任何可产生ADP 的激酶活性（货号 EA004）。
通用激酶活性试剂盒检测原理上述方法可以了解特定激酶的作用，但对磷酸化蛋白的揭示较少，且体外活性测定无法准确解析潜在的内源性磷酸酶。
为直接研究蛋白的磷酸化，磷酸化抗体应运而生，并因此衍生出多种免疫学测定方法。
Western BlotWestern Blot 是评估蛋白磷酸化状态的常用方法，且大部分实验室具备开展该实验的条件。
用SDS-PAGE 分离生物样品，随后转移到膜（PVDF 或硝酸纤维素膜），采用磷酸化抗体鉴定目的蛋白的磷酸化水平。
由于磷酸化蛋白的检测结果可能随样本处理或操作误差而变化，研究人员通常用同一种蛋白的总表达水平作为参考，通过确定磷酸化蛋白和总蛋白的相对比值来反映磷酸化情况，判断信号通路是否被激活。
蛋白质磷酸化检测方法
蛋白质磷酸化检测方法
蛋白质磷酸化检测方法是一种用于检测蛋白质磷酸化状态的技术。
磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，它可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响细胞的生理过程。
因此，磷酸化状态的检测对于研究细胞信号转导、疾病发生机制等方面具有重要意义。
常用的蛋白质磷酸化检测方法主要包括免疫印迹、质谱分析和荧光探针等。
其中，免疫印迹是最常用的方法之一。
该方法利用特异性抗体识别磷酸化蛋白质，通过蛋白质电泳和转膜技术将蛋白质分离并转移到膜上，然后用抗体检测磷酸化蛋白质的存在。
这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，但需要较多的蛋白质样品和抗体。
质谱分析是一种高通量的蛋白质磷酸化检测方法。
该方法利用质谱仪对蛋白质样品进行分析，可以同时检测多个蛋白质的磷酸化状态。
质谱分析具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，但需要较高的技术水平和设备支持。
荧光探针是一种新兴的蛋白质磷酸化检测方法。
该方法利用荧光探针与磷酸化蛋白质结合，通过荧光信号检测磷酸化蛋白质的存在。
荧光探针具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，但需要较高的荧光探针合成和标记技术。
蛋白质磷酸化检测方法是研究细胞信号转导、疾病发生机制等方面
的重要工具。
不同的检测方法各有优缺点，需要根据具体实验需求选择合适的方法。
未来，随着技术的不断发展，蛋白质磷酸化检测方法将会更加灵敏、高通量、高分辨率，为细胞生物学和医学研究提供更多的帮助。
磷酸化蛋白质组如何鉴定
磷酸化蛋白质组如何鉴定磷酸化蛋白质（Phosphorylated protein）是指在特定氨基酸残基上附加了一个磷酸基团（PO4）的蛋白质。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，可以调节蛋白质的结构、功能和相互作用，进而控制细胞的信号转导、代谢和增殖等生物学过程。
因此，鉴定磷酸化蛋白质组对于理解蛋白质调控网络具有重要意义。
本文将介绍几种常用的磷酸化蛋白质组鉴定方法。
一、质谱法质谱法是目前最常用的鉴定磷酸化蛋白质组的方法之一，主要分为两种：质谱分析前磷酸化富集和质谱分析后磷酸化识别。
1.质谱分析前磷酸化富集质谱分析前磷酸化富集主要包括亲和富集、非亲和富集和凝胶富集等。
亲和富集是利用特定亲和剂与磷酸化蛋白质结合，然后用洗脱剂将磷酸化蛋白质洗脱出来进行质谱分析。
常用的亲和剂有磷酸化特异性抗体、磷酸化结合结构域和亲和岛等。
非亲和富集是利用质谱分析前的蛋白质化学改变，如巯基化、新生代谢标记等来增加磷酸化蛋白质的质谱分析信号，进而富集磷酸化蛋白质。
凝胶富集是将细胞提取物先进行电泳分离，然后使用聚焦法将不同等电点区域的蛋白质提取，再进行质谱分析。
2.质谱分析后磷酸化识别质谱分析后磷酸化识别主要通过质谱数据分析软件来鉴定磷酸化位点。
质谱分析常用的方法包括肽段质谱法、质谱配对法和磷酸化肽酶法等。
其中，肽段质谱法是将蛋白质经酶切分解成肽段后进行质谱分析，通过质谱数据分析鉴定磷酸化位点；质谱配对法是对酶切后的肽段进行残基识别和质谱数据匹配，进而确定磷酸化位点；磷酸化肽酶法是酶切肽段后通过特定的肽酶去除非磷酸化肽段，进而富集磷酸化肽段进行质谱分析。
二、免疫化学检测法免疫化学检测法是利用抗体与磷酸化蛋白质特异性结合，并使用标记物进行检测的方法。
常用的免疫化学检测方法有免疫印迹、免疫荧光和免疫组化等。
1.免疫印迹免疫印迹是利用抗体与磷酸化蛋白质特异性结合，然后使用辅助抗体与标记物结合，通过酶学反应或化学发光的方式检测磷酸化蛋白质的存在。
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检测蛋白磷酸化的六种方法及其优缺点实验生物在线蛋白激酶将磷酸基团从ATP转移到蛋白多肽底物上的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，直接影响目标的活性和功能。
放射性研究表明，真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰。
这一关键的翻译后修饰调控了广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯。
此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。
在评估磷酸化时，选择的方法可能会有所不同，这取决于多个因素，包括提出的具体问题以及特殊仪器或试剂的可用性。
如何检测蛋白磷酸化，本文简要介绍了几种常用方法，并提出了每种方法的优点和缺点。
激酶活性分析蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分，它们影响了众多负责生物反应的下游效应物，因此，评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。
生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。
之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。
此外，R&D Systems还提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能够定量任何可产生ADP的激酶的活性。
尽管我们能够获得有关特定激酶行为的信息，但评估细胞提取物中的酶活性仅仅揭开了信号通路的冰山一角。
我们对蛋白如何被修饰还知之甚少，且体外活性分析也不能说明内源磷酸酶活性的潜在作用。
磷酸化蛋白的直接检测可能为细胞如何应对外界刺激提供更详细的分析，因为磷酸化肽段的鉴定为蛋白的表达和功能状态提供信息。
磷酸化特异抗体的开发直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。
这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。
其他传统方法包括2D凝胶电泳，这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。
鉴于这些方法很费力，磷酸化依赖抗体的开发受到研究人员的极大欢迎。
1981年，第一个有记录的磷酸化抗体在兔子中产生，使用的是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸结合物。
这一抗体广泛地识别了包含磷酸酪氨酸的蛋白。
十年后，利用合成的磷酸化肽段来免疫兔子，开发出多个磷酸化状态特异抗体，这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。
之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中，产生高度特异的免疫试剂。
磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。
在任何技术中使用磷酸化特异抗体的忠告是，成功的检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。
western BlotWestern blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，大部分细胞生物学实验室都拥有开展这些实验的设备。
利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
典型的Western blot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。
许多磷酸化特异抗体十分灵敏，可轻松检测常规样品(如10-30 μg细胞提取物)中的磷酸化蛋白。
由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。
化学发光和显色法都很常用，而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。
酶联免疫吸附分析(ELISA)ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。
ELISA的定量能力优于Western blot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。
这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。
随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。
加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。
这些分析通常设计为显色或荧光检测。
产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。
首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。
其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。
第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。
最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。
ELISA通常带来了激酶活性的间接测定。
不过，另一类ELISA技术使用固定化的捕获抗体、底物和磷酸化底物的检测方法，带来激酶活性的更直接测定。
基于细胞的ELISA尽管体外生物化学激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假说检验和药物筛选，但它们无法复制细胞内的环境。
分析完整细胞内的蛋白磷酸化也许能更准确地代表特定信号通路网络的状态。
一些免疫分析最近被开发出来，能够在完整细胞的背景下测定蛋白磷酸化。
细胞在同一个孔中被刺激、固定和阻断。
使用磷酸化特异抗体，利用荧光或显色检测系统来评估磷酸化状态。
此外，在微孔板的同一个孔中同时检测磷酸化蛋白和总蛋白。
因此，来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，并比较多个样品，与传统免疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。
这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要，因此更适合高通量分析。
细胞内流式细胞术和ICC/IHC传统的细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学(ICC/IHC)是检测磷酸化事件的有力工具。
流式细胞仪利用激光来激发用于抗体检测的荧光染料。
在评估同一个细胞中的多个蛋白时，必须精心选择滤光片组合和荧光染料，其光谱不能重叠。
流式细胞术很有优势，因其实现了快速、定量的单细胞分析。
通过细胞表面标志的分型可检测异质群体中特定细胞类型的蛋白，而无需在物理上分离细胞。
通过这种方法可分析稀有的细胞群体，而不用担心细胞损失或细胞分选过程中可能发生的蛋白表达变化。
ICC通常指的是利用显微镜对培养细胞中的蛋白进行检测，而IHC 指的是对完整组织切片中的蛋白进行检测。
与流式细胞术相似，这些技术实现了细胞或组织内多个蛋白的评估，只是要足够重视，避免荧光光谱或颜色的重叠。
荧光和显色检测技术都经常使用。
与监控磷酸化的其他形式不同，ICC通常是确定细胞内定位的首选方法。
流式细胞术和ICC/IHC都需要高亲和力、高特异性的抗体、阻断步骤、对照和抗体滴定，以避免因非特异性结合而带来的不明确结果。
通过流式细胞术和ICC来检测磷酸化蛋白要求蛋白是稳定的，且抗体能够接近。
细胞通常经过刺激，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交联磷酸化蛋白，使其稳定，便于分析。
固定后的细胞必须经过透化处理，让磷酸化特异抗体可进入细胞。
对于不同的亚细胞定位，通常使用不同的透化技术。
温和的去垢剂可实现细胞质蛋白的检测，而抗体要想接近核蛋白，可能需要使用酒精。
酒精透化也可增强磷酸化特异抗体的磷酸化蛋白检测，因酒精具有变性的特点。
质谱复杂的生物样品(如细胞裂解液)中蛋白质磷酸化的全面评估(磷酸化蛋白质组学)对于了解基于磷酸化的信号网络很重要。
复杂的蛋白混合物中大规模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定，以及磷酸化残基的测序。
质谱(MS)技术是完成这些任务的有用工具。
尽管质谱在鉴定单个蛋白上具有出色的灵敏度和分辨率，但对于磷酸化蛋白的分析，还有一些固有的困难。
首先，磷酸化肽段的信号通常较弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。
其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。
为了克服这些缺点，人们已经开发出一些富集策略，包括固定化金属亲和层析(IMAC)、磷酸化特异抗体富集、化学修饰法(如磷酸化丝氨酸和苏氨酸的β-消去反应)，以及用生物素化的基团取代磷酸基团。
多个分析物图谱分析质谱技术如碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD)，提供了肽段序列和翻译后修饰(磷酸化)的全面平行分析。
这些技术相当费力，而当特定通路作为主要研究目标时，可能不需要全面的磷酸化分析策略。
这导致一些同时测定多个分析物的蛋白磷酸化的新方法被开发出来。
总的来说，这些方法涉及到磷酸化特异抗体的使用，包括基于微孔板、磁珠和膜，基于磁珠和基于膜的检测形式。
这些分析最明显的好处在于通量能力被大大提高，避免了运行多个Western blot或传统的ELISA分析的需要。
这些技术也能够提供更多的数据，而所需的样品量极少。
相应地，蛋白图谱分析通常被认为灵敏度不及传统的对应技术，因潜在的抗体交叉反应性。
磷酸化蛋白多重分析新的基于微孔板的Proteome Profiler 96 Phospho Antibody Arrays特点· 高达16个分析物/孔· 3小时的快速分析时间· 低的样品量要求· 化学发光和近红外检测· 易于高通量结论评估蛋白磷酸化往往是细胞生物学家保留曲目中必不可少的一部分，可了解引起细胞活性的细胞内因子。
考虑到激酶扮演的重要角色，研究人员必须要有优质的工具，才能测定蛋白磷酸化和/或激酶活性。
每种技术在不同的背景下发挥优势，因此必须精心挑选最适合实验设计的方法(表1)。
这篇综述简要介绍了一些评估蛋白磷酸化的最常用方法。
由于需求在不断增长，方法也在不断改善，让研究人员能够更深入地了解这些复杂而重要的过程，最终控制细胞功能。