透明质酸的发酵生产工艺
玻尿酸制备工艺
玻尿酸制备工艺
玻尿酸，又名透明质酸，是一种天然存在的多糖体，具有优异的保湿、润滑和生物相容性，广泛应用于化妆品、医疗和保健品等领域。
以下是玻尿酸的制备工艺：
一、原料准备
制备玻尿酸所需的原料主要是动物组织（如鸡冠、牛眼和人脐带），这些组织富含玻尿酸。
首先，对原料进行清洗、切割、破碎等预处理，以便后续的发酵培养。
二、发酵培养
发酵培养是制备玻尿酸的关键步骤，通常使用微生物（如链球菌、乳酸菌和酵母菌）进行发酵。
在发酵过程中，微生物会分泌出酶，这些酶能够将原料中的葡萄糖醛酸分解成透明质酸。
经过一定时间的发酵培养，收集透明质酸。
三、提取纯化
提取纯化是为了去除发酵液中的杂质，得到高纯度的透明质
酸。
这一步通常采用沉淀法、离子交换法、吸附法等方法进行。
经过纯化处理后，透明质酸将被分离出来。
四、结晶干燥
结晶干燥是将透明质酸结晶化，以得到更高纯度和稳定性的产品。
这一步通常采用蒸发结晶、冷冻结晶等方法进行。
结晶干燥后，将透明质酸进行干燥处理，以便后续的质量检测和包装储存。
五、质量检测
质量检测是为了确保制备得到的透明质酸符合相关质量标准。
这一步通常包括对透明质酸的外观、纯度、分子量、粘度等进行检测，以确保产品质量。
六、包装储存
最后，按照相关规定和标准进行包装储存，以便后续的应用。
包装材料应符合相关要求，如密封性、阻光性等。
储存环境应保持干燥、阴凉、通风良好，避免阳光直射和高温。
微生物发酵法生产透明质酸
微生物发酵法生产透明质酸郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。
透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。
1 透明质酸的发展1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。
20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。
由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。
受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。
为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。
工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。
80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。
提取法和发酵法生产HA的比较见表1。
表1 提取法和发酵法生产HA的比较项目提取法发酵法存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg应用价格昂贵，化妆品中的添加量受到制约能增加化妆品中的添加量发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。
国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。
透明质酸的制备
透明质酸的生产工艺透明质酸（HA）的生产工艺主要分为二大类,以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。
透明质酸在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有透明质酸，只是含量不同。
已从下列组织中分离出了透明质酸：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。
细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。
细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。
透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（Ｍr）有差别。
一、以雄鸡冠(roostercomb)为原料的生产工艺（一）、工艺路线：（二）、工艺流程1．提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10min，冷却至50℃，用1mol/L氢氧化钠液调pH8.5~9.0,加入适量胰酶,45~50℃保温酶解5~7h，酶解过程中维持pH8.5~9.0。
2．过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。
3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调pH6.0~6.5,将滤液加到3倍体积的95%乙醇中,反复倾倒3次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出沉淀,用适量乙醇脱水3~5次,放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥,得透明质酸中间品。
4．氯仿处理将透明质酸中间品溶于0.1mol/L氯化钠溶液中,溶解浓度为0.3%,溶解过程中加少量氯仿防腐。
溶解后，调pH4.5~5.0,加入等体积的氯仿搅拌处理2次,静置分出水相。
微生物发酵透明质酸的制备及测定_吕磊
16 4
药物生物技术
第 16 卷第 2 期
3.1.2 CPC 加入 量选 择 不 同 CPC 加入 量对 H A 粗品溶 液中糖醛酸 和蛋白质 含量的影 响 , 见 图 1。
3.5 相对分子质量的测定 根据比浓黏度 ηsp 与 HA 浓度的关系作图 , 该
回归曲线 与纵轴 的截距 为特 性粘度[ η] , 结果 见 图 3 , 根据公式 [ η] =3.6 ×10-4 Mr 0.78 , 平均相对分 子质量 M r 为 1.86 ×106 。
出了一种简单有效生产 HA 的分离纯化方法 , 即 采用过滤吸附法联用氯代十六烷基吡啶(CPC)分
2 实验方法
离纯化发酵液中的 H A , 其纯度 、蛋白质含量 、热原 值等符合医用标准[ 8] 。
2.1 分离纯化方法 兽疫链球菌发酵液[ 9] 离心去菌体 , 上清醇沉 ,
1 材料与仪器
沉淀溶解得粗品溶液 , 加入一定量的硅藻土 、活性 炭搅 拌均匀 吸附 , 过滤 , 加入 CP C , 离心 , 沉淀 溶
Fig 1 T he effect of CP C on co ntents o f g lucuronic acid and protein
3.1.3 乙醇加入量的选择 不同乙醇加入量对 H A 粗品溶液中糖醛酸含的影响 , 见图 2 。
Fig 3 T he relationship betw een ηsp/ c and c of H A
性黏度[
η]
, 并根据公式[
η]
=3.6
×10-4
M 0.78 r
计算
出平均相对分子质量 。 2.4.4 CPC 残留测定[ 13] 取样品溶液 1 m l , 按照 标准曲线的测定方法测定 590 nm 处的吸光度 , 从
透明质酸生产工艺概论 -姬跃莹ppt课件
• 摘要：生物发酵法是生产透明质酸的主要方法，
分离纯化是发酵法制备高分子量、高纯度透明质 酸的关键环节本文探讨了透明质酸发酵液的特性 和分离纯化过程中工艺条件对透明质酸分子量和 结构的影响，对预处理、分离、纯化各阶段的工 艺方法进行了系统比较和分析，指出了透明质酸 分离纯化工艺中存在的问题。并提出了今后分离 纯化研究的重点。 • 关键词：透明质酸；分离；纯化
透明质酸(Hyaluronic acid 简称HA)分子式 透明质酸(Hyaluronic acid 简称HA) 或称醣醛酸 化学方程式示意图
该物质在 1934 年首次从牛眼玻璃体中 分离出来。 HA 水溶液所形成凝胶流变特性，因而被 广泛应用于医学、化妆品等领域。近 年来，国际市场对药用级 HA的需求增 长很快，而药用级 HA 要求较高的纯度 和分子量。
每合成二糖单位 1 moL , 消耗腺苷三磷酸 (ATP) 5 moL 、 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 (NADH) 2 moL和乙酰辅酶A 1 moL。在游 离糖链还原端不断延长的同时 , 糖链被挤压 到细胞膜外侧 ,HA 糖链合成到一定长度 ,还 原端与HAS 分离,分泌到胞外或细菌荚膜中。
HAS包含7 个结构区域,即2 个UDP2底物结合 部位、2 个HA2单糖2UDP 供给部位、2 个糖 基转移酶催化位点和1 个协助HA 糖链跨膜的 结构域。其中,2 个糖基转移酶催化位点分别 具有将UDP2GlcUA 和UDP2GlcNAc 连入HA 糖链还原端的活性。
合成HA 的过程中,糖链还原端的最后一个单 糖残基携带UDP 基团,并结合在这种底物单 糖的HA2单糖2UDP 结合部位上;在相应的 糖基转移酶催化位点上,底物结合位点上的 UDP2单糖以共价键形式与糖链末端单糖连 接,并将原糖链还原端的UDP 基团释放。
透明质酸生产菌种和工艺技术
透明质酸生产菌种和工艺技术透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。
此后，人们对HA的分布、生理作用、化学结构、理化性质、制备工艺及其在医疗和化妆品方面的应用进行了广泛深入地研究。
我国从80年代开始研究HA的分离纯化制备工艺和临床应用，90年代初已有HA制剂作为新药上市，生产方法由提取法发展到微生物发酵法。
透明质酸应用：医学方面：由HA制备的眼科制剂有手术用黏弹性辅助剂、滴眼剂、骨科制剂有关节腔注射液（用于补充关节滑液，治疗关节疼痛）等；另外，HA可促进创伤愈合，治疗烧伤；HA与化疗药结合，具有靶向引导作用，能引导药物进入肿瘤部位，杀灭癌细胞，减轻化疗副作用。
HA作为人体的基本物质，对其生理和药理作用的研究才开始，随着研究的深入，HA在医学方面的应用还会更加广泛。
化妆品：HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前高档护肤品、发用制品用量最大品种。
美容保健食品：在日本，HA从20世纪90年代开始用作具有美容作用的保健食品，服用后可增加人体内HA的合成，提高皮肤中HA的含量，使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。
我们的技术水平：生产菌:兽医链球菌，好氧细菌(突变株)生产水平:6-8g(成品)/L发酵时间:20小时分子量:百万以上产品规格:食品、医药、化妆品级生产成本（原料+人工+能源）：1200-1500元/KG市场价格：4000元/KG（食品级，化妆品级）；9000元以上（医药级）技术成熟度：商业化生产，且国内外多个厂家使用此技术。
工艺路线：斜面----摇瓶----种子罐----生产罐----过滤----乙醇提取---盐络合解离----乙醇提取----真空干燥----成品经济分析：年产2吨透明质酸，投资400万左右，产值800万，投资回报率超过50%，当年投资，当年回收成本。
发酵法生产透明质酸的工艺研究
文章编号 :1004 - 5260 (2002) 01 - 0033 - 04
© 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
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宁
夏
农
学
院
学
报
咔唑法试剂 : (1) 0. 025M 的四硼酸钠浓硫酸 :4. 77g Na2B4O7 ・ 10H2O + 500mlH2 SO4 ( CR)
1. 1. 2. 2 种子培养基
MgSO40. 5g 水 1000ml pH7. 0～7. 5 琼脂 20g
葡萄糖 20g 胰蛋白胨 8g 酵母膏 2g 牛肉膏 4g
1. 1. 2. 3 发酵液成分
Na2 HPO40. 5g MgSO40. 5g 水 1000ml
葡萄糖 ; 蔗糖 ; 酵母膏 ; 蛋白胨 ; 碳酸钙 ; 磷酸二 氢钾 ; 硫酸镁 。 1. 1. 3 仪器与设备 显微镜 可控硅控温水浴锅 恒温振荡仪 超净工作台 数显电热培养箱 电热手提压力蒸汽消毒器 721 分光光度计 , 电热鼓风干燥箱 1. 1. 4 药品与试剂 可调移液器 生物显微镜 高速冷冻离心机 MP200B 电子天平 IPT - 5 架盘天平
最后 ,在每个摇瓶 ( 50ml ) 中加入 0. 05 克硫酸镁 调节 pH 在 7. 0 - 7. 5 的范围内 ,每个实验重复 1 次 , 接种量为 2 % ,置于 37. 0 ℃,170rpm 的摇床上培养 24 小时 ,测试其结果 。 1. 2. 3 测试方法 1. 2. 3. 1 HA 含量的检测方法 ( 咔唑法) 咔唑法检测透明质酸含量的原理是因为透明质 酸水解后 ,产生 1/ 2mol 的糖醛酸 ,其与浓硫酸反应 , 生成络合物 ,此络合物与咔唑形成玫瑰红颜色 ,根据 其颜色的深度可以判断透明质酸含量的多少 。 咔唑步骤 : (1) 取 5ml 浓硫酸溶液 ( 4 ℃ 预冷) ,然后加入 1ml 试样 ( 在冰浴中) ,摇匀 。 (2) 加热试管 ( 在沸水浴中 ) 10min , 然后冷却至 室温 。 (3 ) 加入 0. 2ml 咔唑溶液 , 摇匀 , 在沸水浴中加 热 15min ,再冷至室温 。 ( 4) 在 530nm 处测定其 OD 值 。 如果出现玫瑰红 , 则证明含有 HA , 再把测得的 值对照标准曲线 ,就得到透明质酸含量的多少 1. 2. 3. 2 还原糖的测定方法 - DNS 法 步骤 : 取待 测 样 品 和 蒸 馏 水 ( 对 照 ) 各 1ml , 分 别 加 DNS 试剂 3ml ,沸水浴煮沸 15 分钟显色 ,冷却后用蒸 馏水稀释至 25ml , 用 721 分光光度计在 550nm 测其
透明质酸的制备、功能特性及其调节肠道健康的研究进展
透明质酸的制备、功能特性及其调节肠道健康的研究进展1. 透明质酸的制备方法研究进展透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种在人体中自然存在的天然高分子多糖，具有良好的保湿性能及多种生理功能。
随着生物科技的发展，透明质酸的制备方法也在不断进步，其研究主要集中在化学合成、微生物发酵以及生物提取等方面。
化学合成法：化学合成法是早期制备透明质酸的主要方法，通过特定的化学反应合成透明质酸。
但这种方法存在副反应多、纯化困难、成本较高以及可能引入有毒杂质等问题，因此逐渐被其他方法所替代。
微生物发酵法：近年来，微生物发酵法成为制备透明质酸的主流方法。
该方法通过培养特定的微生物菌种，利用微生物在发酵过程中自然产生透明质酸。
此方法具有产量高、易于纯化、生产成本相对较低等优点。
通过优化发酵条件，还可以实现对透明质酸产量的调控。
生物提取法：生物提取法主要是从动物组织（如鸡冠、动物眼球等）中提取透明质酸。
虽然提取法得到的透明质酸天然、纯净，但由于原料来源有限，大规模生产存在困难，因此该方法主要用于实验室研究和小规模生产。
随着科技的发展，研究者们也在不断尝试新的方法，如基因工程法、重组DNA技术等来制备透明质酸，以期获得更高纯度、更低成本的产品。
对于不同制备方法的比较研究也是当前研究的热点之一，旨在找到最适合工业化生产的透明质酸制备方法。
透明质酸的制备工艺不仅影响其产量和纯度，也对其后续的应用性能产生影响。
开发高效、安全、可持续的透明质酸制备方法具有重要的实际意义和价值。
随着研究的深入，我们期待在未来看到更多创新的技术和方法在透明质酸制备领域的应用。
1.1 天然透明质酸的提取与纯化方法天然透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种线性的多糖，由D葡萄糖醛酸和N乙酰氨基葡萄糖胺通过1,3键和1,4键交替连接而成，具有高度的生物相容性和生物活性。
在自然界中，透明质酸主要存在于动物的结缔组织、皮肤、关节软骨、眼球玻璃体等部位。
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透明质酸的发酵生产工艺专业：生物制药姓名：邓海艳课程名称：发酵工程摘要：透明质酸广泛分布于各种动物组织中，由于动物组织原料有限，且透明质酸的含量低，同时提取成本高，因而价格十分昂贵。
而微生物发酵法，所需的原料易得，大大降低了生产成本。
同时由于透明质酸存在于菌体英膜上，易于与菌体分离，因而减少了提取成本。
本篇文章就是以一株兽疫链球菌作为生产菌株进行研究重点讨论了温度、pH值、搅拌转速，发酵时间以及培养方式等发酵条件对透明质酸产量和分子质量的影响。
关键词：透明质酸；产量；影响因素；发酵条件透明质酸（hyaluronic acid，简称HA）又名玻璃酸，是一种高分子量的酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中。
HA分子中的羧基和极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，可以吸收与保持自身体重千倍以上的水分，是国际上公认的最好的保湿剂，还具有润滑，促进关节愈合等作用[1]。
不同分子质量的HA有不同的用途，低分子质量的HA通常用作食品原料，中等分子质量的HA主要应用于化妆品，而高分子量的HA在医学上有较高的应用价值。
1.透明质酸的微生物发酵法从上个世纪30年代开始，人们便开始进行微生物发酵法生产HA的研究。
微生物发酵法生产HA较动物组织提取法有许多的优点，比如生产成本低廉，规模不受原料限制，因为发酵液HA以游离状态存在所以易于HA的分离纯化。
能够产生HA的链球菌有A群和C群两类，其中A群主要有化脓链球菌, 一般不用作生产菌种，因为其致病性较高；C群有兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌等均属于非人体致病菌，所以可以用作HA的生产菌种罗瑞明等从患肺炎的羊肺液中分离出兽疫链球菌菌株，通过培养基优化得到的HA产量为1.88 g/L。
冯建成等以Streptococcus equiSHO为出发菌株，通过物理和化学诱变选育到1株遗传稳定、无溶血性且透明质酸酶缺陷型菌株SH0201，通过摇瓶发酵试验得到相对分子量2.06xl06 Da的HA。
李自刚等从奶牛鼻黏膜内分离到1株兽疫链球菌，经过紫外线诱变和亚硝基胍诱变处理后HA产量能达到6.94 g/L[2]。
通过微生物发酵法生产HA的品质和产量主要受到以下几个方面的影响:首先是菌种选择；其次是培养基的优化和发酵条件的优化；最后是生物工艺的下游技术即HA的提取工艺。
国内外诸多学者研究了微生物发酵法生产HA的工艺。
国内，凌沛学等首先开始对HA的发酵生产的工艺进行研究，分别进行了实验室小试和生产车间中试的研究；陈永浩等利用γ射线和紫外线结合方法和通过辐照进行诱变育种，得到了没有溶血性的菌株，使得HA产量及相对分子质量得到了进一步的提高；杨利等对透明质酸分子量的影响因素进行了探索，得到溶氧水平和搅拌转速与HA分子量的关系；付莉等从自然界蹄选到一株透明质酸的产生菌；叶华等对于透明质酸发酵流加过程进行了研究；史鹏等，对发酵法生产透明质酸提取工艺方法进行了研究；郝宁等对HA的生产菌进行了基因改造，基因重组菌的HA产量得到很大程度的提高。
HA 的发酵生产主要工艺流程如下:斜面种子一摇瓶种子一接种一发酵培养一补料一放罐一发酵液（加乙醇粗提）一粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）—过滤（去除杂质）一滤液（乙醇沉淀）一沉淀物（脱水干燥）一成品透明质酸2.发酵培养基成分和发酵条件对HA的影响2.1不同碳源对发酵的影响当碳源为2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨1.0%，KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%；37℃，100 rpm培养18 h。
以葡萄糖为碳源时，透明质酸的产量最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖和果糖。
而木糖和半乳糖利用情况不好，以它们为碳源时透明质酸产量只有0.4 g/L和0.42 g/L。
其原因可能是UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄合成透明质酸的前体物质，也是合成菌体的前体物质，菌体可以容易地分解蔗糖和麦芽糖得到葡萄糖，果糖也很容易转化为葡萄糖，所以它们能被比较好的利用，而其他两种碳源的利用情况则相对差些。
因此本实验采用葡萄糖为碳源。
2.2不同氮源对发酵的影响当氮源为2.0%，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%，37℃，100 rpm培养18 h。
氮源不仅为菌体生长提供氮元素，而且大多数有机氮源还能提供多种必需的生长因子。
当发酵培养基的氮源采用酵母膏时，透明质酸的产量最高。
其次是酵母膏和蛋白胨的混合氮源，其余的均较底。
而采用无机氮源（NH4）2SO4时，透明质酸含量和菌体量都是最低的。
兽疫链球菌的营养要求比较高，TCA循环不完全，有多种氨基酸不能自身合成，而且不能完全由自身合成核昔酸。
而酵母膏中含有大量的菌体生长所需的生长因子，这可能是兽疫链球菌H-35以酵母膏为氮源时生长和发酵较好的原因之一。
2.3酵母膏用量对发酵的影响当氮源为酵母膏，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%，37℃，100 rpm培养18 h。
低酵母膏用量时，细胞产出的透明质酸含量较低，细胞量也较低，逐步提高酵母膏的含量，透明质酸含量和细胞量均有大幅提高。
当加入量为2%时，透明质酸含量达到最大值。
所以本研究中选用酵母膏为氮源，用量为2.0%。
2.4不同温度对发酵产物的影响发酵过程中，温度是一个关键的因素，对菌体生长、代谢速度有很大的影响。
当温度为35℃时，HA产量最高，达到1.07g/L；当温度高于35℃，透明质酸的产量却随温度的升高而呈下降的趋势。
但在实验温度范围内菌体生长却随温度的升高菌体量增多，表明高温有利于菌体的生长，碳源更多的转化为菌体。
所以本实验发酵温度为35℃。
2.5搅拌转速对HA产量和分子质量的影响搅拌转速是影响发酵液溶解氧浓度的关键因素之一。
HA是HA产生菌荚膜的主要组成成分，搅拌可以强化气-液间氧的传递，既维持发酵液中有足够的溶氧，为细胞的生长提供氧气，又可使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利于细胞的吸收和利用，同时可以加速荚膜从细胞表面脱离。
高海军报道，只有在高搅拌转速时发酵体系才处于全部混合状态，在较高的搅拌速率650 r/min下发酵时可以得到较高的HA产量，为411 g/L，产率系数为0.08[3]。
这是因为HA溶液是假塑性物体，具有剪切变稀的特性，高速搅拌时，发酵液传质，传氧性能得到改善，有利于菌体生产和产物合成，同时，较高速的搅拌能使荚膜更快地脱落，解除其对细胞吸收营养物质的阻碍。
Hasegawa，却认为，HA的产量在一定搅拌速度内会随着搅拌速率的增加而增加，并且随着换气速率的加快，HA的产量也会增加，然而过高的搅拌速率会破坏细胞而导致HA产量下降，这是因为过高速的搅拌会产生很大的剪切作用，对所培养的菌体细胞造成伤害，使得受损细胞合成HA的能力大大下降了。
而成霞则认为在发酵前期采用较低的搅拌转速（200 r/min），使菌体细胞能快速生长，发酵开始10 h后适当提高搅拌转速（350 r/min），一方面可通过降低菌体的生长速率来降低乳酸的积累量；另一方面由于此时发酵液很黏稠，提高搅拌转速可以促进混合，有利于HA发酵的进行。
David将搅拌速度从300~1000 r/min进行变化，HA的分子质量基本没有改变[4]。
2.6不同装量对发酵产物的影响随着装量增大，菌体生长较好，但透明质酸的产量在8%的装量时出现高峰。
说明了装量越大，溶氧越低，不利于透明质酸的合成。
因此发酵中发酵液的装量采用8%。
2.7发酵条件的优化根据文献选择对兽疫链球菌生长及产透明质酸影响较大的四个因素（初始葡萄糖浓度、MgSO4·7H2O的浓度、初始pH和摇床转数）来设计正交试验表。
其它相同的条件为：酵母膏2.0%, KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2%，装量为8%，培养18 h。
通过极差分析，影响因素大小依次是：pH>摇床转速> MgSO4；含量>初始葡萄糖。
最优组合是pH7.0，摇床转速200 rPm，MgSO4含量0.06%，初始葡萄糖浓度4.0%。
在初始葡萄糖浓度4.0%，酵母膏2.0%，NaCl0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.06%，初始pH7.0，装量为8%，35℃，200 rpm培养18 h。
实验的结果是透明质酸产量为1.43 g/L，比优化前提高了28.8%。
pH是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产物的积累有很大的影响，发酵液的pH可以影响微生物细胞原生质的电荷，引起各种酶活力的改变，影响菌体对基质的利用速度和细胞的结果，以致影响菌体的生长和产物的合成[5]。
从实验数据可知，pH7.0时对发酵有利，过低和过高都不利于发酵产物的积累。
摇床转速表明，转数越高，越有利于透明质酸的合成和分泌。
原因是高转数，发酵液传质、传氧性能得到改善，有利于菌体的生长和产物合成。
由于荚膜会阻止营养物进入细胞，从而影响细胞的生长代谢和透明质酸的合成以及分泌。
较高的转数能使荚膜更快的脱落，解除荚膜对细胞吸收营养物质的阻碍。
透明质酸合成酶是透明质酸合成途径中的关键酶,该酶位于原生质体膜上。
它催化透明质酸的前体UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转化成H，此酶的活性受Mg2+离子浓度的影响很大[6]。
当MgSO4·7H2O为0.06%时透明质酸合成酶活性最高。
因此兽疫链球菌H-35最佳发酵条件是初始葡萄糖浓度4.0%，酵母膏2.0%，NaCl0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.06%,初始pH7.0，35℃,装量为8%,200 rpm培养18 h。
3.透明质酸的纯化参照应国清分离纯化玻璃酸的研究，采用阴离子交换树脂DEAE-纤维素对透明质酸粗品进行洗脱。
以去离子水为淋洗液，0.6 mol/LNaCl溶液作为洗脱液，分别测定流出液中透明质酸的O.D530值和蛋白质的O.D280值。
从中可看出，0.6 mol/LNaCl溶液作为洗脱剂时，透明质酸出峰时间早，峰形陡峭，峰值较高，拖尾较小，并且含蛋白质的量很低。
通过考马斯亮蓝染料结合法测得粗品和纯品的蛋白质含量分别为 2.84%和0.38%，说明经过DEAE-纤维素纯化以后，透明质酸得到很好的分离。
结论虽然目前国内对微生物发酵法生产HA的研究逐渐增多，但是大部分还只是在实验室进行研究，对于将其投入工业化生产的技术还不够成熟。
尽管相对于动物提取法，产量有了很大提高，但是由于HA的需求增长非常快，产量仍是一个需要突破的瓶颈。
因此，发酵工艺条件作为影响HA产量的一个重要因素，特别是从工业化的角度上考虑时，仍需进一步的研究和探索。