普罗布考对高糖诱导的脂肪间充质干细胞损伤的保护作用
普罗布考抗动脉粥样硬化作用机制及研究进展_李婷婷
普罗布考抗动脉粥样硬化作用机制及研究进展李婷婷■(综述),郭 媛(审校)(山东大学齐鲁医院心内科,济南250012)基金项目:山东省科技发展计划项目(2007G G 20002025)中图分类号:R 972.6 文献标识码:A 文章编号:1006-2084(2009)09-1390-03 摘要:早期大量的药理及临床实验发现,普罗布考具有降低血脂、抗氧化、抗炎等作用,但由于其可降低高密度脂蛋白胆固醇(H D L -C ),使其在临床上的应用受到影响。
近年的研究证明,普罗布考虽然降低血H D L -C 浓度,但并不降低其转运胆固醇酯的作用,甚至增加其转运能力,并可稳定和消退动脉粥样硬化斑块,改善血管内皮功能,减少动脉粥样硬化的发生、发展。
现就普罗布考抗动脉粥样硬化作用机制的研究新进展予以综述。
关键词:普罗布考;动脉粥样硬化;抗氧化;抗炎症A n t i -a t h e r o s c l e r o s i s Me c h a n i s m a n dS t u d yP r o g r e s so f P r o b u c o l L I T i n g -t i n g ,G U O Y u a n .(D e p a r t -m e n t o f C a r d i o l o g y ,Q i l uH o s p i t a l o f S h a n d o n g U n i v e r s i t y ,J i n a n 250012,C h i n a )A b s t r a c t :E a r l y p h a r m a c o l o g i c a l a n d c l i n i c a l t r i a l s f o u n dt h a t P r o b u c o l h a d m a n y e f f e c t s s u c ha s l o w i n g b l o o d f a t ,a n t i -o x i d a t i o na n da n t i -i n f l a m m a t o r y ,b u t b e c a u s e i t c a n a l s o d e c r e a s e h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n c h o -l e s t e r o l (H D L -C ),i t s c l i n i c a l a p p l i c a t i o n w e r e l i m i t e d .R e c e n t r e s e a r c h e s h a v e p r o v e d t h a t P r o b u c o l d o e s n o t r e d u c e i t s r o l e o f c h o l e s t e r o l e s t e r t r a n s f e r ,o r e v e ni n c r e a s e i t st r a n s i t c a p a c i t y .I t c a ns t a b i l i z ea n dr e g r e s s a t h e r o s c l e r o t i c p l a q u e ,i m p r o v ev a s c u l a r e n d o t h e l i af u n c t i o na n dr e d u c e t h e o c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n t o f a t h e r o s c l e r o s i s .T h i s a r t i c l e r e v i e w s p r o b u c o l a b o u t i t s a n t i -a t h e r o s c l e r o s i s m e c h a n i s m .K e yw o r d s :P r o b u c o l ;A t h e r o s c l e r o s i s ;A n t i -o x i d a t i o n ;A n t i -i n f l a m m a t o r y 随着生活水平提高和人口老龄化,心脑血管疾病发病率呈上升趋势,有关动脉粥样硬化(a t h e r o s c l e -r o s i s ,A S )的研究也成为临床和基础研究的热点,其确切机制尚未完全阐明,因而对A S 的防治缺乏有效的措施。
普罗布考对糖尿病肾病的治疗研究
plant，2003，18： 1321-1329．
77： 543-549．
［20］Eitner F，Ackermann D，Hilgers RD，et al． Supportive versus immuno-
［27］Lou T，Wang C，Chen Z，et al． Randomized Controlled trial of le-
0. 64 ± 0. 072
血肌酐 / μmol·L － 1 50. 7 ± 2. 4 52. 0 ± 3. 7 52. 5 ± 4. 9
总胆固醇 / mmol·L － 1 1. 55 ± 0. 27 1. 61 ± 0. 44 1. 52 ± 0. 25
therapy for IgA nephropathy associated with crescenteric change： an
phropathy： results of a 3-year prospective placebo-controlled ran-
effective treatement［J］． Clin Nephrol，2001，56： 193-198．
prednisolone and cyclophosphamide slow the progression of moderately
costeroids dose not benefit patients with IgA nephropathy［J］． J Am
advanced IgA nephropathy［J］． Clin Nephrol，2000，53： 1-9．
周后观察大鼠血糖（ Glu） 、血脂（ TG 及 T － CH） 、血肌酐（ Scr） 、尿白蛋白排泄率（ UAER） 、肾质量、肾肥大
普罗布考治疗高血脂非增生型糖尿病视网膜病变的效果
普罗布考治疗高血脂非增生型糖尿病视网膜病变的效果目的探究普罗布考治疗高血脂非增生型糖尿病视网膜病变的临床疗效。
方法对我院2011年9月～2012年9月临床确诊为高血脂非增生型糖尿病视网膜病变的患者50例100只眼，进行治疗。
把患者进行随机平均分组，分为治疗组和对照组，每组25例患者50只眼。
对两组患者进行同样的饮食、运动指导，并服用降糖药或者注射胰岛素，来控制血糖、血压，在此基础上对治疗组的患者使用普罗布考进行治疗，而对照组的患者只口服阿托伐他汀。
对患者进行长期的治疗，观察其各项指标，进行分析。
结果治疗组与对照组患者的微动脉瘤，相比治疗前都有减轻，总有效率分别为68.26%，34.45%，两组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。
治疗组与对照组在治疗后视力回升的总有效率分别为45.28%，42.36%，两组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
两组患者在治疗后黄斑水肿例数相对于治疗前有明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
在治疗后，患者的甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇都有明显下降，而且治疗组的8-羟基脱氧鸟苷相对与对照组更低。
结论使用普罗布考治疗高血脂非增生型糖尿病视网膜病变能够降低患者的血脂、恢复患者的视力、还能有效的减轻黄斑水肿的情况，是值得临床应用推广的方法。
标签：高血脂；糖尿病视网膜病变；黄斑水肿；药物治疗在生活条件日益增强的时代，由于经济的发展和社会各级医疗设施的完善，人们的寿命也有了一定的延长，由于生活不规律和不良的饮食习惯等使得越来也多的人成为糖尿病患者[1]。
如今在世界各国，糖尿病已经成为主要的公共卫生问题，严重影响人们的健康，尤其是我国的情况更加不容乐观。
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）则是糖尿病患者主容易发生的微血管并发症，在目前是导致眼盲的主要眼病。
高血脂是促进DR重要因素，所以采用降脂治疗的方法，对于糖尿病视网膜的治疗和预防有不错的效果[2]。
合成抗氧化剂普罗布考片的药理作用及临床应用
合成抗氧化剂普罗布考片的药理作用及临床应用药品库房房伟普罗布考最早作为降脂药物应用于临床，近年来大量研究发现它具有强大的抗氧化功能。
与天然抗氧化剂不同的是，普罗布考属于合成的抗氧化应激药物，目前已经成为抗氧化剂代表药物，在临床多个领域得以广泛应用。
1药理作用普罗布考为疏水性抗氧化剂，抗氧化作用强，进入体内分布于各脂蛋白，被氧化为普罗布考自由基，阻断脂质过氧化，减少脂质过氧化物的产生，减缓动脉粥样硬化病变的一系列过程。
同时普罗布考能抑制HMG-CoA还原酶，使Ch合成减少，并能通过受体及非受体途径增加LDL的清除，血浆LDL-C水平降低；通过提高CE转移蛋白和apoE的血浆浓度，使HDL颗粒中Ch减少，HDL颗粒变小，提高HDL数量和活性，增加HDL的转运效率，使Ch逆转运清除加快。
2药代动力学本品经胃肠道吸收有限且不规则，如与食物同服可使其吸收达最大。
一次口服本品后18小时达血药浓度峰值，T1/2为52-60小时。
每天服本品，血药浓度逐渐增高，3-4个月达稳态水平。
本品在体内产生代谢产物。
口服剂量的84%从粪便排出，1%-2%从尿中排出，粪便中以原形为主，尿中以代谢产物为主。
3临床应用3.1防治缺血性卒中3.1.1 一级预防普罗布考可有效降低ox-LDL，延缓动脉粥样硬化进展，稳定易损斑块，减少临床事件。
高胆固醇血症、高血压、吸烟、代谢综合征以及体重超标等均为心脑血管疾病的独立危险因素，亦是疾病一级预防的重要控制环节。
侯晓强等研究显示颈动脉粥样硬化患者经普罗布考治疗后血清ox-LDL水平较治疗前显著下降，亦有研究显示普罗布考能显著增加一氧化氮(NO)含量，有效改善内皮功能。
张梅等采用超声声学密度定量技术研究普罗布考对动脉粥样硬化患者斑块回声强度的影响，结果显示普罗布考可显著增加斑块声学密度，有效稳定斑块。
3.1.2 急性期治疗缺血级联反应是缺血性卒中急性期组织缺血性损伤的重要机制，而氧化应激又是该瀑布式反应的关键环节。
普罗布考对高脂饮食兔胸 主动脉内皮功能作用及其机制研究
■论著■普罗布考对高脂饮食兔胸主动脉内皮功能作用及其机制研究周京敏 赵 刚 秦胜梅 李双杰 卜丽萍 章朝霞 张新刚 葛均波(复旦大学附属中山医院,上海市心血管病研究所,上海 200032)摘要 目的:探讨普罗布考(Probucol)对高胆固醇饮食兔动脉粥样硬化模型内皮功能的作用及可能作用机制。
方法:成年新西兰白兔26只(1.5～2.5kg/只)随机分为3组:正常饮食组(普通饮食,n=6)、高脂饮食组(高脂饮食,n=10)和普罗布考治疗组(高脂饮食+普罗布考200mg/kg,n=10)。
在高脂饲养前和饲养后第12周,测血清总胆固醇浓度。
第12周后处死动物,检测离体胸主动脉环对乙酰胆碱(Ach)与硝普钠(S NP)的反应,并测定胸主动脉丙二醛(M DA)、谷胱甘肽过氧化物酶(G SH-PX)、总NOS活性。
结果:普罗布考对血脂有明显降低作用;和正常饮食组比较,高脂饮食组胸主动脉对Ach引起的最大的内皮依赖性舒张(E DR)反应明显减弱(0.16±0.04vs0.65±0.14,P<0.05),G SH-PX和NOS活性明显降低(G SH-PX:47.5±26.6vs86. 7±47.6,P<0.05;NOS:1.0±0.2vs2.6±0.9,P<0.05),M DA显著增加(12.1±5.5vs3.8±1.9,P<0.05);而普罗布考组E DR反应较高脂饮食组显著改善(0.60±0.10vs0.16±0.04,P<0.05);G SH-PX和NOS活性明显增加(G SH-PX:95.2±32. 3vs47.5±26.6,P<0.05;NOS:2.8±1.3vs1.0±0.2,P<0.05),M DA显著增加(12.1±5.5vs3.8±1.9,P<0.05)。
普罗布考对高脂家兔胸主动脉内皮储备功能的保护作用
普罗布考对高脂家兔胸主动脉内皮储备功能的保护作用赵刚;周京敏;李双杰;卜丽萍;章朝霞;张新刚;李高平;葛均波【期刊名称】《中国动脉硬化杂志》【年(卷),期】2004(12)3【摘要】为观察口服普罗布考对高胆固醇血症和动脉粥样硬化免主动脉的内皮储备功能的影响,并探讨其可能作用机制。
将26只新西兰白兔(体重1.5-2.5 kg)随机分为3组:正常饮食组(普通饮食,n=6)、高脂饮食组(高脂饮食,n=10)、普罗布考治疗组(高脂饮食+普罗布考200mg/kg,n=10)。
在高脂饲养前和饲养后第12周,抽血测血清总胆固醇浓度。
第12周后处死动物,取胸主动脉,检测离体胸主动脉环对乙酰胆碱与硝普钠的反应。
结果发现,①普罗布考有降血脂作用(39.1％);②与正常饮食组相比,高脂血症兔胸主动脉对乙酰胆碱引起的最大的内皮依赖性舒张反应明显降低(0.65±0.14比0.16±0.04,P<0.05),普罗布考能明显保护高胆固醇血症所损伤的内皮依赖性舒张反应(两组最大血管舒张度分别为0.60±0.10比0.16±0.04,P<0.05);③3组对硝普钠所致的非内皮依赖性舒张反应均没有差别。
结果提示普罗布考主要是通过降血脂和抗氧化两个途径来保护高脂家兔胸主动脉内皮储备功能。
【总页数】3页(P333-335)【关键词】内科学;高胆固醇血症;普罗布考;内皮储备功能;兔胸主动脉【作者】赵刚;周京敏;李双杰;卜丽萍;章朝霞;张新刚;李高平;葛均波【作者单位】上海市心血管病研究所复旦大学附属中山医院;南华大学附属第一医院【正文语种】中文【中图分类】R54【相关文献】1.普罗布考对高脂饮食兔胸主动脉内皮功能作用及其机制研究 [J], 周京敏;赵刚;秦胜梅;李双杰;卜丽萍;章朝霞;张新刚;葛均波2.血脂康对高脂饮食家兔血管内皮细胞功能的保护作用 [J], 郑晓伟;曾定尹;王晓静3.普罗布考对内皮细胞增殖和分泌功能的保护作用 [J], 谢志忠;朱炳阳;曹建国;严鹏科;余麟4.姜黄素对食高脂饲料家兔血管内皮功能的保护作用 [J], 孙秀才;冯建章;裴晓阳;盛小刚;余细勇5.畅脉舒对高脂喂养家兔内皮依赖性舒张的保护作用 [J], 宋秀媛;王家富;姜波;刘同美;段文卓;王建英;丁怡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
普罗布考对高密度脂蛋白胆固醇代谢的影响及其作用机制
普罗布考对高密度脂蛋白胆固醇代谢的影响及其作用机制洪绍彩;赵水平
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2004(020)011
【摘要】普罗布考是一种调脂药,其在降脂同时显著降低了血浆HDL-C含量却能抗动脉粥样硬化.高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)在体内的代谢过程目前尚未清楚,有研究表明普罗布考通过促进胆固醇逆向转运途径而抗动脉粥样硬化.文章综述普罗布考对体内HDL-C代谢的影响及其作用机制.
【总页数】4页(P1218-1221)
【作者】洪绍彩;赵水平
【作者单位】中南大学湘雅二医院心内科,湖南长沙,410011;中南大学湘雅二医院心内科,湖南长沙,410011
【正文语种】中文
【中图分类】R-05;R341.35;R344.81;R543.3;R543.502.3;R972.6;R977
【相关文献】
1.普罗布考联合瑞舒伐他汀对冠心病患者胆固醇代谢及炎症因子的影响研究 [J], 刘宁;黄宇玲;白华;王志军
2.高密度脂蛋白胆固醇代谢及其对冠心病影响的研究进展 [J], 陈国良;刘立伟;谢爽;刘红;刘玉清
3.普罗布考对动脉粥样硬化兔的高密度脂蛋白逆转运功能中酶蛋白和受体的影响[J], 钟建开;吴焱贤;陈盈文;李琛;黎文生;郭志刚
4.普罗布考联合阿托伐他汀对高密度脂蛋白亚型和甘油三酯水平的影响 [J], 赵明;任艺虹;江华;黄婷婷;尚文玲;周玫;贾晓兰;马纬纬
5.肥胖对高密度脂蛋白胆固醇代谢的影响 [J], 张天凤(综述);王大新(审校)
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普罗布考对高脂血症性急性胰腺炎金黄地鼠脂质过氧化及细胞因子的影响
表4
组别
D组 P组 t值 P
鲁组金黄地鼠血清 MDA ODT-AOC 的水平xsn=30
MDA
SOD
T-AOC
(nmoI/Laprot) (U/mgaprot) (U/mgaprot)
6.171.03
286.2555.41
2.370.51
CHEN Xiaoxue FAN Oingiao Department of HepatobiIiary Surgery, the University of South China AffiIiated First PeopIe's HospitaI of Chenzhou City in Hunan Province, Chenzhou 423000, China [abstract] Objective To investigate the effects of probucoI on hyperIipedemic acute pancreatitis in goIden hamsters. Methods GoIden hamsters were fed a high-fat diet for four weeks to induce hypertrigIyceridemia and randomIy into controI group and ex-perimentaI group. The controI group and experimentaI group were then used to induce HL-AP by giving intraperitoneaI injections of L-arginine. By assessed the whoIe body oxidative by MDA,SOD and T-AOC; to measure the IeveIs of cytokines(TNF- and IL-6> in serum at different times. Results The content of MDA in serum were decreased by probucoI compared with the controI group,whiIe the IeveIs of SOD and T-AOC were increased by ProbucoI. The IeveIs of TNF- and IL-6 of experimentaI group were significant Iower than controI group. Conclution Our resuIts support the potentiaI therapeutic appIication of probucoI in hyperIipedemic acute pancreatitis. [key words] ProbucoI; HypertrigIyceridemia; Acute pancreatitis; Lipid oxidation
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普罗布考对高糖诱导的脂肪间充质干细胞损伤的保护作用王哲;刘晓玉;张殿宝;王喜良;林学文;王秋实【摘要】目的探讨普罗布考在保护人脂肪间充质干细胞(hADSCs)对抗高糖引起损伤中的作用及机制.方法原代培养人脂肪间充质干细胞hADSCs,应用免疫荧光对3～5代细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105进行表型鉴定.将hADSCs分为正常糖对照组(CON组)、高糖组(GLU组)、普罗布考+高糖组(PRO+GLU组)、抑制剂SB203580+高糖组(SB+GLU组)、普罗布考组(PRO组)、抑制剂SB203580组(SB组).MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平.Western blot技术检测p-p38MAPK蛋白的表达水平.结果与CON组比较,GLU组hADSCs细胞增殖活性明显降低(P＜0.05),凋亡细胞比例、ROS水平显著增加(P＜0.05);与GLU组比较,PRO+GLU组和SB+GLU组hADSCs细胞细胞增殖活性都明显增加(P＜0.05),凋亡细胞比例、ROS水平表达水平均显著降低(P＜0.05);与CON组比较,GLU组p-p38MAPK表达水平明显上升,普罗布考预处理能明显抑制高糖诱导的p-p38MAPK表达水平上调.结论普罗布考能帮助hADSCs对抗高糖引起的损伤;p38MAPK通路参与高糖对hADSCs 的损伤作用;普罗布考可通过抑制p38MAPK通路的激活保护hADSCs对抗高糖诱导的损伤.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2014(043)007【总页数】6页(P615-620)【关键词】普罗补考;脂肪间充质干细胞;p38MAPK;活性氧【作者】王哲;刘晓玉;张殿宝;王喜良;林学文;王秋实【作者单位】中国医科大学盛京医院输血科,沈阳110004;中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室,干细胞与再生医学研究室,沈阳110001;中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室,干细胞与再生医学研究室,沈阳110001;沈阳202医院生殖中心,沈阳11003;中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室,干细胞与再生医学研究室,沈阳110001;中国医科大学盛京医院输血科,沈阳110004【正文语种】中文【中图分类】R363.21糖尿病足部溃疡（diabetic foot ulcers，DFUs）在糖尿病患者中的发病率高达25%，这些患者中14%～ 24%最终需要接受截肢治疗［1，2］。
国内外治疗DFUs的传统疗法效果不佳，虽然创面愈合技术在不断发展，但是仍有近50%的患者未能治愈。
人脂肪间充质干细胞（human stem cells derived from adipose tis⁃sue，hADSCs）是一种来源于脂肪组织的间充质干细胞，动物和临床试验均已经证实hADSCs对DFUs有明显的促进作用［3］。
尽管自体hADSCs治疗皮肤溃疡取得了很好的效果，但是一些研究中仍然发现由于糖尿病患者hADSCs功能损伤导致DFUs患者愈合不良［4］。
普罗布考（又名丙丁酚，probucol，PRO）作为降脂药应用于临床，近年的研究发现它有较强的抗氧化作用［5］。
最近，本研究小组证实抗氧化剂普罗布考具有间充质干细胞保护作用，能对抗高糖诱导的氧化应激损伤［6］。
另有报道指出，高血糖可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）家族中的一个成员——p38MAPK，继而引起间充质干细胞氧化应激损伤［7］。
因此，我们推测普罗布考可通过抑制p38MAPK通路对抗高血糖引起的脂肪间充质干细胞（stem cellsde⁃rived from adipose tissue，ADSCs）损伤。
本研究体外分离培养hADSCs，并应用抗氧化剂普罗布考和p38MAPK抑制剂进行干预，通过对干细胞p38MAPK表达水平、细胞增殖能力、氧化和凋亡的检测，探讨普罗布考是否通过调控p38MAPK对抗高血糖引起hADSCs损伤，为临床上提高自体干细胞移植治疗DFUs后供体干细胞的功能提供新的依据。
1.1 材料中国医科大学附属盛京医院整形外科在无菌条件下取健康成人脂肪组织（经医院伦理委员会许可和患者同意）100 g；普罗布考原料药（山东齐鲁药业有限公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；荧光标记的抗CD34、CD45、CD90、CD105抗体（美国Bioleg⁃end公司）；葡萄糖（美国Sigma公司）；人间充质干细胞培养基（美国Stem Cell Technology公司）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；MTT测试剂盒（碧云天生物试剂公司）；膜联蛋白V和碘化丙锭双标记试剂（美国R&D公司）；抗p38、p⁃p38抗体及SB203580（p38MAPK抑制剂）（美国Cell Signaling Technology Inc）。
1.2 方法1.2.1 hADSCs分离与培养：除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入2倍体积胶原蛋白Ⅰ，37℃消化60 min，终止消化后于细胞筛上过滤，1 500 r/min离心5 min，收集细胞后以2× 105/mL的浓度接种于培养瓶中，置于37℃，5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，记为P0。
根据细胞贴壁情况，1～2 d全量换液1次。
待细胞增殖80%～90%时，按1∶3的比例传代记为P1。
3～5代hADSCs用于下一步实验。
1.2.2 hADSCs的鉴定：收集原代培养的第三代细胞，制成单鉴定细胞悬液后分别与荧光标记的CD34、CD45、CD90和CD105抗体反应，室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液清洗后，用500 μL磷酸盐缓冲液悬浮细胞后流式细胞仪检测CD34、CD45、CD105的表达率。
1.2.3 诱导hADSCs向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化及鉴定：诱导第3代分离培养的hADSCs向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，培养21 d后进行鉴定，具体方法参照文献［8，9］。
1.2.4 细胞分组及干预处理：用无血清正常糖培养基培养24 h使各组细胞同步化。
按下述分组分别更换不同的培养基继续培养，（1）正常糖（5 mmol/L，CON）不同时间组；（2）高糖（30 mmol/L，GLU）不同时间组；（3）普罗布考+高糖（PRO+GLU）组：含50 μmol/mL普罗布考的培养基预处理12 h后更换30 mmol/L高糖培养基作用不同时间组；（4）抑制剂SB203580+高糖组（SB+GLU组）：含5 μ mol/L SB203580的培养基预处理60 min后更换30 mmol/L高糖培养基作用不同时间组；（5）普罗布考不同时间组（50 μmol/mL，PRO组）；（6）抑制剂SB203580不同时间组（5 μmol/L，SB组）。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖活性：设4个时间点：1 d、2 d、3 d和4 d进行检测，检测前2 h向各组细胞每孔中加入MTT（Amresco）溶液，放入培养箱孵育4 h 后，取出，避光条件下加入二甲基亚枫（Amresco）100 μL，570 nm波长条件下酶标仪检测光密度（opti⁃cal density，OD）值。
1.2.6 ROS检测：对高糖作用后48 h的各组细胞内ROS的含量进行检测。
DCFH⁃DA是能自由穿过细胞膜本身没有荧光的物质。
DCFH⁃DA被细胞内的酯酶水解成DCFH后不能自由通透细胞膜。
细胞内ROS可将无荧光的DCFH氧化成发出绿色荧光DCF。
绿色荧光的强弱即可反映细胞内ROS的水平。
将赖氨酸包被的盖玻片置于24孔培养板内，然后将hADSCs细胞均匀接种于盖玻片上培养24 h。
按照实验要求将细胞处理完成后，用PBS漂洗盖玻片2次，然后向每孔中加入含10 μmol/L DCFH⁃DA的0.5 mL无血清培养液，并在37℃条件下培养30 min。
在荧光显微镜下随机选取4个不重复区域摄片，并采用ImageJ1.44软件的Color Histogram模块计算出每个视野绿色荧光强度的平均值（meanfluo⁃rescenceintensity，MFI），再对各样本进行统计分析。
1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡：24孔板培养细胞，按照上述分组作用48 h后，胰蛋白酶消化并收集各组细胞，以PBS清洗2次，加入膜联蛋白V和碘化丙锭双标记试剂，按试剂盒说明书对样本进行处理后，避光15 min。
通过流式细胞仪（BD生命科学公司）检测细胞凋亡，每组至少检测500个细胞，重复3次。
1.2.8 蛋白表达量的检测：对高糖作用后60 min的CON组、PRO+GLU组、SB+GLU组细胞p⁃p38MAPK和t⁃p38MAPK蛋白含量进行检测。
细胞接种于60 mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。
总蛋白经SDS⁃PAGE分离后，转移到PVDF膜上。
用5%脱脂奶粉封闭2 h，随后加入兔抗人t⁃p38、p⁃p38抗体（1∶1 000）和小鼠抗人GAPDH（1∶500），4℃过夜，TBST洗3次，10 min/次。
采用ECL⁃plus显色试剂盒在Bio⁃Rad显色仪显色。
以GAPDH的表达量作为内参校正上样量的不均衡。
采用Quantity One软件分析免疫条带的灰度值。
1.3 统计学分析所有实验数据均重复3次以上，数据用x±s表示，利用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（one⁃way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 hADSCs培养与鉴定原代培养获得的hADSCs接种到培养瓶中，12 h后部分细胞开始贴壁，3～4 d贴壁后细胞呈纺锤形，随后细胞开始集落生长至10 d时已有较大集落形成，细胞呈纤维形（图1），即可传代。
传代后细胞生长迅速，3～4 d即可传1代。
传至第3代时，细胞形态均一。
经免疫组织化学染色后，细胞表达CD90和CD105，不表达CD45和CD34。
2.2 hADSCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化能力hADSCs成骨诱导21 d细胞内与明显矿物质沉积，四唑硝基蓝染色可见蓝紫色矿化结节，见图2A；hADSCs成软骨诱导22 d，经艾茜蓝染色可见蓝色的软骨细胞，见图2B；hADSCs成脂肪诱导14 d，镜下细胞可见明显脂滴，经油红O染色脂滴呈红色，见图2C。
2.3 MTT结果3 d、5 d、和7 d时间点GLU组与CON组MTT检测结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；普罗布考预处理12 h能明显阻断高糖引起的hADCSs细胞增殖活性降低，3 d、5 d和7 d时PRO+GLU组与GLU组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与普罗布考的保护作用相似，p38MAPK的抑制剂SB203580（3μmol/L）预处理60 min能抑制hADSCs对抗高糖引起的增殖活性降低（P＜0.05），其中3 d、5 d和7 d时间点SB+GLU组与GLU组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。