微生物发酵法生产透明质酸
透明质酸发酵工艺原理综述
透明质酸发酵工艺原理综述引言透明质酸是一种重要的天然高分子化合物，具有优异的生物活性和生理功能。
近年来，随着人们对健康和美容的关注度逐渐提高，透明质酸在医学、化妆品和食品等领域的应用日益广泛。
为了满足市场需求，在透明质酸的生产中，发酵工艺被广泛应用。
本文将对透明质酸发酵工艺的原理进行综述。
透明质酸发酵工艺的基本原理透明质酸发酵工艺是指利用微生物发酵代谢途径生产透明质酸。
发酵是一种基于微生物代谢活动的生物转化过程，其中微生物利用可再生资源合成有用产物。
透明质酸发酵工艺的基本原理可以概括如下：1.选择合适的微生物菌株：发酵过程中使用的微生物菌株是决定透明质酸产量和质量的关键因素。
常用的菌株包括发酵霉菌、乳酸杆菌和葡萄球菌等。
2.提供合适的培养基：微生物菌株需要适当的培养基来生长和合成透明质酸。
培养基中的营养物质包括碳源、氮源、无机盐、维生素和生长因子等。
3.发酵条件的调控：透明质酸的产量和质量受到发酵条件的影响。
调整发酵温度、pH值、搅拌速度和氧气供应等参数，可以达到最佳的发酵效果。
4.生物反应工程的应用：生物反应工程技术可以优化透明质酸发酵工艺，提高产量和纯度。
调控物质的输送、床层颗粒大小和固体浸泡比等参数可以改善反应过程。
透明质酸发酵工艺的主要步骤透明质酸发酵工艺通常包括以下主要步骤：1.复苏和预培养：从冷冻保存的透明质酸菌株中取出适量的菌种，进行复苏和预培养。
这个步骤有助于提高菌株的活力和适应性。
2.母液发酵：将预培养的菌种移植到透明质酸发酵的母液中，通过合适的培养条件进行发酵。
发酵过程中，菌株利用底物合成透明质酸。
3.分离和纯化：发酵母液中的透明质酸需要进行分离和纯化，以得到高纯度的透明质酸产品。
常用的分离纯化方法包括沉淀、离心、浓缩和脱盐等。
4.后处理：对纯化的透明质酸产品进行后处理，包括干燥、打粉和包装等步骤。
这些步骤可以提高透明质酸产品的稳定性和使用便利性。
透明质酸发酵工艺的优缺点透明质酸发酵工艺具有如下优点：1.生物可再生资源：透明质酸发酵工艺利用微生物代谢活动合成透明质酸，减少了对传统化石能源的依赖。
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况作者：李萌季永甜等来源：《湖北农业科学》2013年第13期摘要：透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的高分子黏多糖，广泛地存在于动物组织中，具有独特的生理特性，在许多领域得到广泛的应用。
目前，透明质酸的生产方法主要有提取法、微生物发酵法和人工合成法。
对微生物发酵法进行了概述，对透明质酸在化妆品、保健品和医学医疗领域的应用进行了简要介绍，并对透明质酸的生产和应用前景进行了展望。
关键词：透明质酸；微生物发酵法；育种中图分类号：Q538；TQ920 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-2980-04透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是1934年Meyer等从牛眼玻璃体中提取分离得到的一种大分子多糖，故又名玻璃酸[1]。
透明质酸是由2 000～25 000个通过β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替地结合在一起的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的均匀重复的线性葡糖胺聚糖[2]。
透明质酸是胞外基质（Extracellular matrix， ECM）的重要组成部分[1]。
近来的研究表明，透明质酸不仅广泛存在于细胞间的胞外基质中，还存在于细胞内，主要集中分布在新生细胞的胞浆和细胞核中[2]。
除了在玻璃体中外，透明质酸在关节滑液和表皮细胞间隙中的含量也十分丰富，从数量上看，50%以上的透明质酸存在于皮肤的真皮和表皮中，约35%存在于肌肉和骨骼中。
目前认为透明质酸主要是存在于软结缔组织中的惰性空间填料中，在组建蛋白多糖复合物的过程中起着重要的作用[2]。
1 透明质酸的性质在电子显微镜下，观察到透明质酸分子呈线性单链结构，并在水溶液中扩展成随机的线圈状结构，线圈的直径约为500 nm。
透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离，形成阴离子，等空间距离阴离子之间的相互排斥使其分子在水溶液中处于松散的扩展状态，占据了大量空间，故可结合多于本身1 000倍的水[3]。
透明质酸的合成
透明质酸的合成透明质酸是一种广泛应用于医药、化妆品、食品等领域的高分子化合物，其分子结构特殊，具有优异的生物相容性、生物可降解性和生物活性，因此备受青睐。
透明质酸的合成方法有多种，其中最常用的是通过微生物发酵法合成。
微生物发酵法是利用微生物进行发酵反应合成透明质酸的方法。
透明质酸的生物合成通常由Streptococcus zooepidemicus菌株完成。
这种菌株在适宜的培养条件下，发酵时可产生大量的透明质酸，产率高、成本低、产品纯度高，因此是目前最主要的透明质酸生产方法之一。
透明质酸的发酵生产分为两个阶段。
第一阶段是菌种培养，第二阶段是透明质酸的发酵。
在菌种培养阶段，首先要选择适合的培养基，加入适量的碳源、氮源、矿物质和生长因子，使菌株迅速增殖，生长到一定密度后，将菌种转移到透明质酸的发酵罐中。
透明质酸的发酵过程要控制好温度、pH值、氧气和营养物质的供给等因素，使菌株在最适的生长条件下进行发酵。
透明质酸的发酵主要是靠菌株的代谢产生，菌体在发酵过程中不断分裂增殖，同时菌体外分泌出透明质酸，通过透明质酸的积累，最终形成胶原蛋白。
透明质酸的发酵反应通常在30-40℃下进行，反应时间长达数天至数周。
透明质酸发酵结束后，要对发酵产物进行提取、纯化和干燥处理。
提取采用离心、过滤、沉淀等方法进行，将发酵产物中的透明质酸分离出来。
纯化则通过离子交换层析、凝胶过滤和透析等方法进行，去除杂质，提高产品纯度。
最后，干燥处理通常采用喷雾干燥法、真空干燥法等，将透明质酸制成粉状或颗粒状，便于储存和使用。
总之，透明质酸的合成是一个复杂的过程，需要掌握科学的生产技术和严格的生产工艺。
随着透明质酸在医药、化妆品、食品等领域的广泛应用，其需求量也越来越大，因此透明质酸的生产方法也在不断改进和优化，以提高产量、降低成本、提高产品质量，更好地满足市场需求。
透明质酸生产工艺
透明质酸生产工艺透明质酸（hyaluronic acid, HA）是一种在生物体内广泛存在的高分子聚糖，也是一种天然保湿因子。
透明质酸具有良好的保湿性能和生物相容性，因此被广泛应用于医药、化妆品和食品等领域。
下面将对透明质酸的生产工艺进行简要介绍。
透明质酸的生产可以通过两种途径进行：微生物发酵法和从鸡冠骨中提取法。
微生物发酵法是目前应用较广泛的生产透明质酸的方法。
此法首先需要选择适合发酵生产的微生物菌种，常用的包括链球菌属、肺炎球菌属、乳酸菌属等。
接种菌种后，培养基中添加适量的碳源、氮源和一些辅助物质，促进菌种的生长和透明质酸的合成。
发酵周期通常为3-7天，菌体生长后通过离心分离，获得含有透明质酸的菌体。
得到含有透明质酸的菌体后，需要将菌体溶解或微生物发酵粉未经溶解经部分酶解液化后进行提取。
提取透明质酸时，常用的方法包括水解提取法和碱液提取法。
水解提取法是先将菌体经过水解反应，使透明质酸脱落出来，然后通过离心或过滤等方式分离出透明质酸。
碱液提取法则是将菌体溶解于碱液中，然后经过沉淀、洗涤和离心等步骤获得透明质酸。
从鸡冠骨中提取透明质酸是另一种获得透明质酸的方法。
鸡冠骨中富含透明质酸，通过一系列的化学处理，可以将透明质酸从鸡冠骨中提取出来。
主要步骤包括去脂处理、酸解、碱化、沉淀和精制等过程。
无论是微生物发酵法还是从鸡冠骨中提取法，获得的透明质酸都需要经过后续的精制和纯化处理。
这些处理包括沉淀、过滤、离心、洗涤、浓缩和干燥等步骤，以获得高纯度的透明质酸产品。
总结起来，透明质酸的生产工艺包括微生物发酵法和从鸡冠骨中提取法。
微生物发酵法通过选择适合的菌种进行发酵，然后进行提取和纯化，得到透明质酸。
从鸡冠骨中提取法则是通过一系列化学处理步骤将透明质酸从鸡冠骨中提取出来，然后经过精制和纯化处理，得到高纯度的透明质酸产品。
以上是透明质酸生产的主要工艺简介。
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况
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第 ５ ２卷 第 １ ３期
湖 北 农 业 科 学
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Ｖ０ １ ． ５ ２ Ｎ ｏ ． １ ３
２ ０ １ ３年 ７ 月
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透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况
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微生物发酵法生产透明质酸
HA发酵过程中,添加表面活性剂可以增加细胞膜的 通透性,减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力; 使产生的荚膜HA易分泌至胞外,降低HA在细胞表面 的积累,从而有利于HA的合成。
在菌体的指数生长期和稳定期分别添加溶菌酶和 阳离子型表面活性剂CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）。
可能的工艺流程
菌种 诱变处理 培养液 发酵罐
微生物发酵法生产透 明质酸
课程：发酵工艺学
透明质酸简介
透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸， 是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种 组织细胞间质中，如皮肤（真皮层）、脐带、关 节滑液、软骨等。 透明质酸是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄 糖醛酸为结构单元的高分子粘多糖，商品透明质 酸一般为其钠盐形式。
化妆品
美容保健食品
HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前高档 护肤品、发用制品用量最大品种。
在日本，HA 从20 世纪90 年代开始用作具有美容作用的保 健食品，服用后可增加人体内HA 的合成，提高皮肤中HA 的 含量，使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。
目前生产HA的方法
目前的生产方法有提取法和微生物发酵法两种。
发酵法生产透明质酸与传统的动物组织提取法相 比 , 具有：生产规模不受动物原料限制； 发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化； 成本低, 易于形成规模化工业生产；④ 无动物 来源的致病病毒污染的危险等优点。 发酵法是目前工业生产透明质酸的主流，但其发 酵工艺还在继续完善中。
pH值：6.8～7.5 发酵终点：24 h
发酵方式
一步发酵法 由于链球菌的生长和透明质酸的生产受传代次数 影响比较大。 所以采用直接上发酵罐(5 m3)不用种子罐，即一 步发酵生产透明质酸，这样减少了传代次数有利 于菌种生长和生成透明质酸的产量。而且采用一 步发酵,不仅减轻了分析和发酵的劳动强度,而且 节省了种子罐的生产环节,减轻了染菌机率。
透明质酸合成
透明质酸合成
透明质酸是一种高度保湿的天然物质，被广泛用于化妆品和医疗领域。
透明质酸的化学名称是聚羟乙酸钠，它由葡萄糖氨基酸和葡萄糖醛酸两种单元结合而成，是一种高分子化合物。
透明质酸的合成一般是通过微生物发酵或化学合成来实现的。
微生物法最常用的微生物是类杆菌，其利用发酵过程中的代谢物合成透明质酸。
化学合成法则是利用乙烯基化合物或2-吡啶乙酰氯作为引发剂，以环氧乙烷或其它含有双键化合物作为单体，通过反应合成透明质酸。
透明质酸的合成需要考虑许多因素，包括单体选取、引发剂、反应条件等。
合成过程一般分为四个步骤：单体预处理、引发聚合、分离纯化和干燥。
其中分离纯化是非常关键的步骤，一般采用离子交换色谱、凝胶渗透色谱等方法进行分离。
总之，透明质酸的高效稳定的合成是化妆品和医疗领域的重要课题之一。
随着化学技术的不断发展，透明质酸的合成方法将逐渐得到改进和完善。
微生物发酵透明质酸的制备及测定_吕磊
16 4
药物生物技术
第 16 卷第 2 期
3.1.2 CPC 加入 量选 择 不 同 CPC 加入 量对 H A 粗品溶 液中糖醛酸 和蛋白质 含量的影 响 , 见 图 1。
3.5 相对分子质量的测定 根据比浓黏度 ηsp 与 HA 浓度的关系作图 , 该
回归曲线 与纵轴 的截距 为特 性粘度[ η] , 结果 见 图 3 , 根据公式 [ η] =3.6 ×10-4 Mr 0.78 , 平均相对分 子质量 M r 为 1.86 ×106 。
出了一种简单有效生产 HA 的分离纯化方法 , 即 采用过滤吸附法联用氯代十六烷基吡啶(CPC)分
2 实验方法
离纯化发酵液中的 H A , 其纯度 、蛋白质含量 、热原 值等符合医用标准[ 8] 。
2.1 分离纯化方法 兽疫链球菌发酵液[ 9] 离心去菌体 , 上清醇沉 ,
1 材料与仪器
沉淀溶解得粗品溶液 , 加入一定量的硅藻土 、活性 炭搅 拌均匀 吸附 , 过滤 , 加入 CP C , 离心 , 沉淀 溶
Fig 1 T he effect of CP C on co ntents o f g lucuronic acid and protein
3.1.3 乙醇加入量的选择 不同乙醇加入量对 H A 粗品溶液中糖醛酸含的影响 , 见图 2 。
Fig 3 T he relationship betw een ηsp/ c and c of H A
性黏度[
η]
, 并根据公式[
η]
=3.6
×10-4
M 0.78 r
计算
出平均相对分子质量 。 2.4.4 CPC 残留测定[ 13] 取样品溶液 1 m l , 按照 标准曲线的测定方法测定 590 nm 处的吸光度 , 从
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微生物发酵法生产透明质酸
郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。
透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。
1 透明质酸的发展
1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。
20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。
由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。
受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。
为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。
工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。
80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。
提取法和发酵法生产HA的比较见表1。
表1 提取法和发酵法生产HA的比较
项目提取法发酵法
存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖
形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易
分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大
价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg
应用价格昂贵，化妆品中的添加量
受到制约
能增加化妆品中的添加量
发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。
国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后
化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。
山东省生物药物研究院（原
山东省商业科技研究所）是国内最早从事HA研究开发的单位之一，1990
年该院郭学平等在国内首先开始HA的发酵生产研究，先后完成了小试和中
试实验。
发酵法生产HA的研究成功改变了我国HA生产技术的落后局面，
使我国HA的生产进入了新的发展时期。
2 化学结构及理化性质
HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛
酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，见图1。
图1
HA的结构非常规则，相同的双糖单位为HA的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性。
HA分子链的长度及分子量是不均一的，分子量范围为2×105～70×105，双糖单位数为300～11000对，属于生物大分子。
商品HA一般为钠盐形式，为白纤维状或粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂，药用级分子量为1.0×106～4.0×106，化妆品级为5×105～1.5×106。
HA水溶液最突出的特点是高黏度，这是由其结构所决定的。
HA具有很长的线性分子链，且分子链上等距离的葡糖醛酸上的羧基所带的负电荷相互排斥，使分子链呈伸展状态，而不卷缩成一团。
即使在较低浓度下，HA 分子间也有强烈的相互作用，因此具有很高的黏度，同时具有很好的润滑作用。
在水溶液中，HA分子链之间形成疏松的网状结构，能够结合并保持大量的水，即具有较强的保水作用。
HA在临床和化妆护肤方面的应用正是基于其高黏度、润滑性和保水性质。
阳离子可降低HA溶液的黏度，离子强度越高，黏度下降越多，二价阳离子降低HA溶液的黏度作用大于一价阳离子。
某些三价阳离子（如Fe3+）可使HA分子间发生交联，使溶液呈凝胶状，黏度大大增加。
多种物理和化学因素（如酸碱性、温度、透明质酸酶、紫外线、γ-射线等）可使HA大分
子降解，导致黏度下降。
在HA及其制剂的生产中，应尽量减少分子链的降解，保持其大分子特性。
3 HA的应用
3.1 医学方面
由HA制备的眼科制剂有手术用黏弹性辅助剂、滴眼剂、骨科制剂有关节腔注射液（用于补充关节滑液，治疗关节疼痛）等；另外，HA可促进创伤愈合，治疗烧伤；HA与化疗药结合，具有靶向引导作用，能引导药物进入肿瘤部位，杀灭癌细胞，减轻化疗副作用。
HA作为人体的基本物质，对其生理和药理作用的研究才开始，随着研究的深入，HA在医学方面的应用还会更加广泛。
3.2 化妆品
HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前高档护肤品、发用制品用量最大品种。
3.3 美容保健食品
在日本，HA从20世纪90年代开始用作具有美容作用的保健食品，服用后可增加人体内HA的合成，提高皮肤中HA的含量，使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。
4 HA的发酵生产方法
4.1 发酵法工艺过程
取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液的锥型瓶中，在37℃下培养12 h～16h, 接种于种子罐中。
培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖，于37℃搅拌培养12 h～16h，接种于发酵罐中，接种比例1：
10。
发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%～6%。
维持通气量0.3 vvm～1.0vvm（每分钟相对于单位发酵体积的通气量），搅拌转速120rpm，37℃发酵40 h～46h。
在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，需调pH= 6.5～7.0。
发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
发酵结束，用三氯乙酸调pH=4.0～4.5,板框过滤除菌体，滤液调pH=6.0～6.5,加3倍体积的95％乙醇，沉淀出HA。
用与发酵体积相同的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解沉淀，在搅拌下，加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀，静置，虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠溶液洗涤沉淀两次。
于发酵体积的0.4mol/L氯化钠溶液中搅拌解离过夜，过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA。
4.2 工艺说明与讨论
链球菌的营养需求较高，通常要求培养基中含血清、小牛肉浸出液、脑心浸出液等，但这类营养物质价格昂贵，大规模生产中用其作为培养基，成本太高。
所以在选择菌种时，要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题。
发酵生产HA所用的培养基，氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等；碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖；其他还有磷酸盐、硫酸盐，钾、钠、钙、镁等无机盐，以及铁、锰、铜、锌等微量元素。
链球菌属于兼性厌氧菌。
在HA的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵。
也有的采用厌氧发酵。
根据HA生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是合成HA的两个活化前提物（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖）所必需的物质。
因此从代谢调
控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。
通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致HA的机械降解。
在HA的发酵过程中,pH值是一个重要的因素，一般控制在6.0～8.5范围内。
链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸的总量远大于HA，需用碱液进行中和，以维持适当的pH值。
发酵液中的HA在菌体外的溶液中游离存在，进行下游分离纯化时，首先杀灭和除去发酵液中的菌体，通常加入杀菌剂或加热到75℃～80℃进行灭菌，最常用的杀菌剂为三氯乙酸和阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）HA的含量较高时，发酵液的黏度很高，直接过滤或离心除菌体非常困难，需要先进行稀释。
除菌体后的清液，经乙醇沉淀、氯仿处理、CPC 沉淀、离子交换、超滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥或冷冻干燥制得HA精品。
目前国内HA的发酵产率为4 g/L～6g/L，国际先进的HA发酵产率为6 g/L～7g/L。
发酵法是HA生产的发展方向，应从提高产率、提高产品分子量和分离纯化技术方面进一步深入研究。
[原文发表于：精细与专用化学品，2002，3（4）：21～22]。