药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会
微生物限度和无菌检查法验证
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方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。 根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种 方法联合使用： 溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微 生物的生长无影响。
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乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、 使用量及对微生物的生长无影响。 破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生 物的生长无影响。 萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生 物的生长无影响。 稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍 数。 离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。 应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要 特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以 省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
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选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性 根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的 方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学 特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效 的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或 降低抑菌性的效果进行检验。 无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前 药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。 ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体 供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是 确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用 量。
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方法验证中应注意的问题与评价要求 1、验证试验的完整性 验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验 证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过 程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对 最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年 版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌 性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低 供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时， 既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制 备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组） 。
药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会
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表2中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量
供试品装量V (ml)
≤1 1<V<5 5 ≤ V<20 20 ≤V<50 50 ≤V<100 50 ≤V<100(静脉给药) 100 ≤V ≤ 500 V>500 * 每种培养基各接种10支供试品
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为什么验证?
• 1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本 要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检 查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他 检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结 果的科学性，如鉴别、含量测定。 • 2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多 方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌 检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性 对照、阳性对照等等。
• 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一 个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判 断没有影响。 • 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在 验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的 前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究 提高。 • 供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤 其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
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药物名称 抗栓再造丸 更年安胶囊 清热安宫丸 通宣理肺丸 肝德志胶囊 宁心安神胶囊 防癌胶囊 肠胃舒胶囊 骨络通酒
生产企业 辽宁华鑫药业有限公司 福州金象中药药业有限公司 江西国药药业有限公司 广东阳江制药厂 四川省通阳制药厂 广西南宁万士达制药厂 北京北卫药业有限公司 北京北卫药业有限公司 北京北卫药业有限公司
微生物检验心得体会
微生物检验心得体会微生物检验是一种非常重要的实验室技术，用于检测和鉴定病原微生物。
在过去的几个月里，我有幸参与了一个微生物检验的实习项目，并从中获得了很多有益的经验和启示。
首先，我认识到微生物检验对于疾病的诊断和预防起到了至关重要的作用。
微生物可以引起多种疾病，包括感染性疾病和传染病等。
通过微生物检验，我们可以快速准确地鉴定致病微生物，帮助医生做出正确的诊断并制定合理的治疗方案。
微生物检验也能够对疾病的传播进行监测，及早采取措施控制传染病的传播。
因此，微生物检验对于公共卫生和疾病控制至关重要。
其次，我在实习中学到了许多微生物检验的具体操作技巧。
在进行微生物检验之前，我们需要准备培养基、试剂和设备，确保其质量符合要求。
然后，我们收集样本并进行预处理，例如培养、稀释和分离。
接下来，我们将样品接种于培养基上，并进行相关检测和观察。
从培养基的生长情况、形态特征和生物学性质等方面进行判断和鉴定。
最后，我们根据实验结果，结合临床病情进行综合分析和判断。
通过实际操作，我熟悉了微生物检验的整个流程，并掌握了许多实用的技术。
第三，我学会了如何正确解读和分析微生物检验结果。
微生物检验结果通常以培养物的生长情况、菌落形态和颜色等方式进行展示。
根据这些特征，我们可以初步判断致病微生物的种类。
然后，我们需要进一步进行相关检测和鉴定，例如荧光抗体染色、PCR扩增等技术。
通过这些技术，我们可以准确地鉴定微生物的种类，并确定其致病性和耐药性等特征。
最后，我们需要将检验结果与临床病情相结合，制定合理的治疗方案。
通过这个过程，我提高了对微生物检验结果的解读和分析能力。
第四，我认识到微生物检验的质量控制至关重要。
在进行微生物检验之前，我们需要进行一系列的质量控制措施，确保实验结果的准确性和可靠性。
例如，我们需要定期检查实验室设备和试剂的质量，并进行标准品的校对和验证。
我们还需要制定严格的操作规程，确保操作的一致性和规范性。
此外，我们还需要参与国家和行业的质量评估，以提高实验室的质量水平。
微生物实验心得总结
微生物实验心得总结
微生物实验是一种常见的实验，其目的是观察和研究微生物的生长、繁殖和代谢情况。
以下是微生物实验心得总结：
1. 实验前需要充分了解实验的目的、步骤和注意事项，遵守实验室的安全规定，穿戴好实验服、手套等防护用品。
2. 实验中需要掌握各类微生物的特性和培养方法，根据实验要求选择合适的培养基和条件。
3. 在进行菌落计数、菌液测定等实验中，需要仔细记录实验数据，并对实验结果进行统计分析，以获得更加准确的结论。
4. 实验中不得将微生物带出实验室，更不能随意丢弃培养基和培养物，以避免环境污染和传染病的传播。
5. 实验后需要认真进行消毒和清洗工作，将实验工具和培养皿彻底清洗干净并蒸汽消毒，以确保实验室的安全和卫生。
总之，微生物实验需要进行严格的实验操作、数据分析和安全防护措施，只有这样才能提高实验的成功率和精度，并在保障实验室安全和卫生的前提下推动科学发展。
药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
无菌、微生物限度检查及方法验证
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02
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直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
86 I FOOD INDUSTRY I理论THEORY微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题文 郭焕君河北省清河县食品药品检验检测中心的检查上，要根据药品的成分和特点进行分类检查，如对于无抑菌成分和作用的品种，就可按照常规方法进行验证；而对于有抑菌成分和效果的药品，则要根据其菌株特点进行分类验证。
三、方法验证资料尚未实现资源共享方法验证资料是反映药厂对药品的检测质量以及微生物控制效率的总结性文件。
但在实际的检验和审核工作中，由于方法验证资料的上交和共享中牵扯到了大量的人力、物力以及资金的投入，导致许多检验机构在实际的资料审核过程中，为了降低成本，减少工作任务，而忽视了方法验证资料共享的重要性。
并且，还有一部分药厂为了隐瞒自身的药品质量问题，故意拖延方法验证资料时间，从而导致药品的质检工作存在一定程度的纰漏，药品的微生物限度和无菌检查工作不符合规定。
为此，药品监督管理部门必须重视强化方法验证监督管理，严格要求药厂提供准确、可靠的方法验证数据，实现方法验证数据的实时共享，有效保障药品的安全性。
总结总而言之，药品的无菌检查和微生物限度检查是检验药品安全性和质量的重要工作。
为了能够确保药厂产品的安全性和质量，促使我国医疗事业实现可持续性发展，必须重视方法验证工作的实效性，及时反思与改正，以确保药品微生物限度和无菌检查方法验证工作有序展开。
由于目前的药品类型各不相同，其中有许多药品本身就带有一定的杀菌和抑菌作用，这就导致了在实际的微生物限度和无菌检查时会出现假阴性的检测结果，从而严重影响药品检测的真实性。
因此，为了能够更好地完善我国药品的微生物控制工作，除了要针对药品的特点进行差异化检测外，还应加强检测人员专业素养、优化方法验证形式。
一、检测人员专业能力有待加强在药品的微生物限度和无菌检查工作中，参与检测的工作人员是影响药品检测真实性的决定性因素。
由于这是一项程序较为复杂和烦琐的工作，相关工作人员不但要有一定的微生物专业基础知识，同时还要具备一定的操作技能。
微生物限度个人工作总结
微生物限度个人工作总结一、前言在过去的一年里，我从事微生物限度检测工作，见证了实验室的不断发展与壮大。
在此，我要感谢领导的关怀与支持，感谢同事们的帮助与鼓励。
通过一年的实践锻炼，我不仅积累了工作经验，而且加深了对微生物限度检测知识的理解。
现将个人工作总结如下：二、工作内容1. 微生物限度检测（1）样品接收与处理：认真接收样品，确保样品在运输、储存过程中不受污染。
对样品进行适当的处理，为后续检测做好准备。
（2）微生物培养：根据检测项目，选择合适的培养基和培养条件，对微生物进行培养。
注意观察菌落形态、数量等特征，为鉴别和计数提供依据。
（3）镜检：利用显微镜观察微生物的形态、结构和数量，进一步确认微生物种类。
（4）数据分析：根据实验数据，计算样品中微生物的限量，与国家标准或企业标准进行比对，判断样品是否符合要求。
2. 实验室管理与质量控制（1）实验室环境维护：确保实验室环境卫生，定期进行消毒、清洁。
（2）设备管理：负责微生物检测设备的维护、校准和验收，确保设备正常运行。
（3）标准品和试剂管理：妥善保存标准品和试剂，定期检查有效期、浓度和纯度。
（4）质量控制：参加实验室内部质量控制和外部质量评估，不断提高检测水平。
三、工作收获1. 技能提升：通过实际操作，掌握了微生物限度检测的基本方法和技巧，提高了实验操作能力。
2. 知识拓展：学习了微生物限度检测的相关知识，对微生物的分类、鉴定、培养等方面有了更深入的了解。
3. 团队协作：与同事们共同完成检测任务，提高了团队协作能力和沟通技巧。
四、工作不足与改进1. 自我要求不够严格，对实验结果的准确性有一定的影响。
今后，我要加强自我管理，提高实验准确性。
2. 在时间安排上，有时会出现拖延现象。
今后，我要合理安排时间，提高工作效率。
3. 沟通交流能力有待提高。
今后，我要积极参加培训，提高自己的沟通能力。
五、展望未来在新的一年里，我将继续努力，提高自己的业务水平，为实验室的发展贡献自己的力量。
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为什么验证？
• 5）、验证的必要性（质量控制的新手段）：
不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法 的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上 清丸样品的质量差异。
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表5 七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果 Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations
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药物名称 抗栓再造丸 更年安胶囊 清热安宫丸 通宣理肺丸 肝德志胶囊 宁心安神胶囊 防癌胶囊 肠胃舒胶囊 法 中和法 离心法
验证
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供试品中抗菌活性的去除
• 稀释法——降低供试品的相对浓度 • 薄膜法——利用体积差异分离 • 中和法——利用化学（生物）专属性灭 活 • 离心法——利用沉降系数差异分离
各方法组合运用，效果更佳！
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抗菌活性去除效果的检验
• 应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对 供试品抗菌活性去除效果加以检验（阳性 菌的回收实验），再按药典要求全面验证， 提高效率。
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选择敏感菌株
间接方法——文献、技术资料（可靠） 直接方法——预实验（体外抑菌实验） 参考选择： 一般中药选择枯草和金葡； 一般抗生素根据抗菌谱选择。
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表6 同厂不同批黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果（1：200） Tab 2 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from different batchs in same corporation (1:200)
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为什么验证?
• 1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本 要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检 查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他 检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结 果的科学性，如鉴别、含量测定。 • 2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多 方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌 检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性 对照、阳性对照等等。
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怎么验证？
How?
• 利用供试品与微生物的差异，降低或消 除供试品的影响，通过模拟实验对降低 或消除效果加以检验。
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供试品污染微生物检查
供试品
前处理
稀释 溶解 分散 萃取 离心
• 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一 个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判 断没有影响。 • 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在 验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的 前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究 提高。 • 供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤 其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
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2、方法验证实验的一般原则和程序
• 验证什么？ • 怎么验证？
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验证什么？
What？
• 微生物检验： 某种样品采用某种方法得到一个检查结果。
①供试品影响
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②方法的有效性
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验证什么？
一、方法验证实验的背景及程序
• 1、关于方法验证（背景） • 2、方法验证实验的一般原则和程序
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1、关于方法验证（背景）
《中国药典》2005版 国食监注〔2005〕234号“关于颁布和执行《中国 药典》2005年版有关事宜的通知” 国药典发〔2005〕98号“关于执行《中国药典》 2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关 问题的说明” 中检药〔2006〕862号“第七届全国药品检验所抗 生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方 法及标准研讨会会议纪要”
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方法疑问实例——菌在何处？
• 离心集菌法：500r/min离心5min × × × r/min = × × × g？
表7 10ml菌悬液500r/min离心5min离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果（cfu/mL）
金葡10-6 不离心菌悬液计数 离心管上部菌悬液计数 离心管中部菌悬液计数 离心管下部菌悬液计数 39 25 27 30 大肠10-6 23 23 20 21 铜绿10-6 47 62 40 49 枯草10-5 13 18 15 12 白念10-5 93 黑曲霉10-4 100
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为什么验证?
• 3）、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查 方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每 一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结 果判断没有影响。 • 4）、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性 菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判， 以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌 检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以 及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。
需前处理 样品
What？
①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。
有抑菌作用
去除抑菌作用
③验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对污 染菌生长、检出的影响。
不需前处理
②可以通过验 证实验判断
无抑菌作用
检查
图1 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节
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验证什么？ ——需要验证的重点环节