发酵法生产透明质酸HA的分离和纯化
微生物发酵法生产透明质酸
透明质酸的应用及市场价值
医学方面
由 HA 制备的眼科制剂有手术用黏弹性辅助剂、滴眼剂、 骨科制剂有关节腔注射液（用于补充关节滑液，治疗关节 疼痛）等；另外，HA 可促进创伤愈合，治疗烧伤；HA 与 化疗药结合，具有靶向引导作用，能引导药物进入肿瘤部 位，杀灭癌细胞，减轻化疗副作用。
化妆品
HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前 高档护肤品、发用制品用量最大品种。
生物方法：活性污泥、生物膜、污水 灌溉等
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微生物发酵法产HA的原理
链球菌多用于发酵产HA。在链球菌菌体周围有荚 膜，主要成分为HA，以保护细菌免受伤害。
链球菌属于兼性厌氧菌。在HA的发酵工艺中，根 据HA生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢 可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是 合成HA的两个活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和 UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢 调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。
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高产菌株的选育
发酵生产透明质酸所用的菌种,一般是将产 生透明质酸的链球菌进行诱变处理得到,诱 变方法有紫外线照射、化学诱变剂处理等。 然后筛选高产的菌株用于工业生产。
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工艺流程
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无菌空气制备设备
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设备的清洗
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废弃物的处理
物理方法：沉淀、过滤、离心分离、 反渗透等
化学方法：混凝法、化学沉淀、电渗 析等
微生物发酵法生产透明 质酸
小组成员：王志星、王平、饶旻昱
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透明质酸简介
透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃 酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎 动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐 带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、 鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、 公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。 透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之 称。
透明质酸发酵工艺原理综述
透明质酸发酵工艺原理综述引言透明质酸是一种重要的天然高分子化合物，具有优异的生物活性和生理功能。
近年来，随着人们对健康和美容的关注度逐渐提高，透明质酸在医学、化妆品和食品等领域的应用日益广泛。
为了满足市场需求，在透明质酸的生产中，发酵工艺被广泛应用。
本文将对透明质酸发酵工艺的原理进行综述。
透明质酸发酵工艺的基本原理透明质酸发酵工艺是指利用微生物发酵代谢途径生产透明质酸。
发酵是一种基于微生物代谢活动的生物转化过程，其中微生物利用可再生资源合成有用产物。
透明质酸发酵工艺的基本原理可以概括如下：1.选择合适的微生物菌株：发酵过程中使用的微生物菌株是决定透明质酸产量和质量的关键因素。
常用的菌株包括发酵霉菌、乳酸杆菌和葡萄球菌等。
2.提供合适的培养基：微生物菌株需要适当的培养基来生长和合成透明质酸。
培养基中的营养物质包括碳源、氮源、无机盐、维生素和生长因子等。
3.发酵条件的调控：透明质酸的产量和质量受到发酵条件的影响。
调整发酵温度、pH值、搅拌速度和氧气供应等参数，可以达到最佳的发酵效果。
4.生物反应工程的应用：生物反应工程技术可以优化透明质酸发酵工艺，提高产量和纯度。
调控物质的输送、床层颗粒大小和固体浸泡比等参数可以改善反应过程。
透明质酸发酵工艺的主要步骤透明质酸发酵工艺通常包括以下主要步骤：1.复苏和预培养：从冷冻保存的透明质酸菌株中取出适量的菌种，进行复苏和预培养。
这个步骤有助于提高菌株的活力和适应性。
2.母液发酵：将预培养的菌种移植到透明质酸发酵的母液中，通过合适的培养条件进行发酵。
发酵过程中，菌株利用底物合成透明质酸。
3.分离和纯化：发酵母液中的透明质酸需要进行分离和纯化，以得到高纯度的透明质酸产品。
常用的分离纯化方法包括沉淀、离心、浓缩和脱盐等。
4.后处理：对纯化的透明质酸产品进行后处理，包括干燥、打粉和包装等步骤。
这些步骤可以提高透明质酸产品的稳定性和使用便利性。
透明质酸发酵工艺的优缺点透明质酸发酵工艺具有如下优点：1.生物可再生资源：透明质酸发酵工艺利用微生物代谢活动合成透明质酸，减少了对传统化石能源的依赖。
透明质酸的分离纯化
小结
从发酵液中分离纯化HA 往往是由多种分离纯化方法联合完成的，单一的分离 纯化方法并不能达到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存在一定的局限 性。 如：在乙醇分离法中，乙醇用量是HA 溶液体积的2 倍，当用于大规模生产时 处理量非常大，进行乙醇分离的车间及设备要采取防爆措施，这势必增加了操作的 危险性和生产成本，因此尚需找到一个替代或减少乙醇用量的更好的方法。 又如：CPC、CTAB 等季铵盐用于直接沉淀发酵液，用量大，成本高，也容易 引起其它多糖和蛋白质的沉淀，影响产品纯度。 因此，只有根据制备目标选择适宜的分离纯化方法，并对工艺过程进行优化， 才能获得高纯度、高分子量的HA。
微生物发酵法
生物发酵法具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等特点， 是今后研究开发的方向。发酵法采用的菌种多为兽疫链球菌、马链球菌等， 基因工程菌发酵也见诸报道。利用微生物发酵法生产HA ,其产品的质量和数 量主要取决于三个方面:一是菌种的选育,二是培养基的优选及发酵工艺的优 化,三是HA 的分离纯化。
壳聚糖分离利用壳聚糖带相反电荷的吸附作用将ha分离下来的方法纯化工艺季铵盐纯化酶解纯化过滤法纯化离子交换层析纯化凝胶过滤柱层析纯化季铵盐纯化氯化十六烷基吡啶cpc是一种季铵盐类阳离子表面活性剂它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀而在高浓度的盐溶液中逐渐解离引起ha与cpc复合物解离所需的盐浓度远比其它黏多糖与cpc复合物解离所需浓度要低利用此性质可达到纯化ha的目的
预处理
预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。 对于一些非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以 杀灭透明质酸酶，减少HA 分子量的降低。 杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯 仿等。 通过有效除菌可以改善分离效果，使HA 分离得率提高，同时也可以去除 部分杂蛋白。
发酵液中分离提纯透明质酸
发酵液中分离提纯透明质酸作者：张凯来源：《科技资讯》2012年第07期摘要：透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质，因此需要分离纯化。
只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效用，但是分离纯化的方法却多种多样。
目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等，而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。
因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离纯化方法。
关键词：透明质酸多糖发酵分离提纯过滤凝胶层析离子交换中图分类号：Q53文献标识码：A文章编号：1672-3791（2012）03（a）-0000-00透明质酸( Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸，是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。
HA具有许多天然多糖共有的性质：呈白色，为无定形固体，无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。
它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域[1]。
1分离提纯透明质酸发酵法生产的HA 具有分离精制容易，保湿性强，品质稳定，产量大等优点，目前已得到广泛使用，并已成为研究 HA生产的主要方向。
由于微生物发酵液中提取的透明质酸粗品都含有菌体，杂蛋白、核酸等杂质，需要进一步分离纯化。
以下简单介绍几种工业上常用的发酵液中透明质酸的分离提纯的方法：1.1过滤法过滤法分离纯化发酵液中的HA是一种简单有效并可以规模化生产HA的分离纯化方法，可以有效地除去菌体和杂蛋白，对分子量的影响相对较小。
邓禹等[2]采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以发酵液质量1.2% 的混合硅藻土为过滤助剂，过滤温度为 60℃，pH 为7.0的透明质酸发酵液预处理工艺，完全去除了透明质酸发酵液中的菌体和蛋白质等杂质。
采用这一工艺得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%，蛋白质含量仅为0.047%，分子量为190万，提取收率为 91.3%。
发酵液中透明质酸的分离纯化方法
发酵液中透明质酸的分离纯化方法摘要: 微生物发酵法是生产透明质酸的主要方法，透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质[1],分离纯化是发酵法制备高分子量、高纯度透明质酸的关键环节，因此需要分离纯化。
只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效用,但是分离纯化的方法却多种多样。
目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等,而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。
因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离纯化方法。
本文探讨了透明质酸发酵液的特性和分离纯化过程中工艺条件对透明质酸分子量和结构的影响[2]，对预处理、分离、纯化各阶段的工艺方法进行了系统比较和分析[3]，指出了透明质酸分离纯化工艺中存在的问题，并提出了今后分离纯化研究的重点关键词:透明质酸;发酵液;分离纯化工艺一、透明质酸介绍透明质酸(Hyaluronic acid,简称HA)又名玻璃酸,是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。
HA具有许多天然多糖共有的性质:呈白色,为无定形固体,无臭无味,有强吸湿性,溶于水,不溶于有机溶剂。
它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域。
二、透明质酸的作用1、在临床医学方面(1)眼科由于透明质酸分子为高分子化合物,不具抗原性,不致敏,不发生免疫反应,无热原性,无色透明,无胶质渗透作用,具有高赫性和高弹性,理化性质稳定透明质酸可广泛的应用于滴眼液、干眼病的治疗、青光眼的手术、白内障的手术、泪道探通术和一些眼外伤手术[4]。
(2)骨科HA在骨科领域主要应用在关节疾病中。
[5]HA是构成关节软骨和滑液的主要成分,关节中的HA主要是由滑膜细胞及单核吞唆细胞合成[6]。
(4)药物透明质酸与甲壳素制成缓释、控释材料既具有透明质酸的豁膜薪附作用,同时有甲壳素的渗透促进效果[7,8]。
它们联合使用在体外试验中表现出缓释和促进药物吸收利用的特点[9,10,11]2、在化妆中的应用透明质酸具有特殊的保水作用,高分子量的透明质酸最多可以持水6L/g,因而是一种理想的天然保湿因子。
发酵液中分离提纯透明质酸
发酵液中分离提纯透明质酸摘要:透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质,因此需要分离纯化。
只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效用,但是分离纯化的方法却多种多样。
目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等,而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。
因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离纯化方法。
关键词:透明质酸多糖发酵分离提纯过滤凝胶层析离子交换透明质酸(Hyaluronic acid,简称HA)又名玻璃酸,是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。
HA 具有许多天然多糖共有的性质:呈白色,为无定形固体,无臭无味,有强吸湿性,溶于水,不溶于有机溶剂。
它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域[1]。
1 分离提纯透明质酸发酵法生产的HA具有分离精制容易,保湿性强,品质稳定,产量大等优点,目前已得到广泛使用,并已成为研究HA生产的主要方向。
由于微生物发酵液中提取的透明质酸粗品都含有菌体,杂蛋白、核酸等杂质,需要进一步分离纯化。
以下简单介绍几种工业上常用的发酵液中透明质酸的分离提纯的方法。
1.1 过滤法过滤法分离纯化发酵液中的HA是一种简单有效并可以规模化生产HA的分离纯化方法,可以有效地除去菌体和杂蛋白,对分子量的影响相对较小。
邓禹等[2]采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀,以发酵液质量 1.2%的混合硅藻土为过滤助剂,过滤温度为60℃,pH为7.0的透明质酸发酵液预处理工艺,完全去除了透明质酸发酵液中的菌体和蛋白质等杂质。
采用这一工艺得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%,蛋白质含量仅为0.047%,分子量为190万,提取收率为91.3%。
这种方法利用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀,然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透明质酸发酵液预处理方法。
微生物发酵提取透明质酸的提取工艺流程
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透明质酸实验方法
透明质酸HA ( Hyaluronic Acid ) 是由(1 - β- 4) D - 葡糖醛酸和(1 - β- 3) N - 乙酰基- D -氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖[1 ] 。
由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用[2 ,3 ] 。
微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA 为主要成分的荚膜来生产HA。
与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点[ 4 ] 。
利用链球菌发酵法生产HA 的研究主要集中在日第2 期邓开野,等:透明质酸产生菌的筛选及诱变本,英美等国也有少量报道,大多见于专利。
作者对牛鼻黏膜进行了透明质酸产生菌野生型的分离,同时利用复合诱变育种方法处理HA产生菌,以期得到既不产生乙型溶血素、HA 产量又有提高的发酵HA 所适用的菌种。
1 实验材料采集的样品为长春皓月肉牛公司和海南省三亚市防疫站的牛鼻黏膜140 份。
培养基有以下几种: ①斜面培养基。
牛脑沁液800 mL ,牛心沁液200 mL ,牛肉膏的质量分数为0. 3 % ,蛋白胨为1 % ,NaCl 为0. 5 % ,琼脂为1. 8 % ,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min 。
②血琼脂平板培养基。
葡萄糖的质量分数为2 %,蛋白胨为1 %,牛肉膏为1 % ,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4 为0. 2 % ,琼脂为1. 6 %,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min. ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。
③摇瓶培养基。
葡萄糖的质量分数为4 % ,蛋白胨为1 % ,牛肉膏为1 %,MgSO4 ·7H2O 为0. 1 % , KH2 PO4为0. 2 % ,灭菌前p H = 7.0 ,121 ℃灭菌20 min ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入体积分数为10 %的小牛血清。