α-淀粉酶的生产工艺
α-淀粉酶的生产工艺流程
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酶的生产工艺
精制工艺
生产食品级产品需要进行提取和精制处 理。提取的精制设备是板框压滤机和超 滤器。使用板框压滤机除去发酵液中的 菌体和杂质，得到较纯的酶液滤饼，含 水量要求小于45 %含酶小于100U。将 得到的酶液再进行防腐和调配处理便成 为产品。
二、脂肪酶
• 三酰基甘油基水解酶，可水解三酰甘油 酯为甘油和脂肪酸 • 广泛存在于动植物和微生物内 • 微生物脂肪酶的种类很多，广泛存在于 细菌，酵母和霉菌
（三）发酵方法—固体发酵
固体发酵法以植物秸杆为主要原料，工艺简单，产品价格低廉。 (1)菌种 绿色木霉 (2)培养基 通过对其固态发酵条件进行单因素优化试验来确定 发酵培养基的最佳碳、氮源种类及添加量为:稻草粉与麸皮的 质量比为9 : 1 ，NH4N03 0.5% (3)发酵培养 最适培养条件为:固液比1 : 3，接种量1mL，pH自 然，培养温度30°C. 培养时间96h。 (4)酶的提取 目前生产厂家只能采用直接干燥粉碎得到固体酶 制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙，成品 质量不稳定，杂质含量高。因此，随着液体发酵酶工艺的发展 及菌种性能的提高，采用液体发酵法生产纤维素酶是必然趋势。 （5）工业上生产酶制剂的主要方法为盐析法，盐析剂为硫酸铵。 首先以pH4.8的乙酸缓液与酶按体积1 : 2的比例稀释酶液，在 4°C、硫酸铵饱和度为70%的条件下提取16h，5000r/min离心 20min得到沉淀，即为粗纤维素酶。
2.发酵工艺
（1）培养基
米曲霉的培养基:豆饼粉7. 5%， (NH4)2S04 0.8%，水40%，KH2P04 0.25%，麸皮51. 45%。黑曲霉的培养基(g/L) :新鲜麸皮8.25，米糠 4.5，豆饼粉1. 5， (NH4)2S04 O. 3，K2HP04 O. 06，CaCl2 0.075，水8. 6mL， pH5.5。
α-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。
倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。
然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。
⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc培养皿经37C,24h分别培养。
⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。
实训7.紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株
突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0. 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
臭0，氧1在21空℃气灭中菌的20含m量in不。能超过灯0. ，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，
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一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被 始拽茸置皮窥触睬揖捩攻蔽惬鼗墁殪悛笏圹德迦菘伟炸础兴怫蒋憷麂全等痼辰赔毛琵酮滚臀撙滔籍摧癍饽系煲籁逅粘拓秤缦嗷槔蜞晦癯
为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接入斜面保藏? 空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。 学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
求培养至对数期为最好。 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
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基因工程菌生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化
基因工程菌生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化α-淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，被广泛应用于食品、制浆造纸、医药等领域。
由于生产条件的限制，传统的α-淀粉酶生产工艺存在很大的局限性，因此需要探索新的生产技术和生产菌株。
方法：
本实验选用经过基因工程改造的高温耐受性菌株，利用筛选得到的最优菌株进行发酵生产α-淀粉酶。
通过单因素实验和正交实验优化发酵条件，包括发酵时间、发酵温度、pH值、转速等指标，寻找最佳发酵条件。
结果：
确定最佳生产菌株后，发酵条件的单因素实验结果表明，最佳发酵时间为72小时，发酵温度为60℃，pH值为7.0，转速为180转/分。
进一步经过正交实验优化，确定了最佳的发酵条件为：发酵时间72小时，发酵温度60℃，pH值7.0，转速180转/分。
结论：
通过基因工程改造的耐高温菌株生产α-淀粉酶的发酵条件已经成功优化，这为更高效、环境友好的α-淀粉酶生产提供了技术支持和理论基础，同时也为高效生产其他工业酶类开辟了新的途径。
耐高温α淀粉酶研究进展
耐高温α 淀粉酶研究进展郑元木摘要: 耐高温α-淀粉酶是重要的工业用酶之一，本文简要综述了该酶结构、性质、作用机制、分离纯化方法及生产工艺流程和用途。
关键词：耐高温α-淀粉酶；作用机制；生产工艺；用途α-淀粉酶全称为α-1，4-葡聚糖水解酶（EC3．2．1．1），作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶[1]。
耐高温α-淀粉酶不同于中温α-淀粉酶和α-淀粉酶普通高温，具有优越的耐热性能、酶活力高和较宽的pH适应范围等特性，故在工业中得到广泛的应用。
1 结构、功能、作用机制比较不同来源的耐高温α-淀粉酶氨基酸序列发现，虽然有的氨基酸序列相似性不足30%，但它们的三级结构极为相似，这也表明三级结构是催化活性的关键因素[2]。
耐高温α-淀粉酶都是由三个结构域组成，即为结构域A、结构域B、结构域C。
地衣芽孢杆菌是生产耐高温α-淀粉酶最重要的菌种，以地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶为例（结构如图一）[3]。
结构域A为8个α-螺旋和8个β-折叠交替组成的α/β桶状结构,该结构较为刚性，维持酶的基本构象。
结构域B具有较大的柔性，推测它可能与底物特异性结合有关，主要由一个或几个β-折叠构成。
结构域C构成α-淀粉酶的碳端，由反平行β-折叠组成，它包含的氨基酸少，距离活性位点远，缺乏柔性，目前它的功能尚不清楚。
α-淀粉酶的催化活性口袋位于结构域A和B之间，在α/β桶状结构的底部。
此外，在结构域A和B之间还发现有一个或几个钙离子及其他金属离子结合位点，推测它可能与稳定酶的结构有关。
耐高温α-淀粉酶属于水解酶类，能随机水解淀粉、糖原及降解物内部的α-D-1，4糖苷键，使溶液的粘度迅速下降，产生可溶性糊精、低聚糖及少量麦芽糖、葡萄糖。
对于耐高温α-淀粉酶作用机制的研究，Nielsen JE[4]等提出了如图二模型。
该模型认为催化中心位于α/β桶状结构的底部，Glu261和Asp231是起催化作用的两个重要残基。
α-淀粉酶生产重要参数
α-淀粉酶发酵的生产工艺设计摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
对α-淀粉酶性质及其应用进行了相关综述。
关键词：α-淀粉酶；生产工艺设计；性质；应用Abstract：α-amylases are universally distributed throughout the animal，plant and microbial kingdoms．They can hydrolyse starch molecules to give diverse products including dextrins and progressively smaller polymers composed of glUcose units．α-amylases are one of the most popular and important form of industrial amylases．These enzymes are applied in baking industry，the processing of starch，ferm entation，brewing industry，textile and paper industries．The present review highlights the properties and applications ofα-Amylases．Key words：α-amylase；properties；applications1 绪论1.1α-淀粉酶性质简述1.1.1α-淀粉酶简述α-淀粉酶广泛存在于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中[1]。
米黄色、灰褐色粉末。
α淀粉酶的生产工艺
一,α-淀粉酶菌种的筛选枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。
我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。
该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。
∙固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。
麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。
∙深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。
将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。
然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。
当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。
中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。
停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。
而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。
淀粉酶的生产精品PPT课件
淀粉是什么？
淀粉是由许多葡萄糖分子以α-1， 4或α-1，6糖苷键连接而成的大分 子物质。淀粉有直链淀粉和支链淀 粉之分。
淀粉酶是什么？
淀粉酶属于水解酶类，是催化淀 粉、糖原、糊精中糖苷水解的一类酶 的统称。
根据水解淀粉的方式不同，主要 的淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡 萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖 转移酶等。
1.2 α-淀粉酶的水解反应
淀粉在α-淀粉酶的作用下很快 被切割成分子较小的糊精、低聚糖、 麦芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降， 对碘呈色反应为篮－紫－红－无色， 又叫液化酶。
水解直链淀粉，首先将淀粉降解为 寡糖、麦芽三糖和麦芽糖，然后将寡 糖、麦芽三糖进一步降解为麦芽糖和 葡萄糖。
水解支链淀粉，由于不能水解α1.6糖苷键，产物除麦芽糖、少量葡 萄糖外，还有带α-1.6键的小分子极 限糊精。
种子瓶培养（三角瓶） 麦麸玉米粉培养基，32-34℃，
70-72h，培养至长出大量菌丝及黄 绿色孢子。
种曲培养（曲盒） 培养基与种子瓶相同，接种量0.5-
1.0％，料层厚1cm，培养3天。
厚层通风培养 麦麸谷壳培养基接种量0.5％，34-
36℃，28h。
产品 培养好的麸曲直接烘干即为工业级
粗酶，水浸醇沉后粉碎加糖可作为助 消化药物。
（三）β-淀粉酶为外切酶 （四）作用淀粉时还原性增加，但粘度不易下降，糊
化缓慢 （五）β-淀粉酶较α-淀粉酶分子量大 （六）水解作用：
1、直链淀粉：可以完全水解成麦芽糖 2、Leabharlann 链淀粉：麦芽糖和大分子β-极限糊精
2.3 植物β-淀粉酶的提取
（一）麦麸提取 β-淀粉酶
（二）从甘薯淀 粉废液中提取 β-淀粉酶
α-淀粉酶
保藏菌种
斜面活化
摇瓶种子 培养
厚层通风 发酵
种子罐扩 大培养
粗制品 沉淀 收集滤液 过滤
烘干 抽提 麸曲
离心
洗涤沉淀
风干
粉碎
精制品
α淀粉酶的发酵生产及应用
22
固体发酵缺点
限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较 受限，一般较适合于真菌。 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题， 尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针
α淀粉酶的发酵生产及应用 20
深层发酵法生产α-淀粉酶 • 停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老， 80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶 活不再升高，可结束发酵。而后向发酵液中添加 2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理 30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而 易于过滤。冷却到35℃，加入硅藻土为助滤剂过 滤。滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真 空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析，盐析物加 硅藻土后压滤，滤饼于40℃烘干，磨粉而成。按 此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。
α淀粉酶的发酵生产及应用
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• 作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度60~70， 作用pH值范围为5.5~7.0，最适pH值为6.0。 Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力， 并且对其稳定性的提高也有一定效果。可催化水 解a-1,4糖苷键，但只能催化水解直链淀粉，生成 a-麦芽糖和少量葡萄糖。 • 主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、 芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。可由 米曲霉、嗜酸性普鲁士蓝杆菌、淀粉液化杆菌、 地衣芽孢杆菌和枯草杆菌分别经发酵、精制、干 燥而得。 α淀粉酶的发酵生产及应用
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a淀粉酶的抱子培养基配置如下：将麸皮5%、豆饼粉3%、蛋白胨0.25%、琼脂2%(pH 7.1)制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20min。
(3)种子培养基
种子培养基是供抱子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种 子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀
2
2.1培养基的制作
(1)培养基的类型
培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成抱子培养 基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到抱子，种子和发酵培养基这三 种类型。
(2)抱子培养基
抱子培养基配制的目的是供菌体繁殖抱子的， 常采用的是固体培养基，对这类培养基的要 求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的抱子，并且不会引起菌体变异。对抱子培养基的 要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。
a
摘要：a-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、
低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，a-淀粉酶已广泛应用
于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1•
1.1细菌的分离与初步鉴定：
将土壤系列稀释，把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将 长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大 小和菌落直径，计算D/d值。保菌供下次实验用。
经NTG反复多次处理，a淀粉酶活力有较大幅度提高。在经5次NTG处理之后，其变异 株a淀粉酶活达到34 200(U/ml)，较出发菌株提高了4.2倍以上，说明该诱变处理及选育方法 是行之有效的。经NTG处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差，必须经反复多次单菌落分离和 摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。
别培养。
8把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的
disc，用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。把各种斜面菌株经活化培养， 接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活 较高的产酶菌株。经菌种诱变选育a淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG反复多次处 理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育a淀粉酶高产菌株。
面培养基上。
1.3
1诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
2以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml），在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处
理1~4h0
3经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
4经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。
5把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30E培养36ho
1C,罐压0.5kg/cm2,风量1〜20h为1：0.48vvm,20h后1：0.67vvm，培养时间为28〜36h。
2.2耐高温a-淀粉酶的生产方法
耐高温a-淀粉酶生产工艺，采用地衣芽抱杆菌为菌株，通过一级种子罐发酵、大罐发 酵、过滤、成品处理制得。
2.2.1耐高温a-淀粉酶的生产原料
有采用地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)1.5吨种子罐发酵，玉米淀粉6%~10%, 玉米浆1%~3%,豆粕2%~5%，磷酸二氢钾0.3%~0.6%，磷酸氢二钾0.5%~2%,柠檬酸钠0.1%~0.3%,35吨发酵罐发酵，玉米淀粉15%~30%，玉米粉5%~10%,豆粕1%~8%，玉米浆2%~5%，磷酸二氢钾0.1%~0.8%，磷酸氢二钾0.8%~2%,柠檬酸钠0.05%~0.4%等。
6用2#定性滤纸制成5mm disc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量 青霉素（抑菌）。倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。然后把5mm disc纸顺序放在培养基表面。
7用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。把disc培养皿经37C,24h分
1.2紫外线诱变育种：
取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线
处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，
37C培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测 量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜
(3)发酵罐培养
培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6%、豆粕水解液6%〜7%、
Na2HPO4・12H2O0.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCI20.2%、NH4CI0.15%、豆油1kg、深井水20L， 调pH至6.5〜7.0。
发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%〜5%种子培养成熟液。培养条件为：温度37±
a淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70%、小米糠20%、木薯粉10%、烧碱0.5%,加水使 水量达60%,常压蒸汽灭菌1h.
本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下：抱子一锥形瓶-种子罐-
发酵罐
(1)抱子制备
将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽抱杆菌抱子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35°C静
薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。
a淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成
种子培 养基(pH 7.1〜7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20min。
(4)发酵培养基
发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗