如何解析蛋白质的空间结构？
蛋白质三维结构解析方法
蛋白质三维结构解析方法蛋白质三维结构解析是研究蛋白质以及其功能与途径的重要方法之一。
蛋白质是生物体内最基本的分子之一，它们在生物体内扮演着重要的功能角色，如催化化学反应、传递信号和提供结构支持等。
为了理解蛋白质的功能和机制，科学家们必须了解其三维结构。
本文将介绍常用的蛋白质三维结构解析方法，包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）等。
1. X射线晶体学X射线晶体学是最常用的蛋白质结构解析方法之一。
它利用X射线穿过蛋白质晶体后的衍射图案来确定蛋白质的原子位置。
首先，科学家需要获取蛋白质的晶体。
然后，通过将晶体暴露在X射线的束中，X 射线会通过晶体并在检测器上产生衍射图案。
最后，利用衍射图案进行计算和建模，可以得到蛋白质的高分辨率结构。
X射线晶体学可以解析蛋白质的原子级细节，包括氨基酸残基和键的位置、各种结构域的排列和相互作用等。
2.核磁共振（NMR）核磁共振是另一种常用的蛋白质结构解析方法。
它利用蛋白质中的核自旋对外加磁场和脉冲磁场作出响应的原理来确定蛋白质的结构。
在NMR实验中，蛋白质样品通常以溶液形式存在。
通过对样品施加一个强磁场，并用脉冲序列引发核磁共振，可以得到关于蛋白质构象的信息。
通过收集多组核磁共振信号并进行处理，科学家可以恢复蛋白质的结构信息。
3.电子显微镜（EM）电子显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，可以直接观察蛋白质样品的形状和结构。
与传统光学显微镜不同，电子显微镜使用电子束而不是光束来成像。
对于蛋白质结构解析，电子显微镜通常与冷冻电镜技术结合使用。
在冷冻电镜中，蛋白质样品被快速冷冻在液氮中，以保持其自然结构。
然后，使用电子显微镜将样品成像，并通过多幅图像的拍摄和处理来重建蛋白质的三维结构。
4.结合模型构建和模拟计算除了实验方法外，结合模型构建和模拟计算也是蛋白质三维结构解析的一部分。
通过结合蛋白质样品的化学、物理和生物信息学知识，可以利用计算模型和算法来预测和模拟蛋白质的结构。
蛋白质的结构知识要点总结
1.蛋白质的二级结构
定义:指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,即蛋 白质主链原子的局部空间排布(不涉及侧链原子的位置)。 维持二级结构的化学键:氢键 二级结构的主要类型 ■α-螺旋 ■β-折叠 ■3-转角 ■3-凸起 ■无规则卷曲
(1)α一螺旋 多肽链主链的段(肽段)从 N端到C端形成顺时针方向 的右手螺旋结构。 特征
结枃域指多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠 成的近似球状的紧密结构。
3.蛋白质的三级结构
定义:指球状蛋白的多肽链在二级结构、超二级结构和结 构域等结构层次的基础上,组装而成的完整的结构单元。 换一句话说。三级结构指多肽链上包括主链和侧链在内 的所有原子在三维空间内的分布。 化学健:疏水键和氢键、离子键、范德华力等来维持其空 间结构的相对稳定。
1、每隔3.6个AA残基螺 旋上升一圈,螺距0.54nm
2、螺旋体中所有氨基酸 残基R侧链都伸向外侧链中 的全部>C=0和>N-H几乎都 平行于螺旋轴 3、每个氨基酸残基的 >NH与前面第四个氨基酸残 基的>C=0形成氢键,肽链上 所有的肽键都参与氢键的形 成
（2）β-折叠
β-折叠(β结构或β构象)是一种重复性的结构,可以把它想 象为由折叠的条状纸片侧向并排而成,每条纸片可看成是 一肽链。在这里主链沿纸条形成锯齿状.R-基垂直于折平 面,交替分布于平面的上下。
β-凸起的结构
（5）无规卷曲 无规卷曲指没有一定规律的松散肽链结构。但对一 定的球蛋白而言,特定的区域有特定的卷曲方式,因此,将 其归入二级结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域 里。所以受到人们的重视。
蛋白质的结构知识要点总结
1.蛋白质的二级结构
定义:指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,即蛋 白质主链原子的局部空间排布(不涉及侧链原子的位置)。 维持二级结构的化学键:氢键 二级结构的主要类型 ■α-螺旋 ■β-折叠 ■3-转角 ■3-凸起 ■无规则卷曲
(1)α一螺旋 多肽链主链的段(肽段)从 N端到C端形成顺时针方向 的右手螺旋结构。 特征
一 一级结构是蛩白质最基本的结构。研究一个蛋白质 的结构和功能。首先要测定氨基酸序列。 直接测定蛋白质的氨基酸序列是很困难的, Sanger 通过近10年的工作,于1953年完成了牛胰岛素51个氨基 酸的序列测定。因此而荣获了1958的诺贝尔化学奖。我 国科学家通力合作,于1965年人工合成了有活性的牛胰 岛素。 胰岛素由A、B两条肽链组成。A链由21个氨基酸组 成B链由30个氨基酸组成。A链和B链之间通过两对二硫 键相连另外A链内部6位和l1位上的两个半胱氨酸通过二 硫键相连形成链内小环,下图为牛胰岛素的一级结构。
β-凸起的结构
（5）无规卷曲 无规卷曲指没有一定规律的松散肽链结构。但对一 定的球蛋白而言,特定的区域有特定的卷曲方式,因此,将 其归入二级结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域 里。所以受到人们的重视。
2.超二级结构和结构域
①超二级结构 超二级结构指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此 相互作用。形成有规则的,在空间上能辨认的二级结构组 合体，常见的有ααβ,βαβ,βαβαβ( Rossman折叠),ββ,β曲折和希腊图案拓扑结构等。 ②结构域
二、蛋白质的空间结构
定义：蛋白质的空间结构通常称作蛋白质的构象,或 高级结构,是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布 和肽链的走向。 一个天然蛋白质在一定条件下,往往只有一种或很少 几种构象,这是因为主链上有3是C-N键,不能自由旋转,另 两个可旋转的键所形成的φ角和Ψ角,也受到主链原子空 问位阻的限制。只有一小部分二面角的搭酉是空间位置 所允许的。此外,侧链R基团有大有小,相互间或者相斥, 或者吸引,使多肽链的构象数目受到进一步的限制。研究 蛋白质构象的主要方法有X射线衍射法、核磁共振法等。
举例说明蛋白质一级结构,空间结构与功能的关系
蛋白质是生物体中一种重要的大分子，它由氨基酸残基组成，每一种蛋白质都有独特的氨基酸序列。
蛋白质的一级结构是指蛋白质的氨基酸序列。
空间结构是指蛋白质在空间中的三维构型。
蛋白质的空间结构可以由一级结构演化而来，也可以通过氨基酸残基之间的相互作用产生。
蛋白质的空间结构可以分为多种类型，如线型结构、螺旋型结构、环型结构等。
蛋白质的功能是指蛋白质在生物体中所承担的生物学功能。
蛋白质的功能与其空间结构密切相关，通常来说，蛋白质的功能是由其空间结构所决定的。
例如，激酶蛋白具有活性位点，可以与其它蛋白质结合，起到调节生物体内代谢过程的作用。
因此，蛋白质的空间结构与功能之间存在密切的关系。
举个例子来说明蛋白质一级结构、空间结构与功能之间的关系。
比如，蛋白质酶水解酶是一种蛋白质，它的一级结构是由氨基酸序列组成的。
这种蛋白质的空间结构是一个带螺旋的结构，具有许多活性位点，能够与其它蛋白质结合，起到酶解作用。
所以说，这种蛋白质的功能是酶水解。
另外一个例子是蛋白质抗体。
蛋白质抗体的一级结构是由氨基酸序列
组成的，空间结构是一个线型结构，具有抗原性和抗体性。
所以，蛋白质抗体的功能就是对抗外界的抗原物质。
总结一下，蛋白质的一级结构是由氨基酸序列组成的，空间结构是蛋白质在空间中的三维构型，功能是蛋白质在生物体中所承担的生物学功能。
这三者之间存在密切的联系。
蛋白质空间构象的解析和模拟方法
蛋白质空间构象的解析和模拟方法蛋白质是生命体系中非常重要的一类生物大分子，扮演着各种重要的生物学功能。
蛋白质结构的多样性和复杂性是破解生命之谜的核心之一。
因此，研究蛋白质的二级、三级结构及其空间构象具有非常重要的意义。
现代生物物理学和计算生物学为此提供了多种方法。
本篇文章将讨论蛋白质空间构象的解析和模拟方法。
一、方法简介1. X射线衍射X射线衍射是一种获得蛋白质空间构象信息的传统方法。
它的原理是X射线穿过晶体中的原子，形成衍射。
通过测量这些衍射斑点的强度和位置，可以推导出晶体中原子的位置。
这样就可以确定蛋白质的三维结构。
一般来说，决定蛋白质晶体结构需要获得数千甚至万级别的衍射数据，使用的仪器也是成本昂贵的，需要特定的专业知识和技能。
但是，X射线衍射得到的蛋白质空间结构信息是非常准确的。
2. 核磁共振核磁共振（NMR）是另一种解析蛋白质三维结构的方法。
与X 射线衍射不同的是，NMR不依赖于晶体形态，而是使用标记原子的核磁共振谱图获得信息。
这种方法的优点是需要的蛋白质数量小于X射线衍射，并且不需要结晶。
缺点是其解析度相对较低，对于较大的蛋白质分子往往不能提供有效的解析结构信息。
3. 电子显微学电子显微学也是一种获得蛋白质空间构象信息的方法。
该技术利用高电压电子束照射样本，测量由样本散射电子所形成的衍射图案。
然后通过计算复原出样品的三维电子密度分布。
和X射线衍射类似，这种技术需要高质量的实验数据，因此操作和仪器都比较昂贵。
4. 分子动力学模拟分子动力学模拟是一种计算方法，通过模拟分子中原子的运动方式和相互作用，以预测蛋白质空间构象变化。
基于这种方法，可以进行一系列不同的模拟，如温度变化、水合、离子作用等。
这样可以研究蛋白质分子的动态功能。
分子动力学模拟是一种非常强大的计算方法，但需要大量模拟和计算资源。
5. 量子化学计算量子化学计算是基于量子力学的计算方法，可以模拟原子、分子的结构和相互作用。
在蛋白质研究中，量子化学计算可以用于确定原型蛋白质针对特定蛋白质配体的高精度嵌入信息，并确定氢键和离子相互作用。
蛋白质结构与功能分析
蛋白质结构与功能分析蛋白质是构成生物体的基本组成部分之一，它在维持生物体正常运作中起到了至关重要的作用。
蛋白质的结构与功能密不可分，深入了解蛋白质的结构与功能关系对于揭示生命活动的本质有着重要的意义。
本文将从蛋白质的基本结构、二级结构、三级结构以及功能分析等方面进行探讨。
一、蛋白质的基本结构蛋白质由由氨基酸残基通过肽键连接而成，其基本结构包括多肽链、侧链和背骨。
多肽链由许多氨基酸残基组成，而每个氨基酸残基则由一个氨基组和一个羧基组组成。
侧链是连接在多肽链上的部分，决定了蛋白质的特性和功能。
背骨则由多肽链中的肽键和共价键连接而成，在蛋白质结构中占据重要位置。
二、蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指多肽链上氢键的形成所产生的空间构型。
其中，α-螺旋和β-折叠是最为常见和典型的二级结构形式。
α-螺旋的特点是多肽链成螺旋状，β-折叠则是多肽链形成平行或反平行的折叠。
这两种二级结构形式的存在对蛋白质的稳定性和结构特性起到了重要作用。
三、蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指蛋白质分子中各个区域的空间排布关系。
蛋白质的三级结构由二级结构之间的空间排列和相互作用决定，其中最为重要的驱动力是静电相互作用、氢键相互作用、范德华力和疏水相互作用等。
蛋白质的三级结构决定了蛋白质的稳定性和功能表现。
四、蛋白质的功能分析蛋白质的功能多种多样，包括酶作用、结构作用、激素作用、传递作用等。
其中，酶作用是蛋白质的一项重要功能，蛋白质酶通过催化生物体内的化学反应，促进代谢过程的进行。
结构作用是指一些蛋白质通过空间排布和相互作用，为细胞和组织提供机械支持和稳定性。
激素作用则是指一些蛋白质通过与细胞膜上的受体结合，进而调控细胞内的信号传递和生理反应。
传递作用是指一些蛋白质在细胞内负责传递信息和物质，起到了传递信号的作用。
综上所述，蛋白质的结构与功能紧密相关。
蛋白质的基本结构包括多肽链、侧链和背骨，其二级结构主要表现为α-螺旋和β-折叠，而三级结构则由二级结构的空间排列和相互作用决定。
2蛋白质空间构象与功能的关系
2-2蛋白质空间构象与功能的关系一、蛋白质分子的空间结构蛋白质分子井非如一级结构那样是完全展开的“线状”，而是处于更高级的水平。
天然蛋白质可折叠、盘曲成—定的空间结构(三维结构)。
蛋白质的空间结构指蛋白质分子内各原子围绕某些共价键的旋转而形成的各种空间排布及相互关系，这种空间结构称为构象。
按不同层次，蛋白质的高级结构可分为二，三和四级结构。
1．蛋白质的二级结构多肽链主链中各原子在各局部的空间排布，即多肽链主链构象称为蛋白质的二级结构。
蛋白质二级结构的基本形式：蛋白质的肽链局部盘曲、折叠的主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲等几种形式。
1)α-螺旋：肽链的某段局部盘曲成螺旋形结构，称为α-螺旋。
α-螺旋的特征是：①—般为右手螺旋；②每螺旋圈包含3.6个氨基酸残基，每个残基跨距为0.15nm，螺旋上升1圈的距离(螺距)为3.6×0.15=0.54nm；③螺旋圈之间通过肽键上的>C＝O和-NH-间形成氢键以保持螺旋结构的稳定；④影响α-螺旋形成的主要因素是氨基酸侧链的大小、形状及所带电荷等性质。
2)β-折叠：为—种比较伸展、呈锯齿状的肽链结构。
两段以上的β-折叠结构平行排布并以氢键相连所形成的结构称为β-片层或β-折叠层。
β-片层可分顺向平行(肽链的走向相同，即N、C 端的方向一致)和逆向平行(两肽段走向相反)结构。
3)β-转角：此种结构指多肽链中出现的一种180的转折。
β-转角通常由4个氨基酸残基构成，由第1个残基的>C＝O与第4个残基的-NH-形成氢键，以维持转折结构的稳定。
4)不规则卷曲：此种结构为多肽链中除以上几种比较规则的构象外，多肽链中其余规则性不强的—些区段的构象。
各种蛋白质依其一级结构特点在其多肽链的不同区段可形成不同的二级结构。
如蜘蛛网丝蛋白中有很多α-螺旋及β-折叠层，也有β-转角和不规则卷曲。
二、蛋白质的三级结构多肽链中，各个二级结构的空间排布方式及有关侧链基团之间的相互作用关系，称为蛋白质的三级结构。
蛋白质的二级结构的结构要点
蛋白质的二级结构的结构要点
蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中局部主链的空间结构，主要涉及到肽链骨架原子的空间排布。
其结构要点包括：
1、肽键平面：蛋白质分子中，肽键平面是维持二级结构的主要因素。
肽键平面是由肽键和两个相邻的α-碳原子组成的，它们之间通过共价键相连。
2、骨架原子：蛋白质分子中的骨架原子包括肽键的氮原子和四个α-碳原子。
这些原子在空间中排列成一条直线，形成肽链骨架。
3、氢键：在二级结构中，肽链骨架的各个肽键之间会形成氢键，进一步稳定肽链骨架的构象。
4、折叠：二级结构中的肽链骨架会发生折叠，形成特定的构象。
这些构象包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和Ω环等。
5、水分子的作用：水分子在二级结构中也起到一定的作用。
它们可以与肽链骨架中的极性原子形成氢键，进一步稳定构象。
总之，蛋白质的二级结构是指多肽链主链骨架原子沿一定的轴盘旋或折叠而形成的特定的构象，其结构要点包括肽键平面、骨架原子、氢键、折叠和水分子作用等。
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COOH pr NH2
COOH
pr
NH3 +
+OH +H +
pr
COO
+OH +H + pr
COO
-
+ NH3 pH=pI
NH2 pH>pI
pH<pI
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负 离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零， 此时溶液的pH称为蛋白质的等电点
（二）蛋白质的胶体性质
表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋
白质沉淀。
* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物
可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗
体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体
复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分 离获得抗原蛋白。
（三）电泳
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电
的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种
• 变性蛋白质的性质改变：
① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降 率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶 水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性 改变。
• 变性蛋白质的复性：
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素 后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构 象和功能，称为复性(renaturation) 。
总蛋白质含量测定有两类方法： 1、利用蛋白质的物理性质，如折射率、比重、 紫外吸收等测定。 2、利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯 氏定氮、双缩脲反应、 Folin- 酚试剂法 ( 又名 Lowry法)。 这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定 蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件进 行选择。原理都是利用蛋白质的成色反应或紫 外吸收的性质，通过分光光度法来测定。
脱水作用 酸
+ + + + + +
+ +
碱
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
带正电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
溶液中蛋白质的聚沉
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
* 蛋白质的变性(denaturation)
在某些物理和化学因素作用下，其特定的
空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无
序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生
二、蛋白质纯度的鉴定
• 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法： • （1）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS—PAGE、毛细 管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下 进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳 图谱只呈现一个条带(或峰)。 • （2）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以单 一的沉降速度移动
5. 考马斯亮蓝染色法
• 蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变 化，从而改变这些染料的光吸收。在此基础上，发展蛋白 质染色测定方法。 • 涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚 紫，目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 • 考马斯亮蓝R-250和蛋白质通过范德瓦尔键结合，呈蓝色， 在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的染色符合比尔定律。 2—5min即呈现最大光吸收，至少稳定1h。 • 本方法可允许的测定范围是2—20ug蛋白质。受蛋白质的特 异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质的染色 强度差别不大。
• ② 粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素 粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和， 铺设成平板；
• ③ 凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙 烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋 白质和多核苷酸，后者适于分离核酸， 这两种凝胶电泳的分辨率都很高，
—
-
+
+
双向电泳 (twodimensional electrophoresis)
天然状态， 有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇
尿素、 β-巯基乙醇
非折叠状态，无活性
* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽 链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。
变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉
淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固
1. 凯氏定氮法
• 是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白 质分解出氨，测定氨的含量，除以16%， 就得出蛋白质的含量。
2. 双缩脲法
• 蛋白质在碱性溶液 中，能与Cu2+形 成紫红色络合物， 颜色深浅与蛋白质 浓度成正比，故可 以用来测定蛋白质 的浓度。 • 凡含有双缩脲相似 结构的物质均能参 与反应，常用于需 要快速但并不需要 十分精确的测定。
物活性的丧失。
• 变性的本质 —— 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋 白质的一级结构。 • 造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、 重金属离子及生物碱试剂等 。
• 应用举例
临床医学上，变性因素常被应用来消毒及
灭菌。
此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白
质制剂（如疫苗等）的必要条件。
的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。
（四）蛋白质的紫外吸收
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸
和色氨酸，因此在 280nm 波长处有特征性吸收
峰。蛋白质的 OD280与其浓度呈正比关系，因此
可作蛋白质定量测定。
（五）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction)
蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚
coefficient, S) 表 示 , 沉
降系数与蛋白质的密度和 形状相关 。
蛋白质纯化方法总结：
• 根据蛋白质在溶液中的性质分离 纯化蛋白质的方法： • • • • • ①分子大小； ②溶解度； ③电荷； ④吸附性质； ⑤对配体分子的生物学亲和力等。 透析 离心 沉淀 电泳 层析
§7
蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质含量测定
• 目前实验室多用Folin-酚法测定蛋白质含量。 • 此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器 设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20 倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min 内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足 之处是此反应受多种因素干扰。在测试时应排 除干扰因素或做空白试验消除。
并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质
的目的 。
蛋白质分离常用的层析方法
* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同
进行分离。
• 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用
各蛋白质分子大小不同分离。 • 亲和层析(affinity chromatography) 是利用蛋白 质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学 亲和力（底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可达
100 万之巨，其分子的直径可达 1 ～ 100nm ，为
胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素： • 颗粒表面电荷(电荷层）
• 水化膜
水化膜 + + + +
在等电点的蛋白质 脱水作用
+
+ +
酸 碱
碱 酸
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
带正电荷的蛋白质 脱水作用
如何解析蛋白质的空间结构？
问题的提出：
• 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先 需要得到纯的蛋白质样品。
§6
蛋白质的性质及其分离纯化
一、理化性质
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外， 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH条
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点 ( isoelectric point, pI)
三酮反应。
⒉双缩脲反应(biuret reaction)
蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与 硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双 缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解 程度。
二、蛋白质的分离和纯化
（一）透析及超滤法 * 透析(dialysis)
利用透析袋把大分子蛋白质与
小分子化合物分开的方法。
• （3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度 的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图 谱上呈现出单一的对称峰。 • （4）溶解度分析：
• （5）N—末端分析也用于鉴定纯度，因 为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只 可能有一种氨基酸。
（6）酶的纯度鉴定 • 纯化程度：通常用这一特定成分的含量 (一般用活力单位)与总蛋白量（重量单位） 之比来表示。 • 对酶来说常以每毫克蛋白所含活力单位 数表示，称为酶比活或比活力。纯化工 作一直要进行到这个比活不再增加为止 • 酶活性单位定义为在标准实验条件下催 化产生1mol产物/min所需的酶量。
4. 紫外吸收法
• 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的 苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收 紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。 在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 (A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测 定。
紫外吸收法的优缺点：
• 优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰 测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中 ( 特 别是在柱层析分离中)广泛应用。 • 缺点： • (1) 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色 氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差， • (2) 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的 物质，会出现较大的干扰。
* 超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液
透过有一定截留分子量的超滤膜，
达到浓缩蛋白质溶液的目的。
（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
* 使用丙酮沉淀时，必须在 0 ～ 4℃低温下进行，
丙酮用量一般 10 倍于蛋白质溶液体积。蛋白