放线菌新种分类鉴定
细菌分类鉴定规程
细菌分类鉴定规程细菌分类鉴定规程杜艳、余翔、罗国升新菌鉴定主要流程：1、潜在新菌的确定拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN ()或EzTaxon server 2.1() 进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。
2、选择标准菌株构建进化树选择参考菌株构建三种进化树(NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。
3、购买标准菌株根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。
具体信息可以在上查找。
标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些属的所有的种，则要选择这些属的模式种，并且要选择模式种的模式菌株。
2) 一个属的模式种是最重要的参照微生物，如果一个新种被认为属于这个属，就一定要与该属的模式种进行比较，而其他的种可能分类时出现错误，可能将来会被重新分类。
总之，进行种、属、甚至是科的比较研究时，都要用模式微生物，这就涉及到模式属的模式种，模式种的模式菌。
4、表型特征实验培养特征：菌落特征(如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等)。
细胞形态：形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)，大小，排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)。
特殊的细胞结构：鞭毛(着生位置、数量)，芽胞(形状、着生位置、是否膨大)，孢子(孢子形状、着生位置、数量、排列)，其它 (荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连鞘体等)。
超微结构：细胞壁、细胞内膜系统、放线菌抱子表面特征等。
2006～2018年稀有放线菌中的新天然产物
2006～2018年稀有放线菌中的新天然产物放线菌是一类十分重要的植物病原微生物，它们可以对植物产生重大的伤害，也是研究药物、农药、肥料和植物病理学的重要材料。
近年来，有越来越多的证据表明，放线菌也可以产生有益的物质，例如抗微生物活性物质和天然产物。
有研究表明，近几年来以放线菌为目标，科学家们在2006-2018年之间发现了许多新的天然产物。
2006年，一种名为细胞孔类天然产物（Cyclomarins）的新类别被发现，该天然产物来自植物寄生放线菌Epiphyas postvittana，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性。
2007年，放线菌Xamphomonas axonopodis pv.citri被用于合成一种名为Axonopsin的新型天然产物，具有抗菌、抗葡萄球菌、抗真菌和抗病毒的活性，同时具有可溶性抗氧化特性。
此外，2008年，来自放线菌Xynthomonas campestris pv. campestris的一种叫做Xacamide的新型天然产物被发现，它具有抗菌、抗真菌、抗病毒和抗细菌性质，而且还可以抑制RNA聚合酶。
另外，一种名为Pantocinisin的特殊天然产物也于2009年被发现，它来自放线菌Pantoea ananatis，能够抑制真菌病原体的生长，其特殊的抗真菌活性被证实为与其结构有关。
2010年，一种名为尼米多稀释亚硫酸酯的新类别天然产物被发现，它来自放线菌Xanthomonas axonopodis pv. citri和放线菌Xanthomonas campestris pv. campestris，具有抑菌、抑真菌和抗病毒的活性。
2012年，一种名为糖苷衍生物的新类别天然产物被发现，来自放线菌Pseudomonas aeruginosa，具有显著的抗菌活性，能有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。
2014年，一种名为Actinomycin D的新类别天然产物被发现，来自放线菌Streptomyces varsoviensis，具有抗病毒、抗真菌性和免疫调节活性，可以抑制常见的病毒和真菌，如腺病毒、柯萨奇病毒、肺炎病毒和变形霉菌等。
微生物,放线菌分类
3 基于核酸结构的分析
(1) 16S rRNA / rDNA基因序列的分析
该技术目前在放线菌分类中常被用于放线菌种属的 初步鉴定, 但是值得注意的是仅根据该指标并不能 确定菌株的种属, 必须结合其他的分类指标。
(2)16S-23S rRNA 转录间区序列的分析
16S-23S rRNA转录间区序列( 16S-23S rRNA）的进 化速率比16S rRNA大10倍, 其序列大小比16S r RNA更具直接测序优势, 可鉴别防线菌属与种。但 是16S-23S rRNA的不同拷贝之间大小比较相近且不 易区分。
经典分类学：按微生物 表型特征分类
表型特征：形态学、生理生化学、生 态学等，推断微生物的系统发育。 表型特征结合分子水平上的基因型特 征（如16S rRNA)，探讨微生物进化地 位、系统发育关系并进行分类鉴定。
微生物系统学： 按亲缘关系和进 化规律分类
★微生物分类学的三个任务：分类、鉴定及命名 ☆分类是根据微生物的相似性和亲缘关系，将微生物归入不同的分类类群。 ☆鉴定是确定一个新的分离物属于已经确认的哪个分类类群的过程。 ☆命名是根据国际命名法规给每一微生物类群及种类以科学的名称。
5 多相分类系统
由于微生物生理生化学的迅速发展，加速了这趋势 并逐渐打破了原来经典的描述分类，建立了如数值 分类、化学分类、分子分类以至于现在的多相分类 新的标准，大大推进了分类学的发展。多相分类是 将表型、基因型以及系统进化分析数据综合起来作 为分类和进化分析的依据。
3 放线菌的应用
在植物病害防治中的应用 放线菌是人们最早应用到生产中的生防微生 物，但是已投入使用的微生物源杀虫活性物质中 多数是来自真菌，有部分来自细菌如昆虫的病原 菌苏云金杆菌，放线菌来源的较少，从放线菌中 发现的活性物质中，80%是来自链霉菌属。
一株极端嗜盐多孢放线菌新种的分类研究
ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｉ ｓ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ａ ｓ ａ ｌ ｔ ｌ ａ ｋ ｅ ｉ ｎ Ｘｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｐｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ，ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ — Ｗｅ ｓ ｔ Ｃｈ ｉ ｎ ａ ，ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ａ ｐ ｏ ｌ ｙ ｐ ｈ ａ ｓ ｉ ｃ ｔ ａ ｘ ｏ ｎ ｏ ｍｙ
ＤＮＡ — Ｄ ＮＡ 杂 交值 分 别 为 ３ ６ ． ４％ 、３ １ ． ３ ％ 和２ ６ ． １ ， 因此 被 考 虑作 为 多孢放 线 菌 属 的 一 个 新 成 员． 菌株 ＸＨＵ１ ３ ９的 最适生长温度是 ３ ５℃ ， 最 适 生 长 ｐ Ｈ ７ ． ０ ，最适 生 长盐 浓度 １ ２ ～１ ｆ ｛ ；细 胞 水 解 糖 为 ｘ ｙ ｌ ｏ ｓ 、ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ｓ ｅ 、ｒ ｉ ｂ ｏ ｓ ｅ和
ｓ ｔ ｕｄ ｙ． Ｉ ｔ ｓ ｔ ａｘ ｏ ｎｏ ｍｉ ｃ ｓ ｔ ａ ｔ ｕｓ ｉ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎｅ ｄ ｏ ｎ ｔ ｈｅ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈｅ ｐ ｈｅ ｎ ｏｔ ｙｐ ｉ ｃ， ｐｈ ｙｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇｉ ｃ ａ ｌ ，ｃ ｈ ｅ ｍｏｔ ａ ｘ ｏｎ ｏｍｉ ｃ ａ ｎ ｄ ｇｅ ｎ ｏ ｔ ｙｐ ｉ ｃ ｄ ａ ｔ ａ ｏ ｆ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ＸＨＵ １ ３９ ． Ｐｈｙｌ ｏ ｇ ｅ ｎｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ａ ｎ ａ ｌ ｍｏ ｓ ｔ — ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｔ ｅ １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ ｇ ｅ ｎｅ
海洋放线菌的分类鉴定
海洋放线菌的分类鉴定一、放线菌㈠、放线菌的分布放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。
不论数量和种类，以土壤中最多。
河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。
海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。
海水中还存在耐盐放线菌。
放线菌有一种土霉味，使水和食物变味，有的放线菌也能和霉菌一样使棉毛制品或纸张霉变。
放线菌主要能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂，最主要的致病放线菌是结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，可导致人类的结核病和麻风病。
放线菌最重要的作用是可以产生、提炼抗生素，目前世界上已经发现的2000多中抗生素中，大约有56%是由放线菌（主要是放线菌属）产生的，如链霉素、土霉素、四环素、庆大霉素等都是由放线菌产生的。
此外有些植物用的农用抗生素和维生素等也是由放线菌中提炼的。
㈡、放线菌的形态与结构放线菌菌体为单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成，最简单的为杆状或具原始菌丝。
放线菌是一种革兰氏阳性菌。
放线菌菌丝细胞的结构与细菌基本相同。
根据菌丝形态和功能可分为营养菌丝、气生丝和孢子丝三种。
⑴营养菌丝匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。
营养菌丝一般无隔膜；直径0.2-0.8微米，但长度差别很大，短的小于100微米，长的可达600微米以上；有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、蓝、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性色素，则使菌落吨呈现相应的颜色。
色素是鉴定菌种的重要依据。
⑵气生菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。
它叠生于营养菌丝上，以至可覆盖整个菌落表面。
在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，约1-1.4微米，其长度则更悬殊。
直形或弯曲而分枝，有的产生色素。
⑶孢子丝气生菌丝上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝。
孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式，随菌种而异。
孢子丝的形状有直形、波曲和螺旋形。
新属新种的知识
D3-2(93.73%) HZH-2(95.22%)一、16SrRNA基因是细菌系统分类学研究中最常用于分析的基因，它存在于所有的原核生物中，含量大，分子大小适中(约 1.SKb左右)，其基因序列中既含保守序列又含可变序列,便于进行进化距离的分析研究。
一般来说，试验菌株与已知菌的16SrRNA基因序列相似性在95%以下，可以定为新属;相似性在98%以下，可以定为新种，可见16SrRNA基因序列分析的在放线菌系统分类中的重要性，但同时它也并不是唯一指标，尤其是在区分关系较近的不同种时，其作用十分有限，16SrRNA基因相似性在98.5%~99%，仍有50%可能是新种(表1-6)。
近年来，有学者提出，当16SrRNA序列分析的结果不理想时，可改用包含更多的系统发育信息的23SrRNA基因序列代替16SrRNA基因序列;此外，人们发现一些基因转录间隔序列(ITS)，如进化速率比16SrRNA大十多倍16S- 23SrRNA间隔区基因序列，能够弥补16SrRNA基因保守性强，分化程度不够的缺点，可用于种以下分类单元的分类研究(Yoon，1998)。
表1一16SrRNA基因序列相似性与新物种的可能性(徐丽华等，2007)Tablel 16SrDNAsequeneesimilarityandthePossibilityofnewsPeeies16SrDNA序列相似性(%) 可能是新种的比例(%)99 20~3098.5~99 5098~98.5 70~8097~98 9095-97 100新种95 100新属二、每一种生物的DNA均有特定的(G十C)mol%，而且含量稳定，不受菌龄、外界环境的影响，所以在微生物分类鉴定中有着较大的应用价值。
通常认为:种内菌株间相差不超过4%，属内菌株间相差不超过10%，相差低于2%没有分类学意义(Stackebrandi。
ral.，1997)。
(G+C)mol%含量测定主要作用在于否定，即(G+C)mol%含量不同的菌株，肯定不是同一个种，但(G+C)mol%含量相同的放线菌也不一定就是相同或相似的放线菌。
放线菌的分类方法
2012届本科毕业论文（设计）放线菌的分类方法姓名: __ __ __________系别:__ 生命科学学院_____专业：___ 生物工程_________学号：_ _ _指导教师：____ ____ ____2012年5 月9日目录摘要 (1)1 放线菌的分类研究意义与方法 (2)1.1放线菌 (2)2放线菌的分类方法的发展历程与意义 (3)2.1形态学与培养特征上的分类与鉴定 (3)2.2数值分类方法 (3)2.3化学分类 (3)3 放线菌的分子生物学分类的发展情况 (4)3.1.DNA碱基组成分析： (4)3.2.DNA-DNA同源性分析： (4)3.3.DNA-rRNA同源性分析： (4)3.4.核酸的一级结构的分析： (5)3.5.16S rRNA基因序列分析： (5)3.7.PCR-RFLP分析： (5)3.8.rep-PCR指纹分析技术： (5)3.9.RAPD分析： (6)3.10.AFLP指纹分析技术： (6)4放线菌的分类在未来发展的方向及意义 (6)参考文献 (6)致谢................................................................ 错误!未定义书签。
放线菌的分类方法摘要：放线菌是原核生物的一个类群，相关分类学经历了早期的形态学上的经典分类（主要从其形态结构来进行分类），数值分类（运用计算科学与技术对放线菌进行描述分类），化学分类（运用化学分析的方法对放线菌的细胞壁和组成成分进行分析归类），直至今天的分子分类。
通过对放线菌的分类进而建成系统进化树，更加方便了放线菌的研究与应用。
由于科学进步的发展放线菌在分子分类中又有了不同的研究方法，由（G+C）mol%的差别而分析的物种亲缘关系的远近形成的DNA碱基组成分析发展到在DNA杂交中的DNA序列互补程度来推断它们的的DNA-DNA同源性分析，从核酸的一级结构上的分析到RNA的二级结构上的分析等方法。
放线菌新种分类鉴定36页PPT
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
放线菌新种分类鉴定
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！Leabharlann
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14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的
生长情况及可溶性色素。
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C. 生理生化实验
生理生化特性的测定主要包括: pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶 的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑 色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。
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阳性。
如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。 若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。
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c. 淀粉水解
将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时， 在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。
滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色，
或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色， 表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性，说明 产生淀粉酶水解淀粉。
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细胞磷脂的提取
称取1g湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。
加入15ml甲醇。
100℃水浴10 min，自然冷却。 加入10 ml氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀10 min，静止可看到分层。 8000 rpm，离心10 min。 到入分液漏斗静止分层，取下层。 30-40℃旋转蒸干。 分两次各加入200μl氯仿/甲醇（2:1）冲洗器壁。 液体移入EP管（约100-200μl）,8000 rpm，离心10 min，去沉淀。 4℃保存备用。
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a. pH、盐浓度和温度耐受性
pH耐受实验
在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28℃ 培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
温度耐受实验
将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4℃、10 ℃ 、16 ℃ 、20 ℃ 、
28℃、37℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨 酸， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸，L-精氨酸，L(+)-谷氨
酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。
不同氮源按0.5%的浓度加入，培15天后，将各种氮源上的生长状况 与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。
表观特征
2.3 鉴定方法
化学分类
基因型分类
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2.1 分离方法
近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用 于稀有放线菌选择性分离的方法。
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2.2 16SrRNA基因序列测定
放线菌基因组的提取
个，常常作为属的分类鉴定标准之一。
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HPLC实验：
实验条件：1.0ml/min 37°C 柱子：C18反相柱 溶剂：12%甲醇 20mM磷酸三乙胺（pH5.1）
括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。 放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱 和度变化相当大，多为部分饱和，含有7-12个异戊烯 单位。
放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。
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放线菌目中甲基萘醌类型
类型
Eubacteria （异戊烯单位无氢化）
Mycobacterium （主要是8或9个异戊烯 单位上被2或4个氢化） Saccharomonospora （4氢化的多烯萘醌） Streptomyces （具有同一链长，但氢 饱和度不同的萘醌）
糖类型
A B C D E
主要成分
阿拉伯糖，半乳糖 马杜拉糖 无特征性糖 木糖，阿拉伯糖 半乳糖
代表属、种
Nocardia Actinomadura Streptomyces Micromonospora Kutzneria viridogriseum
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全细胞TLC分析实验流程： 全细胞糖分析
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A. G+C%含量分析
DNA 碱基组成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之一， 一般认为 G+C mol%在种内相差不会超过 3%，在属内不会超过 10%。
大量分析结果表明：放线菌属于高 GC 含量的微生物，并且
G+C%变化范围小，最多不会超过 30%。由于 G+C%在不同物 种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分类指征中不可或缺的一
代表属
Sterptomyces Micromonospora Actinomadura Nocardia Actinomyces Oerskovia Agromyces Bifidobacterium Mycoplana
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放线菌全细胞的主要糖类型（Lechevalier，1976）
Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB3型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。
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B. 培养特征
参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述 所采用的标准培养基进行培养特征测定。 所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、 马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28℃培养7，
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2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ3.2 化学分类
A B C D
细胞壁化学组分 磷酸类脂测定 甲基萘醌测定 脂肪酸测定
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A.细胞壁化学组分
放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖 分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的 四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。 Lechevalier等（1976）根据放线菌细胞壁的化学组 分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群
h. 黑色素的产生
将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观 察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。
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i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）
碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖， I-肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。 不加碳源的基础培养基作为阴性对照。
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d. 脲酶的产生
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变 为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存 在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，
培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红 色为阳性。
III IV
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菌体的收集制备
待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏
水洗涤两次，菌体于-80℃冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌 体，冻干菌体4℃干燥器保存备用。 醌的提取及纯化
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D. 脂肪酸测定
放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具 有分类学意义，是一项重要的分类特征。 脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属3种类型： 直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。
萘醌种类
I
II
aMK-7 Bmk-9
aMK-8(H2) bMK-8(H4) cMK-9(H2) dMK-9(H4) aMK-8(H4), MK-9(H4) bMK-9(H4),MK-10(H4) aMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6) bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8) cMK-10(H4),MK-9(H6)
玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1，
2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在， 硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐 都已还原成其他物质，仍按阳性结果处理。
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g. H2S的产生
某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢
气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用 生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。
e. 牛奶凝固与胨化
将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。 若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解
成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。
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f. 硝酸盐还原试验
将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、 3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、
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实验流程：
点样 （距离底边2*2cm，点样10μl，溶剂前沿1cm）
展层 （展层液：第一层： 氯仿:甲醇:水=65:25:4 第二层: 氯仿:甲醇:乙酸:水=80:12:15:4 ）
显色 （6种显色剂）
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C. 甲基萘醌测定
大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包
16SrRNA基因扩增
胶回收 连接 转化 测序研究
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2.3.1 表观特征
A B C
电镜观察 培养特征 生理生化特征
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A. 电镜
取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。 酒精梯度脱水，在30%、50％、70％、80%、100％依次脱 水，其中100％酒精2次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。
磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）