1_血清免疫球蛋白IgG提取1
igg1与抗原结合分子机理
igg1与抗原结合分子机理
IGG1是一种免疫球蛋白，也称为抗体，它在机体的免疫应答中起着重要作用。
抗原结合是指抗体与抗原（通常是病原体或其他异物）结合的过程，这一过程涉及多种分子机制。
首先，抗体的结构决定了其与抗原结合的能力。
IgG1是一种由两条重链和两条轻链组成的Y形结构的抗体分子。
在这些链中，特定的区域称为抗原结合部位（paratope），它们与抗原的特定区域（抗原决定簇，epitope）结合。
这种特异性结合是由抗体的多肽链的氨基酸序列决定的，这些序列在不同的抗体中有所不同，因此不同的抗体可以与不同的抗原结合。
其次，抗原结合的分子机理涉及到多种非共价相互作用，包括氢键、范德华力相互作用、离子键和疏水相互作用等。
这些相互作用使得抗体与抗原之间形成稳定的结合，从而触发一系列的免疫应答。
另外，抗原结合也会激活免疫应答，包括促进巨噬细胞的吞噬作用、激活补体系统、介导细胞毒性和调节免疫细胞的活化等。
这些机制对于清除病原体和维持机体免疫平衡都至关重要。
总的来说，抗原结合的分子机理是一个复杂的过程，涉及抗体的结构、非共价相互作用和免疫应答等多个方面。
深入理解这一过程有助于我们更好地理解免疫应答的机制，并为疾病的预防和治疗提供理论基础。
第一部分免疫球蛋白测定一、IgG、IgA、IgM的测定1、单向
三、M蛋白测定：——免疫电泳
M蛋白： 浆细胞或B淋巴细胞单克隆增殖产生的结构均 一的多无活性的单克隆免疫球蛋白。 方法步骤：血清蛋白电泳加抗体于琼脂槽内扩 散、沉淀 结果判断：在α2-γ区附近形成致密弓形沉淀弧 临床意义：主要见于多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，也可见于巨球蛋白血症 mactoglobulinemia)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)和重链病
2、变应原特异性IgE检测：放射变应原吸附 试验（radioallergosorbent test,RAST) 步骤：变应原交联载体 加待检血清或正常 对照血清加 125I-抗人IgE 洗去未结合 125I-抗人IgE γ计数器测放射值 结果判定：以大于正常人3.5倍为阳性 临床意义： (1) 参见血清总IgE测定 (2) 确定变应原
散射比浊法
参考值：IgG：12.87±1.35g/L IgA：2.53±0.34g/L IgM：1.08±0.24g/L 临床意义： 1、低Ig血症： 先天性 — 体液免疫缺陷、联合免疫缺陷病 获得性 — 淋巴肉瘤、肾病综合征等 2、高Ig血症： 慢性感染、自身免疫病（类风湿性关节炎等）
二、IgE测定 1、血清总IgE测定：－ELISA法 方法：抗IgE包被反应板 IgE标准品或待 测血清 酶标记抗IgE 底物显色 测吸光度 做标准曲线求待测IgE含 量 参考值：男：631±128 IU/ml 女：337±60 IU/ml 临床意义： 含量增高：特应性皮肤病、枯草热、哮喘、 过敏性休克等
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重， 相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
免疫球蛋白G(IgG)三种提取方法比较
ＩＧ 纯度较 高 、 率也 高 ， 时 间较 长 ； 酸一 酸铵 分 步沉 淀法所 得 Ｉ 纯度很 高 ， 所 用时 间较 长 ， ｇ 得 但 辛 硫 ｇ Ｇ 但 得 率也较低 。３种提 取方 法各有特 点 ， 可根 据不 同的 实验 条件 和 目的选择 不 同的提 取方 法。
关键 词 ： 猪血 清 ； 免疫球 蛋 白 ； 取 方法 ； 提 比较
・３ ・ ８
免疫球蛋 白 Ｇ（ Ｇ ＝种提取方法比较 Ｉ ） ｇ
刘生 杰 也， 朱茂 英 ， 顾士彬 。唐 梅 。周 扬 。余为一 ’ ， ， ，
（安徽农业大学生命科学学院， ｔ 安徽合肥 ２ １ ７ ；阜阳师范学院生命科学学 院， ３ ０ ２ 安徽阜阳 ２ ６４ ） ３ ０ １
摘 要： 比较 ３种提 取猪 血清 中免疫球 蛋 白 ＩＧ 方法的提取效 果 。分 别 用辛酸 沉淀 法 ， 酸铵分 步沉淀 ｇ 硫 法． 辛酸一 酸 铵 沉淀 法粗提 猪 血 清 免疫球 蛋 白 ＩＧ， 硫 ｇ 并通 过 Ｓ － ＡＧ ＤＳ Ｐ Ｅ凝胶 电泳 、 ｌ ａ ａ Ｆ Ａｐ Ｅ ｓ Ｃ凝胶 ｈ ｅ 成像分析 软件 、 ｒｄｏｄ 白浓度测 定法等 比较 ３种方 法的提 取 纯度和得 率 ， Ｂ ａｆｒ 蛋 同时比较 ３种 方 法的时效 性和 经济性 。辛酸沉 淀法提取 ＩＧ 所 用时间最短 ， ｇ 只需 １ ， ｈ 得率较 高但 纯度不 高 ； 酸铵 盐析 法提 取的 硫
中图分类号 ： １ ８ Ｑ８ ； ５ ￥ 文 献标识 码 ： Ａ
Ｃｏ ｐ ｒｓ ｎ ｏ ｒ ｅＭ ｅｈ ｄ ｆＰｕ ｉ ｉ ｇＩ Ｇ ｒ ｍ ｗｉ ｅＳ ｒ ｍ ｍ ａ ｉｏ ｆＴｈ ｅ ｔ ｏ ｓｏ ｒｆ ｎ ｇ ｆｏ Ｓ ｎ ｅ ｕ ｙ
ＨｕＳ ｅ ｇ ｅ ， ｈ ｏｉｇ， ｕＳ ｉｉ Ｔ ｎ ｉ Ｚ ｏ ａ ｇ， ｕＷｅ ｉ ｈｎ ｊ Ｚ ｕＭａｙ ２ Ｇ ｈｂｎ， ａ ｇＭｅ ， ｈ ｕＹ ｎ ２Ｙ ｉ ｉ ｎ ｙ
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,IgG)的分离制备―盐析法
血清免疫球蛋白（Immunoglobulin，IgG）的分离制备―盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol /L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。
血清免疫球蛋白检查
血清免疫球蛋白检查
（1）免疫球蛋白G（IgG）
【参考值】7.0～16.6g/L.
【临床意义】
IgG减低见于：各类先天性和获得性体液免疫缺陷、联合免疫缺陷
的患者，以及重链病、轻链病、肾病综合征、病毒感染和免疫抑制剂
的患者。
IgG增高主要见于：①多克隆性增高：如各种慢性感染、慢性肝病、肝癌、淋巴瘤以及系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病；
②单克隆性增高：如免疫增殖性疾病中的多发性骨髓瘤。
（2）免疫球蛋白A（IgA）
【参考值】血清：0.7～3.5g/L.
【临床意义】
IgA减低见于反复呼吸道感染、非IgA型分泌型多发性骨髓病、重
链病、轻链病、原发性和继发性免疫缺陷病和自身免疫性疾病等。
IgA增高见于IgA型系统性红斑狼疮、IgA型多发性骨髓病、类风湿
关节炎、肝硬化、湿疹和肾脏疾病等。
（3）免疫球蛋白M（IgM）
【参考值】0.5～2.6g/L.
【临床意义】
IgM减低见于IgG型重链病、IgA型多发性骨髓病、先天性免疫缺陷症、免疫抑制剂治疗后、淋巴系统肿瘤和肾病综合征等。
IgM增高见于病毒型肝炎早期、肝硬化、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等。
（4）免疫球蛋白E（IgE）
【参考值】0.1～o0.9g/L.
【临床意义】
IgE减低见于先天性或获得性丙种球蛋白缺乏症、恶性肿瘤、长期服用免疫抑制剂等。
IgE增高见于各种过敏性疾病、寄生虫感染、肝脏疾病、结节病、类风湿关节炎等。
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1mL血清＋1mL生理盐水 滴加饱和硫酸铵溶液2mL
四、
室温静置30min, 4℃离心，4000rpm,10min
操 作 步
弃去上清液（含清蛋白）
沉淀溶于1mL生理盐水, 滴加饱和硫酸铵溶液0.5mL
室温静置30min, 4℃离心， 4000rpm,10min
骤
弃去上清液（α、β球蛋白）
沉淀溶于1mL生理盐水, 滴加饱和硫酸铵溶液0.5mL
IgG正常参考值 ：8．00～16．00g／L 1. 效价可用免疫双扩散试验判断； 2. 特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察； 3. 浓度也 可通过免疫浊度法等检测。
六、注意事项
盐的饱和度：影响盐析的重要因素，不同蛋白质的盐
析 要求盐的饱和度不同
pH值：在等电点时，蛋白质溶解度最小越易沉淀析出。 蛋白质浓度：越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限
愈低。过高也易引起其他杂蛋白共沉。
温度：一般可在室温下进行，某些对热特别敏感的酶，
则宜低温。
脱盐：透析时间较长，常在低温下进行，并加入防腐剂
避免变性或微生物的污染。
饱和硫酸铵溶液的滴加方式：逐滴，搅拌 盐析后放置时间、离心操作的速度、时间 透析袋的使用
七、方法学评价
硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质 变性，操作简单，为盐析中常用的中性盐
硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓 冲能力差，故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化 的免疫球蛋白，必须经过凝胶过滤、离子交换层析和 亲和层析进一步提纯
八、思考题
透析缓冲液与洗涤液有什么不同?
盐析法纯化血清中IgG类抗体
实验目的
掌握盐析法提取血清免疫球蛋白IgG抗体的原理 熟悉血清IgG提取纯化操作过程和方法
二、实验原理
蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，它在一 定浓度的中性盐溶液中易于沉淀，而其他蛋白质组分在 此时不易沉淀，通过离心可将两者分离。
透析法脱盐:
透析是将含有小分子杂质 的蛋白质溶液装在半透膜 （玻璃纸、火绵纸等）制 的透析袋里放在透析缓冲 液中进行，可不断更换缓 冲液，直至杂质被除去
室温静置30min, 4℃离（β球蛋白）
沉淀为γ球蛋白
沉淀溶于1mL生理盐水 移入透析袋，充分透析，
紫外分光光度计测定蛋白含量
五、结果判断
分别测OD280和OD260处的光密度值，按照公式计算 蛋白质浓度（mg/ml）= 1.45OD280—0.74 OD260