实验二 免疫球蛋白的提取
生化实验技术-综合设计性大实验
思考题（课前设疑）
1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物 质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件 下容易变性？
原料选择和预处理
选什么样的原材料应视生产目的而定。 一般要注意以下几个方面:
1．要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行； 4．成本比较低； 5．经济效果要好。
如蛋白质原料的选择
蛋白质类生化产品的原料来源有动植 物组织和微生物等，原则是要选择富含所 需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提 取的无害生物材料。
实验实施要求：平时按各组计划时间分 别进行实验，组长有义务指导下组相关 实验内容，每次实验必须登记。
全班交流：实验结束安排课堂讨论交流， 每组准备一人汇报，一人记录；要求用 PPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难 点，其他组学生质疑，教师点评。
指导教师：汪财生、斯越秀
实验项目训练目标
12实验目标?掌握免疫球蛋白igg的原理和方法?掌握利用紫外法单向免疫扩散法等测定igg含量的方法?掌握sdspage电泳法鉴定蛋白质纯度及测定分子量方法?掌握层析透析膜分离电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作13实验要求掌握的技术柱层析分离技术sephadexg25分子筛层析deaecellulose离子交换层析蛋白质提取技术硫酸铵盐析透析膜分离技术等蛋白质含量测定消光系数法folin酚法测定igg蛋白质含量蛋白质分子量纯度活性测定sdspage电泳法检测单向免疫扩散法猪脾脏dna提取及含量鉴定实验二21内容提要为了研究dna分子在生命代谢中的作用常常需要从不同的生物材料中提取dna
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
实验二电泳
信号放大作用
间接检测法：
a.二级抗体可测定多种多样的一级
抗体从而避免了逐一标记一级抗体; b. 一抗通常能与几个二抗分子结合， 从而起了信号放大的作用。Western 印迹法检测蛋白的敏感 性为1-5ng。 缺点：是一抗可能会与二抗发生交 叉反应，产生非特异性条带；检测 过程增加了额外的温育步骤。
床上轻轻摇动50min。
(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋内。
加入封闭液后的塑料袋
一抗反应
二抗反应
3、与酶标第二抗体结合 (1)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇 动50min。 (2)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除 Tween-20。
二、实验目的
通过蛋白质标准曲线求出IgG重链的分子量 检测人体患病状态下IgG蛋白含量的差异
三、实验步骤
两个胶条分别处理
宽 胶 条 窄 胶 条
考马斯亮蓝R250染色
标人 准血 蛋清 白
人 血 清
转印后免疫染色
染色、脱色
•
将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水
清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250
染色液染色1小时左右，然后换成脱色液
临床免疫和免疫检验实验指导
临床免疫和免疫检验实验指导（一）免疫血清的制备与鉴定实验一、免疫血清的制备机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。
一种抗原能否引起免疫反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。
另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
上述条件具备时，抗原经合适途径，选择合适剂量及次数，进入机体内，经过一段潜伏期，抗体水平就逐渐升高，维持高峰，既高效价抗体。
利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。
制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外，还需注意选择合适的动物及注射的途径，抗原剂量、注射次数等有密切关系。
（一）抗原制备和动物的选择1．抗原的制备：为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清，首先要选择合适的抗原。
抗原的特异性除与其分子量大小有关外，还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。
抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。
在天然抗原中又可分为可溶性抗原（如血清、毒素、组织浸出液等）、颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）及半抗原（本身无免疫原性，必须与载体结合才有免疫原性）。
2．动物的选择：实验室多选用家兔、豚鼠（或鸡），商品性生产多用马、羊，特殊情况选用猴。
在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。
（二）抗原的注射途径和剂量1．注射抗原的途径：通常可采用静脉、腹腔或皮下途径，皮内或肌肉途径较少采用。
近期发展在局部淋巴结或足等部位注射抗原。
不同途径，抗原在体内代谢速度不同，因而产生抗体的水平不同。
在皮下组织中能长期贮留的抗原，特别是与佐剂相混合的抗原，可以从皮下组织内缓慢释放出来，有利于抗体的产生。
2．抗原剂量及注射次数：应随抗原的性质而异。
3．每次注射间隔时间：不同抗原和不同免疫方法，可从数日到数周，一般无佐剂抗原为2~4天。
加佐剂抗原为10~15天。
（三）佐剂的作用原理及种类：1．原理：佐剂又称免疫增强剂。
实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定免疫球蛋白
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四肽链结构 所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重
链（H）和两条轻链（L）。
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三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
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2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
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6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
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三、试剂与器材
1、膜转移缓冲液
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2、TBST缓冲液
3、封闭液 含有5%脱脂奶粉的TBST液。
4、DAB显色
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实验器材
半干转移槽 PVDF (聚偏氟乙烯)膜 两张厚的滤纸 刀片 塑料盒
2、应用Western Blotting技术鉴定经 SDS-PAGE分离后的目标蛋白。
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二、原理
Western Blotting简称蛋白质印迹法。蛋白质 样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋 白质区带通过电泳方法转移、固定到载体 （如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价 键的形式与蛋白质结合，从而固定蛋白质； 以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一 抗体起免疫反应，再和酶标记的第二抗体反 应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置 含底物的溶液中温育，即可检测出样品中的 特异蛋白质组分。
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7、分离胶缓冲液（PH8.8）
36.3g Tris,48ml 1mol/L HCl, 加水至100ml.
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8、5xSDS凝胶上样缓冲液
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四、实验步骤：
1、聚丙烯酰胺凝胶的制备
根据目的蛋白质的相对分子质量大小确定凝胶使用浓度，浓缩胶一般为3%~5%
分离胶浓度与蛋白质分子质量的关系
ApoB及其抗体制备综合性实验
ApoB及其抗体制备综合性实验200631800112 温生超抗原免疫动物产生的抗体是血清γ-球蛋白的一部分。
γ-球蛋白是一组结构相似，但又有差异的蛋白质，通称为免疫球蛋白，按其结构和免疫化学性质的差异，又可分为五类，分别称为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE, 抗体以IgG最为稳定。
因蛋白在体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别，可分别采用多克隆抗体制备法和单克隆抗体制备法。
一、目的本试验主要以临床检验应用为目的，培养学生的综合分析和实际操作能力。
二. 蛋白质提取纯化 (纯化ApoB为例)1, 提取采人外周血液(不抗凝)，离心得血清，用半饱和硫酸铵沉淀球蛋白，弃上清，留沉淀（球蛋白部分）2,纯化上柱层析，分部收集，浓缩，冰冻干燥，－80℃保存3,鉴定(1) 电泳，观察每组份电泳带，若为单一带即为免疫纯。
(2) 估价分子量，通过SDS-PAGE估价分子量(3) pI测定，通过等电技术测定pI(4) 氨基末端分析（C-末端，N-末端）(5) 已知ApoB抗体进行免疫鉴定三. 抗体的制备1．多克隆抗体的制备(1)抗原:目前所知的载脂蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物，即具备有抗原性。
抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。
载脂蛋白因具备抗原特异性和免疫原性，因此可称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。
抗原应该是纯化品，该纯品在12.5％的PAG 电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。
先用大白兔,为批量生产，以采用山羊或绵羊(2) 佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。
人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freund’adjuvant)，具有明显的免疫刺激作用。
福氏佐剂又可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂，由羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯为乳剂。
油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延长，从而减少加强注射的次数。
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溶解，搅拌下逐滴加入5 ml饱和硫酸铵，室温
10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。离
心，取沉淀。重复沉淀三次可提高分离物纯度。
方法步骤
（2）脱盐：用透析法（或用凝胶过滤法）
用少量生理盐水将沉淀溶解，用毛细滴管将其移 入透析袋中，两端扎紧，将透析袋浸没于大烧杯 中，先对蒸馏水透析12小时，换液两次，再对生 理盐水透析，换液三次以上，直至透析液中无
NH+4（用奈氏试剂检验，无黄色出现），无 硫酸根离子（1%氯化钡检验，无白色沉淀）。
方法步骤
（3）浓缩：
经透析的蛋白质溶液，如果浓度太稀，可在透析
袋中用冷风（10 ℃以下）吹，或包埋于脱水剂
（变色硅胶、聚乙二醇、蔗糖等）中浓缩。
方法步骤
（4）测定：
提取的蛋白溶液用生理盐水稀释后，用紫外分光光 度计测定其280nm和260nm时的光密度。按下列 公式计算蛋白质浓度。
实验二、免疫球蛋白的提纯
概 述
从血清中（或体液中）分离免疫球蛋白就是根
据各类免疫球蛋白与其他血清蛋白的分子大小、
电离密度、等电点及在水溶液中溶解度不同的
特性，将他们分离出来，进而加以纯化。免疫
球蛋白的分离与纯化是免疫学实验技术的基础。 免疫球蛋白分离与纯化的方法很多，常用的有 盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法及亲和 层析法等。
由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结
合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它
们分开。
在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：
球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为球蛋
白和球蛋白，最后为白蛋白。
亲和层析法
由于抗原和抗体可发生特异性的可逆结合，先将
抗原或抗体等偶联到某种固相载体上装柱，再加 入分离样品进行层析。样品中的特异性抗体或抗 原被吸附，其它成分则从层析柱下端流出。再用 洗脱剂将吸附在柱上的抗体或抗原解离洗脱下来， 即可得到纯化的抗原或抗体。
等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。
+ + + +
碱 碱 + 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 （悬浮） （悬浮） 脱水作用 脱水作用
+ +
酸
酸
- - 带负电荷的蛋白质 （悬浮） 脱水作用
-
-
+ + + + 中和电荷 + + + 带正电荷的蛋白质 （悬浮）
中和电荷 -
-
-
带正电荷的蛋白质 （沉淀）
盐析法
在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分
子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离
子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋
白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，
并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。
各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同， 控制盐的浓度，能将血清中免疫球蛋白分离出来。 盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白
Lowry-kalokar公式：蛋白浓度（mg/ml） =1.45*OD280-0.74*OD260
OD读数以1.0左右最为适宜，如OD>2时就需要稀释， 计算蛋白浓度时应乘上稀释倍数。
离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反
电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。
常用的离子交换剂有DEAE纤维素（ 球蛋白）和
QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴
离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其
阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。
当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋
凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状 凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形 状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。
一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时
速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱
较快。
常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和
琼脂糖凝胶等。
离子交换层析法
硫酸铵盐析法提纯血清 中的免疫球蛋白
材料
器材：
1、紫外分光光度计、磁力搅拌器、离心机；
2、三角瓶、吸管；3、透析袋
试剂：
4. 1%BaCl2 5. 奈氏试剂
1、饱和硫酸铵溶液；2、生理盐水； 3、血清
方法步骤
（1）盐析：
血清5ml用等量生理盐水稀释，逐滴加入饱和硫酸铵 10 ml，边加边搅拌，加完后继续搅拌10min，室温 10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。 4000rpm离心15-30min，取沉淀用10 ml生理盐水
带负电荷的蛋白质 （悬浮）
用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度 高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。 用33.3%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获 得较纯的IgG，但会损失一部分-球蛋白。 用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但-球蛋白 也会同时沉淀。
如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用 50%的饱和硫酸铵。